HIV核酸检测技术及应用

HIV核酸检测技术及应用,目 录,HIV核酸简介HIV核酸检测意义HIV核酸检测技术现状与发展HIV核酸检测质量控制HIV核酸检测流程（新规范）HIV核酸检测实例应用,HIV病毒,病毒颗粒：呈球形，直径100-120nm 病毒衣壳：呈20面体立体对称 病毒核心：由RNA（两条ssRNA）、核衣壳蛋白、逆转录酶、核糖核酸酶及整合酶所组成,HIV RNA,HIV生活周期图,HIV前病毒DNA,HIV感染的自然史,HIV感染后标志物变化时间,HIV核酸检测的意义,HIV核酸,缩短窗口期,指导治疗,自然史,艾滋病的“元凶”,病程,耐药性,HIV核酸检测的意义,HIV-1感染诊断婴儿感染早期诊断（小于18月龄）HIV-1感染补充试验及急性期和晚期感染者的诊断治疗效果监测 通常在治疗一个月后病毒载量降低0.5log以上才被认为临床治疗有效，六个月后应降到小于检测限病程监控及预测耐药性监测,HIV核酸检测技术,分为HIV定性和HIV定量检测两大类：HIV定性检测：HIV核酸（RNA和前病毒DNA）的检测HIV定量检测：又称HIV病毒载量检测（Viral load），主要用于抗病毒治疗患者的疗效评价，也可用于补充试验（新规范）,HIV核酸定性检测,IN-HOUSE（文献报道）Roche Amplicor HIV-1 DNA PCR, v1.5试剂盒(已停产)Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Qualitative Test,v2.0雅培RealTime HIV-1定性检测试剂盒HIV病毒储存库的检测技术（超敏PCR）,In-house普通PCR诊断方法,核酸提取,PCR或RT-PCR扩增,电泳鉴定或测序,HIV-1的基因组结构,结构蛋白,酶类,衣壳蛋白,9.2kb,检测设计：分别针对HIV gag、env和pol的三个独立PCR检测体系，并另外设立1个检测内参（-actin）的检测体系（国家艾滋病参比实验室）阳性：扩增出人-actin，HIV-1 gag 、env和pol基因中扩增出2个及以上基因片段阴性：扩增出人球蛋白基因，HIV-1 gag 、env和pol 3个基因都没有扩增出来不确定：人球蛋白基因未扩增出预期的片段或HIV-1 gag 、env和pol 3个基因只扩增出一个,In-house普通PCR诊断方法,“套式”PCR,优点: 增加敏感性/特异性缺点: 增加扩增偏差机会 需要增加操作过程 容易增加污染机会,琼脂糖凝胶电泳,-actin,gag,env,pol,In-house 荧光PCR,国内外文献报道以HIV RNA或前病毒DNA作为检测目标，选择LTR、gag、pol等基因作为靶基因，建立荧光PCR检测方法,HIV核酸阴性,HIV核酸阳性,罗氏HIV-1 Qual Test,基于COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan 48平台，用于HIV-1 RNA和前病毒DNA的定性诊断，检测样本类型包括抗凝全血、血浆、血清、干血斑或干浆斑等,The COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Qualitative Test, v2.0Dual-PCR target Assay design,gag:Targeted in previous Roche HIV-1 tests Large sequence database from Roches Global surveillance programNot a drug target today,LTR:Targeted in Roche MPx blood screening testNot a drug target today,检测总核酸（DNA/RNA）,检测结果示例,阴性,阳性,HIV核酸定量检测,HIV病毒载量(Viral Load)指体内复制的病毒的数量，反映体液（一般是血浆）中HIV病毒的含量1987年John首次提出病毒载量（viral load）的概念，体内复制的病毒的数量是不能直接测量的，一般用血浆中HIV RNA的拷贝数代表HIV的病毒载量。 