如何成功申请国家自然科学基金

如何成功申请国家自然科学基金,第一部分基金委面上项目评审基本程序及重要环节,初 审： 由各学科处组织实施。 申请者不具备申请资格或违反有关规定； 手续不完备或申请书不符合要求; 内容不符合资助范围或超出资助能力; 申请者以往资助项目执行不利。,查 重：由基金委信息中心组织实施。 高职申请与承担（含参加）面上、重点、重大 累计不超过3项； 在职研究生不作为限项申请的条件但只可申请 面上项目； 申请者同期只能申请一项，每个项目申请者限 为一人; 高职申请者当年申请及承担的在研面上项目累 计不超过两项; 不具有高职的申请者申请及负责的在研面上项 目不超过一项; 青年基金只能获得一项资助。,同行评议（一审）： 由基金委各学科处组织实施。基本程序： 每份申请书选择同行评议专家（5位）； 函请同行评议：对项目进行定性定量评价； 收回评议卡；对定量部分进行计算机判读、打分、排序； 据学科资助项目数130确定第二轮评审项目。,专家评审组或专业委员会评审（二审）。 主要对一审推荐项目进行评议，筛除 30。 再次对二审会确定资助项目进行审查： 进一步查重； 以往承担项目是否按期完成； 是否有违反基金委有关申请规定。 基金委员会委务会审议。 下发批准、未批准通知。,第二部分 如何撰写国家自然科学基金申请书,一、摘 要（限400字）包括：研究方法、内容、目标、科学意义等,如：“用方法（手段）进行研究，探索/证明问题，对阐明机制 揭示规律有重要意义，为奠定基础提供思路 ”,采用改良的消减杂交技术建立老年性白内障晶状体上皮细胞差异表达基因文库并制备基因芯片，利用此芯片筛选出白内障相关基因。通过基因转染在体和培养的晶状体上皮细胞，观察细胞的形态、增殖和凋亡、骨架蛋白及晶状体蛋白的变化，研究基因的功能。从晶状体上皮细胞的角度阐明老年性白内障发生的分子生物学机制，为防治白内障提供新思路和理论依据。,二、立论依据对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目科学意义 对应用基础研究，着重结合学科前沿，围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题论述其应用前景,在研究领域（疾病防治）层面,从研究方向展开,围绕本项目拟解决的问题进行归纳分析,提出设想,从研究领域（疾病防治）切入,研究意义,立论依据,1、项目的研究意义 存在问题：对科学意义阐述不足或夸大。 撰写方法：从疾病入手，简述其特点、危害，目前主要的治疗方法及其存在的问题。 简要分析该病发病机理和主要研究热点，引出目前存在的主要问题，也就是本项目要解决的问题，以此为切入点提出假设，阐述如果实现预期目标，对该病甚至相关疾病的预防、治疗具有的理论意义和临床价值。,老年性白内障是与年龄相关的疾病，随着年龄的增加，其发病比率也不断升高。特别是人类趋向老龄化，白内障的患病人数还将持续增加。目前，它已是人类第一位的致盲疾病。迄今为止,治疗白内障唯一有效的方法是通过手术摘除混浊的晶状体并植入人工晶状体。虽然手术后患者可以恢复良好的视力，但是不可避免的术后并发症以及手术设备、材料耗资巨大，治疗白内障所花费的资金已成为世界各国包括富裕的发达国家严重的医疗负担。最近的调查表明，如果把老年性白内障的发病时间延缓10年，白内障手术的数量就会减少45%1。所以，一些学者认为通过预防白内障发生或延缓其发展的途径征服白内障已成为一项全球性的社会和社会经济问题2。,但是目前我们对老年性白内障发病机理的认识还不十分清楚。多年以来许多学者的研究结果证实晶状体上皮细胞在老年性白内障发生中起重要的作用，但对其中进一步的基因调控知之甚少。如果从参与老年性白内障晶状体上皮细胞变化的相关基因入手，研究基因的生物学功能，有可能抓住引起白内障发生、发展的主要环节。