鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定

鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定,药学院2010-12-19,实验目的：1 了解鸡蛋清溶菌酶的性质、常用制备方法及原理2 掌握盐析法分离蛋白质原理及操作3 掌握SDS-PAGE鉴定蛋白纯度的原理及操作,1 溶菌酶的性质溶菌酶 (Lysozyme, EC 3.2.1.17) 由英国细菌学家弗莱明 (Fleming)在1922年在人的眼泪、唾液中发现的。广泛存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪液、唾液、血浆、尿、乳汁、其它体液中及白细胞和组织（如肝、肾）细胞内，而且部分植物、微生物中也含有此酶。人溶菌酶的活性是最高的，大约为鸡蛋清溶菌酶酶活力的3倍。但是蛋清中溶菌酶含量最丰富，约为0.3%-0.4%左右，而且蛋清来源广泛，因此多数商品溶菌酶是从蛋清中提取的。,鸡蛋清溶菌酶是动植物中溶菌酶的典型代表，也是目前了解最清楚的溶菌酶之一。白色、无臭结晶粉末，味甜，易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚中。其分子是由 129 个氨基酸残基排列构成的单一肽链，有四对二硫键，分子量为14300。碱性球蛋白，碱性氨基酸残基及芳香族氨基酸如色氨酸残基的比例很高。其等电点为 pH10.7；其最适 pH 值为 pH7 左右，最适温度为50。,不规则的椭圆体，比较容易结晶，结晶形状随结晶条件而异，有菱形八面体、正方形六面体及棒状结晶等。用X射线衍射测得此酶的体积为453030。,性质非常稳定：当 pH 值在1.2-11.3 范围内剧烈变化时，其结构几乎不变。遇热也很稳定，pH 值 4-7、100处理1分钟仍保持原酶活性；pH值 5.5、50加热 4 小时后，酶活不受影响。但是，在碱性条件下，溶菌酶的热稳定性较差，易变性。热变性随着有机溶剂的增加而直线下降。溶菌酶对变性剂相对不敏感。在 6M 盐酸胍溶液中，酶完全变性，但在8M尿素中则不变性。吡啶、十二烷基磺酸钠等对酶有抑制作用，氧化剂能使酶钝化。,2 溶菌酶的应用水解N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰胞壁酸之间-1，4糖苷，破坏革兰氏阳性细菌细胞壁而具有溶菌作用，是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称细胞壁溶解酶（Muramidase）。医疗、食品防腐及生物工程中，特别是在食品防腐方面，以代替化学合成的食品防腐剂，具有较好应用价值。,2.1 食品工业上的应用选择性的分解微生物的细胞壁，而不能作用于其它物质，主要应用于海产品、水产品、乳制品和干酪的保鲜，低度酒、糕点及饮料的防腐，以及水产熟制品及肉类熟制品的防腐保鲜。加入到饮料中，如钙奶、乳酸饮料中, 也可起到防蛀牙、爽口的作用。 为弥补奶粉的不足，可以向其中添加适量溶菌酶，制成母乳化奶粉，可以加强婴幼儿的抗感染能力，可以促进婴儿胃内乳酪蛋白形成细微凝乳，有利于婴儿的消化吸收。特别对早产婴儿，有防止体重减轻、预防消化器官疾病、增进体重等功效。,2.2 酶工程上的应用近年来，溶菌酶已成为基因工程及细胞工程必不可少的工具酶，用以提取菌体内的活性物质如核酸、酶及活性多肽等。,2.3 发酵工业上的应用溶菌酶制备酵母膏，则不仅可以提高浸膏量的收率，还可以大大缩短酵母膏的制备时间。溶菌酶还可用于菌体内含物质的提取。,2.4 医学上的应用溶菌酶制备的口腔药片或漱口液治疗副鼻窦炎、口腔溃疡、扁平苔藓和渗出性中耳炎等疾病。作口服剂可抑制流行性感冒和腺病毒的生长、抗感染及抗炎症，还具有多种药理作用。还具有一定的保健作用；有促进血液凝固和止血作用；有组织再生和瘢痕形成促进作用等。,2.5 科学研究中的应用利用溶菌酶专一性地水解细胞壁的特点, 了解微生物细胞壁的构造，分解细胞壁后制备原生质体，从而用于微生物育种以及微生物分类等学术研究的领域。,3 溶菌酶的生产现状及前景上世纪50年代，国外开始了溶菌酶的工业化生产。采用从鸡蛋清中直接结晶得溶菌酶，产品用来制作口服药剂。上世纪60年代，又开发了离子交换法，进一步降低了生产成本，提高了产品质量，达到了注射级药品质量要求。上世纪70年代，开发了亲和色谱技术，主要用于高纯度生化试剂的生产。近来超滤法与其它方法相结合，进一步提高了溶菌酶的生产工艺水平。,目前美国、加拿大、荷兰、法国、德国、丹麦、意大利、日本等国家均生产溶菌酶，其产量与日俱增。近年来，溶菌酶被用作天然防腐剂，极大的促进了其市场需求，每年以10%的速率增长，现在市场规模约为700吨。,我国的食品工业、精细化工业、医药工业对溶菌酶具有较大的需求。我国于上世纪70年代采用离子交换法生产溶菌酶。目前国内有大连生化、天津东原、烟台金梓等厂家生产，初步满足了国内科研及医药工业的需求。