【毕业学位论文】（Word原稿）甘蓝(Brassica oleracea var. capitata)显性雄性不育基因分子标记辅助育种研究蔬菜学硕士论文

密级 论文编号 : 中国农业科学院 学位论文 甘蓝 (性雄性不育基因分子标记辅助育种研究 of a of a I 摘要 甘蓝 (一种重要的十字花科芸薹属 蔬菜作物，在对甘蓝显性雄性不育的研究和利用方面已取得重要进展的基础上，为了进一步加快该不育性的应用，本论文从分子标记辅助育种的角度对该不育基因进行系统的研究。 采用 记技术，通过对 03A 和 03B 两套甘蓝显性雄性不育近等基因系材料的筛选，各获得了 5 个能够鉴别显性雄性不育纯合基因的标记。这些 记均与显性 因相斥相形式连锁，可通过检测这些标记的缺失来鉴定纯合显性雄性不育基因型（ 其中标记 同时用于 03A 和 03B 两种材料显性雄性不育纯合基因的鉴定，结合使用基因组 行的 方法成功地将其转化为生产中可直接利用的 记，在对 25 个单株的鉴定中，该标记的预测效率为96%。研究还以 64 份不同的甘蓝品种对从 03B 近等基因系中筛选出的 5 个纯合不育标记进行了应用范围的检测，确定了可在各种不同类型材料中应用的纯合不育标记。 通过对甘蓝一回交 8 代群体中 95 个单株的分析，筛选获得了 11 个与甘蓝显性雄性不育基因（ 锁的 记，分别为 过 件的分析，这些标记均位于不育基因的同侧， 不育基因的距离最近，相距仅 1（ 不育基因在图中最远，为 21 连锁图标记间的最大图距为 7（ 小图距 1（ 均图距 在寻找验证与雄性不育基因相连锁的标记并进行作图的同时，获得了一个有 6 个标记，不与显性雄性不育基因连锁的连锁群，跨越 9 甘蓝回交转育的过程中，转育回交各代均经人工选择，在回交 8 代后的高代回交群体中，通过分子标记技术，在 检测到 30 图距中即有 9 说明常规选择过程中，即便是高世代回交也无法完全避免遗传滞留现象。同时也表明，借助分子标记手段进行背景选择，可以较早地踢除供体材料的滞留片段，加快育种材料的纯化过程，缩短育种年限，节省大量的人力、物力和财力，提高育种的效率。 关键词 ：甘蓝 (显性雄性不育，纯合基因型， 记辅助选择 is a to of is of A a in a 9As s in of to of to in of of of in is to to in 03A 3B. of of we to 5 be be to by as of in to s is in 3A 3B CR a be is in As a 9 IL 5 6%. In 4 by 3B to of to of a C8 5 In 11 12 s cM s 1 cM （ （ we a to in by in C8 at is in an ey 录 摘要 I 录 表目录 论文表格目录索引 论文图片目录索引 言 1 1 甘蓝类作物雄性不育的研究 1 2 分子标记工具 3 记 技术 4 记技术 5 记技术 5 记技术 6 记技术 6 记技术 7 记技术 7 记的基本原理 7 技术流程 8 技术特点 9 它新型标记技术 9 种常见 纹图谱技术的比较 10 3 标记筛选方法 10 图法 10 等基因系法 ( 11 离群体分群分析方法 11 择性基因型分析 11 4 分子标记在甘蓝类作物研究中的应用 12 子标记在甘蓝遗传资源与遗传多态性研究中的应用 12 甘蓝遗传资源方面的研究 12 作物遗传多态性方面的研究 13 蓝类作物分子标记图谱的构建 13 蓝类作物一些重要性状的分子标记研究 14 性雄性不育分子标记辅助选择 16 5 本研究的目的与意义 16 V 材料和方法 18 1 实验材料 18 性雄性不育基因纯合标记的初步筛选所用材料 18 性雄性不育基因纯合标记的初获标记群体检测所用材料 18 规育种材料 19 蓝显性雄性不育分子标记连锁图谱的构建所用材料 20 2 研究方法 20 因组 速提取 20 析体系 20 因组 酶切连接：总体积 20 20 扩增：总体积 20 21 