据此，本研究拟利用改良的消减杂交技术和基因芯片技术准确、全面、快速的特点，以晶状体上皮细胞为研究对象，一次性筛选出老年性白内障全部有差异表达的基因，从中再筛选出与白内障相关基因，并着重对其功能进行研究，从基因水平阐明白内障的发病机制，为防治白内障提供新思路和理论依据。,2、国内外现状分析（综述） 存在问题： 文献复习不够，对国内外现状缺乏真正了解， 提出的问题别人已解决-低水平重复。 对研究方法不熟悉，简单移植或夸大其作用， 缺乏实际应用的可行性-无法实现预期目标。 -已有方法与掌握方法的人的结合； -方法理论上可行与现实可行性的结合。 对国内外现状只是简单罗列，缺乏归纳分析， 缺乏逻辑性和针对性-总结与表达不够。,(,撰写方法：要紧紧围绕本次申请项目的主题。 1、从疾病切入，简要论述国内外研究成果，并引出当前的热点研究方向。 2、从研究方向展开，较详细地分析国内外在本方向的研究进展，引出阐明疾病发病机理或发明新的治疗方法的关键问题所在。 3、围绕关键问题，详细论述国内外以往的研究结果、当前的现状及今后的发展趋势。综合分析后提出目前尚未解决的问题。,4、对拟采用的技术方法进行介绍和分析。 成熟的方法要简要介绍，重点阐明可以应用于本研究的依据。 新方法要详细介绍其原理，并阐明可以应用于本研究的理论依据和实验依据。 要特别注意的问题：必须对项目中所运用的技术方法的原理、流程及在实际应用中可能出现的问题要十分清楚，绝不能是一种简单的移植。 例如：单链抗体+功能基团，理论上可以实现融合，但存在“活性、表达载体选择、纯化”等问题。 5、提出本项目的研究设想。,防治白内障必须针对其发病的主要环节。多年以来，国内外学者从不同的角度探讨白内障的发生机理。就致病的环境因素讲，氧化因子、紫外线辐射、晶状体周围环境中离子浓度改变及一些生长因子、细胞因子的改变均与老年性白内障的发生有关。就研究的部位分，晶状体中皮质与核的蛋白质改变及晶状体纤维的改变与白内障的形成有关，而位于晶状体前囊膜下单层的晶状体上皮细胞在白内障的形成中的变化更引人关注。,因为晶状体上皮细胞是晶状体中唯一有分裂活性、数量相对稳定的细胞，它们分裂、分化出晶状体纤维细胞、产生晶体蛋白，终生不停息，形成了晶状体均一、对称的结构，对维持晶状体的透明起重要作用。不仅如此，晶状体上皮细胞还是晶状体中受外来刺激影响较早的部位，已有研究证实老年性白内障的晶状体上皮细胞还发生退行性变、细胞膜通透性增加、细胞内酶活性改变、细胞数量减少、凋亡细胞增多等改变，与单纯老化的晶状体之间存在差异3-5 。,体外实验也证实多种因素(H2O2、UV-B、晶状体蛋白的自身抗体)诱发的白内障模型中晶状体上皮的损伤是晶状体混浊的主要环节6-8。因此，从晶状体上皮细胞的变化入手探讨白内障的成因，有可能抓住揭示白内障发病机理的主要环节。而晶状体上皮细胞变化的基因调控机制是问题的关键所在，也是有待我们深入研究的问题。,白内障的形成与晶状体的老化密不可分，是晶状体老化的极端表现。晶状体的老化是多种因素相互作用的结果，包括基因的和非基因的随机变化的不断积累，也有程序性的、非随机性的组织特异性多种基因表达的改变。目前，国内外对白内障相关基因的研究主要以下三方面：,一是对体外培养的晶状体白内障模型及上皮细胞的研究。UV-B辐射作用诱导的白内障中晶状体上皮细胞是主要的靶细胞，其Na-K-ATP酶的活性增加，蛋白质的合成和分泌增加；上皮细胞的凋亡增加，其中有c-fos基因的表达增加；还有组蛋白H4、H3 的低表达和蛋白酶C、-肌动蛋白、-肌动蛋白基因的高表达9-12。Carper等13利用RT-PCR-DD(reverse transcription-polymerase chain reaction differential display)技术研究H2O2诱导的晶体上皮细胞的基因差异性表达结果显示NADH脱氢酶4亚基、细胞色素b、谷氨酰胺转移酶基因表达减少以及细胞因子的核蛋白、替代拼接因子2 （alternative splicing factor）、-三羟基异丁酰辅酶A水解酶基因表达的增加。