进口溶菌酶，存在着价格较高，进口环节复杂等诸多方面的限制。国产溶菌酶工业刚刚起步，生产规模小，工业水平落后，产品的质量与国际标准差距较大。存在提取率低，处理量小和产品比活低等缺点。,我国是世界上最大的产蛋国家，原料来源丰富，目前鲜蛋基本作为初级食品食用，深加工不足。而发达国家的鲜蛋加工业可以加工鲜蛋总产量的 40%。1kg鸡蛋大约8元，提取出溶菌酶，可以得到3.5g，溶菌酶纯品售价60 元/1g左右。因此，进行溶菌酶的提取工艺研究，有着重大的科学意义和现实意义。,4 溶菌酶的提取工艺蛋清的组成成分蛋清又称蛋白，是一种胶体物质，约占蛋重的 45%60%，颜色为微黄色。鸡蛋清实际分为四层，由外向内的结构是：第一层为外稀薄层，贴附在蛋清膜上，占整个蛋清的 23.3%；第二层为外浓厚层（亦称中层浓厚蛋白层），约 57.2%；第三层为内稀薄层，约占 16.8%；第四层为系带膜状层（亦称内浓厚层），为一薄层，加上与之连为一体的两端系带，约占 2.7%。,水分蛋白质碳水化合物维生素和色素灰分脂质酶,4.1 直接结晶法,优点：操作简单，原料便宜，设备投资小。最早应用于蛋清溶菌酶的工业生产，使产品的成本大大降低，为其医药应用作出了贡献。缺点：（1）生产周期长。（2）由于蛋白质在其等电点不稳定，因此生产过程中溶菌酶易失活。（3）由于存在溶解平衡，而使不少溶菌酶残留于母液。因此不能用以分离微量的溶菌酶。（4）收率低，活性低。（5）处理后的蛋清难以再利用。此点导致溶菌酶成本大幅上升。,4.2 亲和色谱法,优点：分离提纯的倍数较高，得到的溶菌酶纯度高，还能分离纯化经化学修饰而失活的溶菌酶以及具活性的溶菌酶，亦能用于检测酶与底物相结合的氨基酸残基。对于浓缩与精制微量的溶菌酶，区分天然溶菌酶和修饰酶，或探索与底物结合的酶分子氨基酸残基状况等问题，这是很有效的方法。缺点：由于亲和吸附剂的制作较为复杂，成本高，而且操作难度大，限制了它在工业上的大规模利用。,4.3 离子交换法,离子交换法具有简便、高效、成本低且可自动化连续操作的优点，目前大部分溶菌酶生产厂家都采用离子交换法。这种方法在实际应用中收率较高，降低了生产成本。要注意选择合适的离子交换介质。早期有 Amberlite IRC-50 树脂 ，724 树脂。目前采用Doulite C-464、磷酸纤维素（PC）、羧甲基纤维素（CMC）和羧甲基琼脂糖（CMS）等离子交换剂，对溶菌酶都有较强的吸附能力。,4.4 超滤法超滤法的早期应用主要是对溶菌酶的浓缩精制。它利用膜两侧的压力差，使水分、盐类及糖类等小分子透过膜，而溶菌酶等蛋白质大分子物质留在膜内不能透过，从而达到浓缩效果。它的优点是无相变、操作简单、操作费用低、产品不易失活。溶菌酶的分子量仅 14300，而蛋清中其它蛋白质的分子量则在 30000 以上，因此可选择适当的分离膜，以超滤法滤出溶菌酶。而残留的大量蛋清则可直接应用于食品加工。,4.5 反胶团萃取法反胶团的主要应用是萃取蛋白质。目前研究使用最多的是阴离子表面活性剂 AerosolOT(丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠，简称 AOT)。该表面活性剂价廉易得，分子极性头小，有双链，形成反胶团时不必加入助表面活性剂，形成的反胶团极性核大，有利于蛋白质分子的进入。AOT/异辛烷/水体系是最常用的反胶团萃取体系，对于分离溶菌酶这类相对较小的分子来说，具有较好的分离效果。但是对于分子量大于 30000的蛋白质则不易分离。1998 年，反胶团萃取法从蛋清中直接分离溶菌酶。在离心管中将蛋清稀释液与等体积的有机相（AOT/异辛烷）混合，恒温水浴，高速摇动，混合50 分钟后，在 3000rpm 下离心 5 分钟。分离得上层即反胶团萃取液，加入等体积的 pH11.8 磷酸盐缓冲液，震荡 45 分钟，进行反萃取。离心后，收集下层水溶液，分析溶菌酶浓度，测定溶菌酶的酶活力。此法的溶菌酶回收率达 90%，活性达73000u/mg，比大多数商业产品活性高。,5 溶菌酶活力的测定方法典型作用底物是细胞壁粘多糖、甲壳素及糖苷。,溶菌酶的测定方法有两大类：（1）利用酶反应测定酶活性：用对溶菌酶敏感的革兰氏阴性菌（主要是溶壁微球菌）、甲壳素及其衍生物、人工合成的寡聚糖作为底物。本类方法简便、灵敏，但影响溶菌酶活性的因素很多，稳定性差。比浊法 琼脂平板法 比色法 荧光强度及荧光偏振法,（2）非酶学测定法：电泳法使用历史较长，测定的溶菌酶含量包括有活性及失去活性的溶菌酶总量。免疫法技术的发展而产生的。此类方法灵敏度高，为定性也较好。但是这类方法需要制备抗体，实验条件较酶学法复杂，因此大大限制了该类方法的应用。,盐析法1878年Hammarster首次使用，是粗分离蛋白质的重要方法之一。许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶”（Salting in）。 而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不深而自动析出，这种现象称为“盐析“（Salting out）。