是HIV核酸的定量检测，一般以血浆HIV RNA的拷贝数/ml表示,常用的HIV病毒载量检测方法,主要核酸扩增和信号放大扩增两种方法NASBA/Easy Q (Biomerieux,生物梅里埃)Cobas Amplicor/Taqman (Roche，罗氏)m2000(Abbott，雅培)bDNA/Versant 440 (西门子)国内：凯杰（匹基），科华，达安、东北制药、万泰 丽珠、科华等,NucliSENS EasyQ,血浆样本,miniMAG,easyMAG,病毒载量分析仪,引物 2,NASBA扩增技术（nucleic acid sequence-based amplification,核酸序列依赖性扩增法）,逆转录酶,逆转录酶,T7 RNA聚合酶,逆相 RNA 扩增物,RNase H引物 1,引物1 延伸,RNase H 和引物 2延伸,RNA,T7 RNA 聚合酶,逆转录酶,逆转录酶,“分子信标” 杂交,AMV-RT (鸟肉瘤病毒逆转录酶):延伸形成RNA-DNA 杂交链 RNase H:降解杂交链中的RNAT7-RNA聚合:转录形成的RNA转录产物,T7启动子序列,COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan48,COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan48 系统,完整探针: 报告基团 (R) 的荧光被淬灭基团(Q)抑制,h,引物,引物,探针被5-外切核酸酶切掉,报告基团的荧光发射,h,R = 报告基团 Q = 淬灭基团,TaqMan水解探针技术,雅培HIV-1病毒载量仪,m2000全自动实时荧光定量PCR系统HIV-1病毒载量自动化检测平台（96通量）已认证用于干血斑病毒载量检测婴儿HIV-1核酸检测试剂盒用于实验室in-house方法的自动化核酸提取此平台同时有HBV病毒载量，HCV病毒载量及分型，HPV高危分型，MTB检测，CT/NG检测等试剂盒,bDNA (Bayer versantTM),核酸信号的放大！而非核酸分子的扩增！,人工加样试剂分装,自动化提取,人工配液PCR仪检测,临床式半自动使用方案,北京万泰生物药业股份有限公司,PCR仪结果导入,WanTag 全自动核酸提取仪,PCR检测,HIV核酸定量检测试剂-全自动化平台,强强联合整合Tecan加样与Thermo核酸提取平台高通量 同时可用，实现1h内96份样本的提取 高自动化可自动完成包括加样、核酸提取与纯化、PCR试剂配制与分配等扩增前的所有操作采磁棒转移技术，有效避免气溶胶污染中文自主操作界面，方便快捷,达安基因HIV病毒载量核酸检测系统,国产化！全自动！,PANTHER系统TMA（转录介导的等温扩增）,简易的工作流程：“上样”直接到“结果”，3.5小时得到第一个样本结果，每分钟一个结果，12个小时500个样本,核酸检测在新版规范主要内容,新增补充试验的概念，补充试验包括抗体确证试验和核酸试验（定性和定量试验）新增核酸检测流程，对复检结果有反应的情况，增加了可以选择核酸诊断的策略；对于HIV抗体确证结果不确定和疑似急性期感染的样品建议采用HIV-1 核酸试验。修改了艾滋病感染产妇所生儿童HIV感染早期感染检测流程,补充试验（核酸试验）,初筛+复检+,HIV定性检测试剂盒,试剂：必须是经国家食品药品监督管理总局注册批准、在有效期内的试剂。严格按说明书操作。全球目前正式用于临床诊断HIV-1 急性期感染的核酸检测试剂比较少Gen-Probe 公司生产的Aptima HIV-1 RNA 核酸定性试剂盒Abbott公司生产的M2000 HIV-1 RNA/DNA 定性检测试剂盒Roche公司生产的COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Qualitative Test,v2.0,HIV核酸定性检测 适应范围,（1）诊断婴儿早期感染（2）诊断急性HIV-1感染。针对对HIV-1抗体筛查阴性、近期有流行病学史的个体,或确证结果不确定的样本,核酸定性检测可用于诊断HIV-1急性期感染。（3）确定艾滋病病毒感染。针对HIV-1抗体筛查阳性或确证结果不确定的个体，结合流行病学史和临床病史，核酸定性检测可用于HIV-1感染诊断。艾滋病晚期患者可能出现HIV抗体反应不确定，可根据HIV核酸定性检测结果，结合临床病史和CD4+T淋巴细胞计数等情况，进行综合判断，确定临床诊断。,结果判读与报告,检测结果显示“有反应”或“检测到”，报告“HIV-1核酸阳性” ；检测结果显示“无反应”或“未检测到”，报告“HIV-1核酸阴性”。核酸定性检测值低于最低检测限的结果，不能排除HIV-1感染，需根据流行病学史、临床病史和实验室相关指标进行综合判断。目前国内外没有商品化的HIV-2核酸检测试剂,HIV定量检测的试剂盒,试剂：必须是经国家食品药品监督管理总局注册批准、在有效期内的试剂。严格按说明书操作。