,二是利用转基因动物的研究。波形纤维蛋白基因（vimentin）、杂交的型中间纤维蛋白基因的转基因小鼠表现出白内障，而且有随小鼠年龄增加白内障加重的趋势。晶状体改变的共同特点是晶状体纤维细胞分化受抑制14,15。Gong等16报告晶状体的细胞膜蛋白连接蛋白3（3 Connexin）基因敲除小鼠（knockout mouse）在晶状体形成的早期及纤维细胞分化早期不受影响，其后出现与晶状体蛋白溶解有关的核性白内障。虽然体外实验和白内障转基因小鼠都提示我们一些基因的变化与白内障有关，但是，这些变化的基因是否与老年性白内障形成有关，目前尚缺乏进一步的报告。,三是对人老年性白内障晶体上皮的研究。Lee17利用RT-PCR技术研究显示前极性白内障与核性白内障上皮细胞中纤维连接蛋白、I型胶原纤维、-平滑肌蛋白、TGF-1、TGF-2、TGF-型受体、结缔组织生长因子的基因表达有差异。Kantorow等18利用RT-PCR-DD研究老年性白内障与正常晶状体上皮的基因差异性表达的初步结果是老年性白内障有三个高表达基因和12个低表达的基因。但就DD-PCR技术来讲，在实验中难以解决假阴性、假阳性以及克隆全长cDNA的问题。,上述三方面的研究均取得了不同程度的研究结果，但由于当时技术条件的限制都未能全面阐明与白内障相关的基因及其功能。 寻找白内障时晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差异表达的基因有可能揭示白内障的发病机理。,寻找差异表达基因的经典方法是消减杂交技术（subtractive hybridization, SH），它是，但是实验操作复杂。 经过改进后的抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization ,SSH是Diatchenko等1996年建立的方法）简化了实验操作，但仍然问题很多。 我校生化教研室建立了改良消减杂交技术19，20，其特点是：简便易行，能够获得目的细胞特异表达的全长基因，对低丰度基因也能有效分离。,该方法的建立者已利用这一技术从脂多糖刺激前后的人牙髓细胞的差异表达的基因中克隆到脂多糖刺激后特异表达的基因，其中5个为新基因。同理，利用此方法也能快速、有效地获得白内障晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差异表达的基因，并克隆到全长cDNA，为进一步的结构和功能研究打下基础。,基因芯片技术的出现，使检测差异表达基因和未知DNA分子变得更快捷、准确、高效。基因芯片是在1996年被提出并开始研制的，该技术是将成千上万的DNA探针集中到1厘米见方的基片上，利用碱基互补原理，DNA探针中的已知碱基序列与被测定的未知DNA分子杂交后由标记分子标记杂交体，经自动阅读设备分析杂交结果，从而对检测基因进行定性、定量和结构分析，确定未知DNA分子。,由于目前尚没有针对白内障研究的现成基因芯片，根据本研究的需要，我们将筛选到的差异表达的所有基因建立cDNA文库，再利用基因芯片技术制备成基因芯片，以此检测多个样本中白内障晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差异表达的基因，从中进一步筛选出白内障特异的基因，它们中可能有已知基因，也可能有未知基因。通过以上两种技术的有机结合，我们能更快捷、有效、准确地得到白内障相关基因。,综上所述，分子生物学技术的发展为研究白内障发生过程中的功能基因及特异调控基因提供了有利武器。本项目从晶状体上皮细胞入手，利用改良的消减杂交技术和基因芯片技术系统研究与白内障相关的基因，并采用对体外培养细胞和在体晶状体上皮细胞的基因转染，探讨它们在晶状体上皮细胞变化和白内障形成中的作用，可望阐明白内障晶状体上皮细胞变化的分子生物学机制，为防治白内障提供新的思路和理论依据。