,Hammarster用硫酸镁成功地将血清蛋白分成为清蛋白、球蛋白两部分。硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等盐析蛋白质，其中运用最广的是硫酸铵。,硫酸铵优点:化学性质稳定；溶解度大，25时能达到4.1mol/L的浓度；溶解度的温度系数变化较小，在030范围内溶解度变化不大，如25时饱和溶解度为4.12mol/L，即767g/L，0时饱和溶解度为3.9mol/L，即676g/L;价廉易得，分段效果比其他盐好，性质温和，即使浓度很高时也不会影响蛋白质的生物学活性。,实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为100%或1。盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或1饱和度的百分之几，即称为为该蛋白盐析的饱和度。,饱和硫酸铵溶液法 在蛋白质溶液的总体不大，要求达到饱和度在50%以下时，可选用此方法。在已知盐析出某各蛋白质成分所要过到饱和度时，可按下列公式计算出应加入饱和硫酸铵溶液的数量：V0蛋白质溶液的原始体积；C2所要达到硫酸铵饱和度； C1原来溶液的硫酸铵饱和度； V应加入饱和硫酸铵溶液的体积。,固体硫酸铵法 所需达到的饱和度较高，而蛋白质溶液的体积又不能再过分增大时，采用直接加入固体硫酸铵的方法。欲达到某到饱和度可按下列公式计算出应加入固体硫酸铵的数量： X是将1L饱和度为C1溶液提高到饱和度为C2时，需要加入固体硫酸铵的重量（g）。G和A为常数，数值与温度有关。现在已将达到各种饱和度所需固体硫酸铵的数量列成表，使用时不需计算可直接从表中查出。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法:常用蛋白质纯度分析及分子量测定技术。SDS:十二烷基硫酸钠（Sodium declecyl Sulfate）破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的共价键，使蛋白质变性而改变原来的空间构象，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在的条件下，由于蛋白质分子内的二硫键被还原剂打开并不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS结合从而形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。,不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样（约为18，即1.8nm），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这样的SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。使蛋白质的电泳迁移率仅仅取决于分子大小这一因素。,当蛋白质的分子量在11，700165，000之间时，电泳迁移率与分子量对数呈直线关系，符合直线方程式：LgMw= bx + k式中：Mw为蛋白质分子量，X为电泳迁移率，k和b均为常数。利用这一关系将已知分子量的标准蛋白质电泳迁移率与分子量的对数作图即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：以聚丙烯酰胺凝胶作为支持电泳介质。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N甲叉双丙烯酰胺聚合而成。在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度交链结构，其孔隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的孔隙度，又有比较好的机械性质。一 般说来，含丙烯酰胺7-7.5%的凝胶，机械性能适用于分离分子量范围1万至100万物质，1万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺15-30%的凝胶，而分子量特别大的可采用含丙烯酰胺4%的凝胶。,连续体系；不连续体系 前者指整个电泳系统中所用缓冲液，pH值和凝胶网孔都是相同的，后者是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓 冲液，pH值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力。 最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornstein (1964) 和Davis(1964) 设计的, 样品和浓缩胶中含 Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH 8.3), 分离胶中含Tris-HCl(pH 8.8)。