NASBA/Easy Q (Biomerieux,生物梅里埃)Cobas Amplicor/Taqman (Roche，罗氏)m2000(Abbott，雅培)bDNA/Versant 440 (西门子)国内：凯杰（匹基），科华，达安、东北制药、万泰 丽珠、科华等,HIV核酸定量检测 适用范围,（1）监测抗病毒药物治疗效果。抗病毒药物治疗前后，定期病毒载量分析和监测，结合CD4+T淋巴细胞计数，有助于抗病毒药物治疗方案的确定和修改。（2）监测疾病进展。定期检测HIV-1病毒载量，有助于监测感染者和病人的病程变化，结合CD4+T淋巴细胞计数，为抗病毒药物治疗提供病毒学依据。（3）诊断急性HIV-1感染。针对HIV-1抗体筛查阴性、近期有流行病学史的个体，或确证结果不确定，核酸定量检测可用于诊断HIV-1急性期感染。（4）确定HIV-1感染。针对HIV-1抗体筛查阳性或确证结果不确定的个体，结合流行病、和临床病史和CD4+T淋巴细胞计数等，使用核酸定量检测帮助确定HIV-1感染。,结果判读与报告,用于治疗效果和病程监测：检测值小于试剂盒线性范围下限，报告低于检测限，检测值大于等于试剂盒线性范围下限，按照检测值报告。 用于HIV-1感染的诊断：检测值5000 CPs/ml(或IUs/ml)，报告检测值；检测值5000 CPs/ml(或IUs/ml)，尽快再次严格按核酸检测的要求采样检测，报告检测值，结果5000 CPs/ml(或IUs/ml)，报告检测值，结果仍5000 CPs/ml，则需充分结合流行病学史、临床病史、CD4+T淋巴细胞计数和HIV-1抗体随访检测结果等进行综合判断检测值低于最低检测限不能排除HIV-1感染。 （注：目前国内外没有商品化的HIV-2核酸检测试剂；由于核酸定量检测方法获得的低病毒检测值可能是核酸污染所致的结果，根据国内外的相关数据和报道，建议用5000 CPs/ml作为判断结果的阈值，两次定量检测有助于准确判断结果）。,集合核酸定性检测 （Pooling PCR）,对高危人群抗体检测阴性的样品进行集合核酸检测，可及时发现窗口期HIV-1 感染者；用于血液筛查可进一步降低“残余危险度”该方法较单份样品的核酸检测具有更高的成本效益。,集合PCR,HIV 核酸即时检测( POCT),HIV 核酸即时检测是在发病或者发生事件的地点进行检测，能快速获得检测结果并及时反馈一线医务人员的一类检测方法。POCT 检测适用范围广泛，且可避免样本长途运输导致的质量下降，非专业人员经培训后也可操作。可用于HIV-1 感染、儿童早期HIV 感染的辅助诊断、疾病监控及抗病毒药物疗效评价。,HIV病毒载量的即时检测1,HIV病毒载量的即时检测2,质量保证和质量控制,实验室分区和环境,HIV-1 病毒载量检测实验室原则上应分为三个独立工作区：试剂准备区、样品处理区、扩增产物分析区，并设在不同房间。严格要求三区的空气流向：从试剂准备区到样品处理区，然后到扩增产物分析区，不能逆向流动。,仪器设备质量控制,加样器、温湿度计须经计量部门校准，每年一次；冰箱、水浴箱用校准合格的温度计测量温度，并做好记录。要定期对HIV-1 病毒载量检测仪、实时荧光PCR 仪等仪器进行维护保养。,检测过程质量控制,试剂盒有效并经国家食品药品监督管理总局注册，使用无DNA和RNA酶的水；严格执行仪器和试剂的SOP，不得擅自修改。HIV-1 核酸定性检测每次实验建议加阳性对照、阴性对照和试剂对照。定量检测每次实验使用试剂盒提供的内部质控品（内标），并满足内部质控品的要求；建议使用一个HIV-1 RNA 为500015000 cps /毫升的外部质控品。,外部质量控制,PT样品组成：每次5份，包括阴性、不同拷贝数的阳性样品。PT频率：一年2次。PT样品的接收与保存：接受考核样品后填写接收专用单，-70度以下保存。PT样品的检测：要求将考核样品同实验室常规样品一起检测，由常规检测人员进行。PT结果的报告和处理：在规定的时间内上报实验结果。PT评分原则 将参与实验室反馈结果换算成对数值（Lg），再按同一种方法与同一个考核品的的所有实验室结果进行统计，算出平均值（M）和标准偏差（S）。,成绩判定,根据每个参与考核实验室一年两次所有考核品的结果进行综合评分（每一个考核品的评判标准依照A与B条款），判定标准为： 优秀：所有考核品没有问题； 良好：有一个考核品满足A中的条款； 合格：两个考核品满足B中的条款 不合格：至少有三个考核品满足A中的条款或至少一个考核品出现B中的条款。A条款：样品结果在M+2.0S M+3.0S内；样品结果在M-2.0S M-3.0S内；考核结果报告没及时上报；没按要求上报原始记录。B条款：样品结果超过M+3.0S；样品结果M-3.0S；假阳性；假阴性；无效结果。,应用实例1窗口期病例,某年某月某疾控送检一份HIV筛查阳性标本（MSM）。ELISA阳性，硒标阳性WB确证gp160,p24。