,注意事项,注意逻辑性和层次感，并随时点题。 文字表达要精雕细琢，避免假大空。 参考文献必须提供作者全名、出处。 参考文献必须引用02年甚至03年的文献。 要注意参考国内相关专业知名专家的论著。 文献回顾不能回避国内外最新研究进展。,三、研究方案,1、研究目标 存在问题： 目标过大 撰写要求： 有限目标，与研究内容相呼应,如：探索问题，明确关系，揭示规律， 阐明原理（机制），建立方法等,研究目标： 筛选出与老年性白内障相关的基因，明确部分基因在白内障形成中的作用，从晶状体上皮变化的角度阐明白内障的发生机理，为防治白内障提供线索。,2、研究内容： 存在问题：内容过多，一个研究周期难以完成；内容分散，不能集中阐明研究目标。 撰写要求：内容要适当，确保研究周期内完成；与目标相辅相成，为研究目标服务。篇幅要适度，注意与技术路线区别。 确定研究目标、内容的依据：回答一个科学问题； 根据研究周期、资助强度来确定。,研究内容： （1）筛选白内障相关基因：采用改良的消减杂交技术，获得人老年性白内障晶状体上皮细胞和正常晶状体上皮细胞差异表达的基因片段，建立cDNA文库。制备差异表达基因的基因芯片，利用基因芯片技术从多个标本的老年性白内障晶状体上皮细胞中筛选出白内障相关基因。,（2）研究白内障相关基因的结构：对白内障 相关基因cDNA进行特异扩增、PCR产物的克隆、 鉴定，测定基因序列，分析基因的结构，获得全长 基因。 （3）研究白内障相关基因在晶状体上皮细胞 变化中的作用：利用反转录病毒，对培养的人晶状 体上皮细胞和在体小鼠晶状体进行基因转染，观察 白内障相关基因对晶状体上皮细胞的影响以及在白 内障形成中的作用。,观察指标如下：存活细胞数；光镜、透射 电镜下细胞形态的变化；细胞凋亡检测：用原位 末端标记和连接酶介导PCR方法，从形态和DNA 水平分析细胞凋亡；细胞增殖的检测：用免疫组 织化学的方法检测核蛋白Ki-67；细胞骨架蛋白 （Vimentin、Actin）的检测：用Northern杂交 法检测vimentin 、actin mRNA的表达，用SDS- PAGE及Western blot方法检测波形纤维蛋白、肌 动蛋白（均为尿素溶性蛋白）；晶状体蛋白的检 测：用SDS-PAGE方法观察水溶性蛋白、 晶状体蛋白的变化。,3、拟解决的关键问题： 存在问题：未能抓住关键问题或抓得不准。 撰写要求：找出关键问题，写出解决办法。 什么是关键问题 ？ -研究过程中对达预期目标有重要影响的 某些研究内容或因素。 -为达预期目标所必须掌握的关键技术或 研究手段。,拟解决的关键问题： （1）建立差异表达的cDNA文库： 建立差异cDNA文库是筛选老年性白内障相关基因的前提。 为使差异cDNA文库具有代表性，我们采取以下解决方案： 选择各种类型老年性白内障晶状体的前囊膜、取足够 大量的标本（拟取50例标本）作为建库的mRNA的来源。 利用改良的消减杂交技术可快速、有效地获得差异表 达的完整cDNA片段。此技术是本课题组成员主要的研究成果，在应用此项技术中已积累了较丰富的实验经验。,（2）制备基因芯片： 制备用于本研究的芯片是筛选老年性白内障相 关基因的关键环节。制备基因芯片的关键是在 1平 方厘米的基片上放上成百上千的不同基因探针而不 使它们发生任何混淆。在制作基因芯片时做到： 严格按操作程序进行；在标本的处理及RNA提 取时避免污染，否则即会造成严重的损失。只要严 格按操作程序进行操作就可以避免发生差错。,（3）在体基因转染： 在体基因转染是进行白内障相关基因功能研究的关键。 在体的晶状体上皮细胞大部分处在静息状态，只有位于赤道前区的少量细胞具有分裂活性，而且晶状体表面有一层胶原性质的囊膜包裹。