系统中所有组分都含有0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970)。,凝胶的筛分特性取决于它的孔径，孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。 515% SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围,实验步骤1.蛋清准备取1枚鲜鸡蛋，洗净擦干，在小头用镊子轻轻捣一直径为4mm的小孔，下用烧杯或量筒接好，再在大头打一细小针孔进气，此时蛋清缓缓自动流出。取蛋清的操作应很细致，避免蛋黄破裂混入蛋清而影响实验结果。将所得鸡蛋清充分打匀（约15分钟）。打时力戒过猛以防止产生泡沫变性作用。然后用4层纱布滤去杂质，测量体积（或体重），记录pH值。,2 热变性取稀盐酸调节鸡蛋清pH值 5.5左右（4-7）、70处理15分钟。离心，去沉淀，保留上清。3 分步盐析取适量上清，先用1N的氢氧化钠后用0.1N NaOH溶液调至pH 8.08.5，加适量饱和硫酸铵溶液（pH 8.0）至饱和度为10%。冰浴放置30min。离心，弃上清。（比例：800ul到eppendorf管中，加入88.9ul饱和硫酸铵）。,4 样品处理取适量沉淀到干净的eppendorf管内，加200ul ddH2O溶解沉淀。加入20ulTCA，颠倒三次，13000rpm离心10min。弃上清。Eppendorf管中加入200ul 丙酮，颠倒三次，13000rpm离心10min。弃上清。待管内残留丙酮挥发干净，加入适量loading buffer及ddH2O，沸水浴处理15min，待电泳鉴定。,5 电泳鉴定上述样品用浓度12%的SDS-PAGE分析。注意加入标准对照。6 结果观察染色，脱色，观察实验结果。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳操作：1实验材料和试剂（1）丙烯酰胺和N, N-亚甲双丙烯酰胺。以温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去离子水配制含有29%（w/v）丙烯酰胺和1%（w/v）N, N-亚甲双丙烯酰胺的贮存液，丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反应是光催化或碱催化的，故应核实溶液的pH值不超过7.0。这一溶液置棕色瓶中贮存于室温，每隔几个月须重新配制。（2）十二烷基硫酸钠（SDS）。SDS可用去离子水配成10%（w/v）贮存液保存于室温。（3）用于制备分离胶和积层胶的Tris缓冲液。,（4）TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺)。TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。（5）过硫酸铵。 过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。须新鲜配制。（6）1.5M Tris，pH8.8（分离胶缓冲液）（7）1M Tris，pH6.8（浓缩胶缓冲液）（8）Tris-甘氨酸电泳缓冲液。25mM Tris，250mM 甘氨酸 (pH 8.3)，0.1% SDS，（9）样品处理液，50mM Tris-HCl(pH 6.8)，100mM DTT(or 5% 巯基乙醇)，2% SDS，0.1% 溴酚蓝，10%甘油（10）染色液：0.1% 考马斯亮蓝 R250，40% 甲醇，10% 冰醋酸（11）脱色液：10% 甲醇，10% 冰醋酸,实验步骤1. 配制SDS聚丙烯酰胺凝胶所需的各种试剂2SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制 根据厂家说明书安装玻璃板。 确定所需凝胶溶液体积，按下表给出的数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。, 迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液,留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)。再在胶液面上小心注入一层水（约23mm高），以阻止氧气进入凝胶溶液。 分离胶聚合完全后（约30分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。 制备浓缩胶：按下表给出的数据，在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液，一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应