择性扩增 22 择性扩增结果的检测 23 性雄性不育纯合基因标记的筛选检测策略 25 染检测目标片段的挖带回收与纯化 26 染检测 目标片段的挖带回收 26 标片段的扩增纯化 26 化后目标片段的测序 27 因组 行法实现目标片段的延伸 27 因组 提取 27 因组 酶切 27 因组 切产物的连接 28 行引物的设计 28 行法扩增反应 28 行结果检测 29 标片段的克隆与测序 30 标片段与 连接 30 接产物的大肠杆菌转化 30 隆后载体的测序 31 物设计 31 增及检测 31 记的群体检测 31 合不育标记应用的扩增及检测策略 31 间育性调查 31 据分析处理 32 结果与分析 33 1 基因组 提取 33 纯合显性雄性不育基因型标记的筛选 33 3A 纯合显性雄性不育基因型标记的筛选 33 记的初步筛选 33 记的验证 34 3B 纯合显性雄性不育基因型标记的筛选 35 记的初步筛选 35 标记的验证 36 3B 三种基因型 5 个材料银染验证 36 3A 纯合显性雄性不育标记筛选 03B 材料 39 合不育标记结果的群体验证 41 3 化 记 44 合不育标记 回收测序 44 因组 移基因特异引物的设计 44 合不育标记 因组 移结果检测 44 记的引物设计 45 记的群体检测 46 4 显性雄性不育基因纯合标记应用范围检测 48 5 显性雄性不育基因 高密度连锁图谱的构建 51 间调查 51 雄性不育基因相连锁标记的验证 51 据分析 54 讨论 62 1 鉴定纯合显性雄性不育基因型的 记筛选 62 2 连锁分子标记辅助基因转育的适用范围 62 性雄性不育基因相斥相分子标记的应用 63 性雄性不育基因相引相分子标记的应用 63 3 记的应用 64 4 连锁图谱的构建 65 图效率评价及其影响因素 65 蓝显性雄性不育基因连锁图的构建 66 择合适的群体是寻找与表型性状相连锁标记的关键 66 交亲本与基因供体之间的亲缘关系 66 图群体单株数目 67 5 遗传滞留现象 67 6 分子标记辅助选择体系的建立 68 结论 69 考文献 71 附录 79 致谢 86 作者简历 87 表目录 论文表格目录索引 表 1 几种甘蓝雄性不育材料的来源及主要优缺点 1 表 2 植物 记技术一览表 4 表 3 主要类型的 子标记的技术特点比较 10 表 4 甘蓝类作物已构建的分子连锁图 13 表 5 近等基因系单株编号及对应材料基因型 18 表 6 用于纯合标记多态性检测的甘蓝材料及编号 19 表 7 切连接体系 21 表 8 预扩增反应体系 21 表 9 酶切连接接头序列及预扩增用引物序列 22 表 10 荧光引物选择性扩增体系 22 表 11 03A 和 03B 近等基因系标记筛选所用引物 23 表 12 银染选择性扩增体系 23 表 13 基因组 切体系 27 表 14 基因组 产物的连接 28 表 15 行法第一次 增体系 29 表 16 行法第二次 增体系 29 表 17 T 载体连接体系 30 表 18 从 03A 近等基因系中筛选出的 记 34 表 19 03B 近等基因系中多态性标记引物组合 36 表 20 03B 近等基因系中多态性标记引物组 合及估计标记分子量大小 37 表 21 03B 近等基因系标记荧光与银染检测结果对照 38 表 22 记区分 03A 和 03B 近等基因系中不同基因型 40 表 23 03A 纯合不育标记检测及育性表型 41 表 24 03A 纯合显性不育标记基因型预测准确性 42 表 25 03B 纯合不育标记检测及育性表型 42 表 26 记序列及 行各引物序列对比 46 表 27 记在 03A 和 03B 近等基因系中的检测 46 表 28 品种主要特性及标记在品种中带型分布情况 48 表 29 雄性不育连锁标记单株检测结果 51 表 30 交换单株连锁累赘和连锁滞留片段长度 60 表 31 显性雄性不育基因相引相标记基因型预测准确性 60 论文图片目录索引 图 1 记技术的原理示意图 8 图 2 03A 和 03B 近等