在体晶状体的基因转染的关键是如何使大量分裂后细胞转染，如何使病毒穿过晶状体的囊膜，针对以上问题我们拟采取下列方法解决：选用反转录病毒的慢病毒载体（ lentiviral vector ），它克服了一般反转录病毒只能转染有分裂能力细胞的局限性，对分裂后细胞也能有效的转染。这对在体晶状体的基因转染有很大的优越性。采用直径1-2m玻璃微管在显微镜下将病毒载体注入晶状体的前囊膜下，既不破坏晶状体的完整性，又可使病毒接触到囊膜下的上皮细胞。,4、研究方法 存在问题： 过于简单：在实验方案中只有方法名称而无具体步骤。 过于繁杂：大量罗列一些常规的实验方法。 撰写要求：以研究项目的需求为前提，尽量采用目前 最先进的方法和手段，并将其操作步骤和关键环节体 现在技术路线当中。,本课题主要利用改良消减杂交技术和基因 芯片技术筛选老年性白内障晶状体上皮细胞与 正常晶状体上皮细胞有差异表达的基因，分析 其结构，预测其功能，采用基因转染技术探讨 其在晶状体上皮细胞变化、白内障形成中的作 用，从晶状体上皮细胞的角度揭示老年性白内 障发生的分子生物学机制。,5、技术路线 存在问题： 不清楚，不详细。 撰写要求： 清晰、详细、注意逻辑性。 撰写方法：以时间顺序为主线设计技术路线以研究内容为主线设计技术路线分大小标题，突出逻辑关系。详细地写清楚每个具体步骤。,（1）人晶状体上皮细胞的获得：老年性白内障 晶状体上皮细胞取自白内障患者手术中取出的前囊 膜（晶状体上皮细胞紧贴于前囊膜），直径约5mm。 正常晶状体上皮细胞取自角膜移植供体眼的晶状体， 在显微镜下撕下前囊膜，直径约8mm。按文献提供 的方法去除晶状体纤维细胞，仔细清洗以去除血细 胞污染。 （2）建立差异cDNA文库：从50例白内障手术 患者的前囊膜上取下的晶状体上皮细胞作为实验组，从25例正常晶状体前囊膜上取下的晶状体上皮细胞 作为对照组，利用改良的消减杂交技术19，20， 获得差异表达的cDNA，并建立文库。主要的实验流程如下：,正常晶状体上皮细胞 白内障晶状体上皮细胞 Promega PolyATtract System 1000 mRNA分离 mRNA分离oligo-dT18反转录 ntech Cap-finder方法反转录 cDNA Biotin-21-dUTP pending-cDNA 随机引物PCR 杂交 Sephacryl S-400柱,除盐及小片段 链亲和素-生物素磁性分离 除去杂交体及过量正常晶状体上皮细胞cDNA “长距离”PCR 目的cDNA的特异扩增 克隆、鉴定、转化 建立差异基因文库,（3）制备基因芯片筛选白内障相关基因： 基因芯片的制备： 白内障相关基因的筛选：取10例正常晶状体前囊膜上的晶状体上皮细胞为对照组。分次取老年性白内障前囊膜200例，分成20组，每组10例，取上皮细胞。提取上皮细胞中总RNA，分离纯化mRNA。采用RT-PCR技术将其反转录为cDNA并用荧光标记，根据文献报道的方法（Schena M. et al Science 1995,170:467）进行杂交。杂交后用氩离子束激发荧光标志，经阅读器识别、计算机分析，获得杂交的定量结果。统计20次每个cDNA片段的杂交阳性率和强度，确定筛选标准，选出可能与白内障关系密切的基因片段。,(4) 白内障相关基因的结构分析： 序列测定：. . 序列的计算机分析： . . a.基因片段的同源性分析： . . b.氨基酸序列的同源性分析： . . c.基因序列的编码区分析： . . d.局部组成复杂性分析： . . e.蛋白质结构域的分析： . . 获得全长基因： . .,(5) 基因转染： A、培养人晶状体上皮细胞的转染： 存活细胞数：. 细胞凋亡的检测：. 细胞增殖的检测：. 细胞骨架蛋白的检测：. 晶状体蛋白的检测：. B、在体晶状体的转染： 形态学观察：. 取晶体前囊膜，分离其下晶状体纤维，作A中-项检测。通过以上研究，分析白内障相关基因对晶体上皮细胞的作用及与白内障发生的关系。