两周后随访， ELISA阳性，硒标阳性， WB确证gp160,p24。病毒载量51000 cp/ml。一月后再抽血复检，ELISA阳性，硒标阳性， WB确证gp160,gp120,p66,p51,gp41,p31,p24,p17。HI病毒载量120000cp/ml。,应用实例2晚期AIDS病人样本,某年某月，某医院送检一份疑似HIV感染的样本，有机会感染的住院病人。第一次检测ELISA阴性，报HIV抗体阴性。临床医师要求确证试验，第二次检测，ELISA和硒标均为阴性，WB：gp160,p66, p51 ，不确定。病毒载量7500 IU/ml。CD4:9个/l一个月后复检ELISA和硒标仍为阴性， WB：p24, p51,p66，病毒载量164000 IU/ml。有艾滋病的临床表现，结合临床表现最终临床诊断为艾滋病。进行抗病毒治疗一月内此病人已死亡,应用实例3婴幼儿早期诊断,某婴儿2012年8月出生，双亲均为HIV感染者，孕3月行母婴阻断44天第一次核酸检测为阳性177天第二次核酸检测为阳性出具”婴儿HIV感染早期诊断检测结果阳性”,应用实例4抗体假阳性病例,某病例未经过抗病毒治疗，硒标阳性（某国产金标为阴性），酶联阳性(BIO-RAD S/CO=11.8)，WB条带（gp160,gp120）,病毒载量检测TND1个月随访后硒标阳性，硒标、酶联阳性，WB条带（gp160,gp120）,病毒载量检测TND,应用实例5抗病毒治疗病例,某病例抗病毒治疗史不详，硒标阳性（某国产金标为阴性），酶联阳性(BIO-RAD S/CO=11.8)，WB条带（gp160,gp120）,病毒载量检测TND抗体的假阳性 VS 抗体的真阳性？,HIV核酸检测用于诊断的局限性1,若检测目标是HIV 的RNA核酸容易受抗病毒药物的影响而检测不到接受抗病毒治疗，HIV抗体确证实验不确定的样本面临诊断的困境,复制后的大量新病毒释放到血液中,HIV病毒储藏库存在方式,59,环状,线性,整合型,病毒DNA有三种存在方式,储藏库病毒处于静止状态; 细胞内整合的HIV-1 DNA; 细胞活化后能够释放病毒,CD45RO+/CD25-/CD69-/HLA-DR-,HIV“治愈”定义,完全治愈：体内完全清除可复制的病毒Asterilizing cure would involve total elimination of all replication-competent HIV from the body.功能性治愈：病毒未完全清除，不治疗、不复制、不进展Functional cure, the virus may not have been completely eliminated but no HIV replication is detectable and individuals experience no disease progression in the absence of antiretroviral treatment.缓解： 不治疗、病毒低水平(50 copies/mL)Remission, the latest definition to enter the HIV cure dialog, refers to control of HIV viral load at low levels (such as below 50 copies/mL) in the absence of treatment.,相关研究（内外）：Mississippi Child,2013 CROI (March 3-6, 2013)诊断：2个独立HIV检测第30小时核酸定性检测（阳性 ）第31小时载量检测（20,000拷贝/ml）,功能性治愈Mississippi Child,疗效 EfficacyHIV RNA LDL (within 1m HIV RNA LDL 18、23-26 mHIV DNA fragments (+)HIV-specific antibodies(-),功能性治愈Mississippi Child,密西西比儿童：2014 CROI 41月龄，停药22月以后，依然维持功能性治愈,VL LDL (LDL=20 c/ml ，停药23个月)HIV RNA 1 c/ml (停药22个月)No replication-competent resting CD4 cell latent reservoir virusproviral DNA + (22个月),Very early treatment forms a barrier to the formation of HIV reservoirs in perinatal