,6、可行性分析 理论分析 研究手段、方法分析 预实验结果分析 所用特殊实验材料（试剂）的分析 对所具备的实验条件进行分析 对项目组成员搭配及其运用技术方法的能力分析,(1)关于建立差异cDNA文库： 老年性白内障晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞是处在不同状态下的细胞，细胞基因表达的改变 是细胞蛋白功能等改变的基础。寻找这些有差异的基 因是探索细胞功能、状态变化原因的突破口。利用的 消减杂交技术是筛选差异表达基因的有效方法。改良 的消减杂交技术是我们研究组成员建立的方法，应用 此方法已经从脂多糖刺激前后的人牙髓细胞的差异表 达的基因中克隆到脂多糖刺激后特异表达的基因，其 中 5个为新基因，这一研究成果进一步证实了该方法 的可操作性，而且我们在运用此方法过程中也积累了 较丰富的经验，因此，本研究利用这一方法从两种状 态的晶状体上皮细胞中筛选差异表达的基因并建立 cDNA文库是可行的。,(2)关于制备基因芯片和筛选白内障相关基因： (3)关于白内障相关基因的结构分析： (4)关于在体基因转染的可行性分析： 综上所述，我们的研究方案从理论到实践都是 可行的，实验中所涉及到的材料和试剂均为商品， 本校生物化学实验室为全军开放实验室、基因研究 所、中心实验室及本实验室具备完成该项研究的实 验条件，预计可以实现本项目的预期目标。,7、创新性 对创新的理解：创新性与先进性是有根本区别的。 原始创新： 填补空白或修改传统的理论； 新技术、新方法的发明创造。 跟踪创新： 在前人工作基础上补充、完善现有理论； 对原有技术、方法进行修改后产生112的 效果。,（1）基因筛选方法上的创新： 首次采用改良的消减杂交技术建立白内障晶状 体上皮细胞差异表达基因文库，并制备相应的基因 芯片，利用此基因芯片筛选老年性白内障相关基因。 这使我们能快速、准确、定性、定量地获得白内障 相关基因。通过分析这些基因的结构、研究它们的 功能，揭示老年性白内障晶状体上皮细胞变化的分 子生物学机制，为防治白内障提供新的思路。 （2）基因功能研究上的创新：.,8、年度研究计划及预期研究结果 年度研究计划： 按年度列出：研究内容及其阶段目标；拟组织 的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等。 预期研究结果： 理论成果：建立/丰富/补充/填补 . 技术方法：建立/完善 . 专 利：可望获得 论 文：国际、国内 人才培养：青年科技骨干、博硕研究生,研究计划及预测进展： 2001.01-2001.12 ： （1）采用改良的消减杂交技术筛选白内障 晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞差异 表达的基因，建立cDNA文库。 （2）制备白内障晶状体上皮细胞差异表达 基因芯片。 2002.01-2002.12 ：. 2003.01-2003.12 : .,预期的研究成果 通过本项目的系统研究，有望阐明老年性白内障晶状体上皮细胞变化的分子生物学机制，从晶状体上皮细胞的角度揭示白内障的发病机理，为白内障防治提供理论依据。 研究成果以论文和科技进步奖提供。预计在国际、国内期刊上发表论文8-10篇。,四、研究基础1、工作基础 存在问题： 内容过简； 与申请项目无关。 撰写要求： 要介绍与申请项目直接相关的研究结果； 提供有关的研究论文、成果及专利等材料； 以往应用与申请项目有关的技术方法的经历。 工作积累也要包括项目组成员的所有信息。,（1）有关消减杂交技术和基因芯片技术的工作基础: 本研究所用的基因筛选技术主要是改良的消减杂 交技术，此技术是我们研究组成员主要参与建立的， 并利用此技术从脂多糖刺激前后的人牙髓细胞的差异 表达的基因中克隆到脂多糖刺激后特异表达的基因， 其中5个为新基因，有关此技术的研究论文有：. （2）有关基因转染方面的研究工作基础：. （3）有关老年性白