【毕业学位论文】（Word原稿）黄伞多糖的纯化方法、组分分析与功效研究微生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 黄伞多糖的纯化 方法 、 组分 分析与功效 研究 I 摘 要 该 论文以本实验室分离培养的野生黄伞 ( 为实验材料，在实验室先前研究的基础上，着重研究了黄伞菌丝体粗多糖的纯化工艺 ,并对所得单一多糖的结构进行了初步研究。同时 ,采用体外抗自由基实验探讨了黄伞菌丝体粗多糖在纯化过程中其抗自由基活性的变化。 主要研究结果： 1. 比较了菌丝体干燥方法、超声波处理及微波处理对黄伞多糖提取率的影响，得出菌丝体采用冻干法比采用烘干法干燥多糖得率要高 （ 最高 可达 ，并且所得粗多糖的多糖含量也较高 （ 最高 可达 ；超声波处理 则效果不明显 ，而 水提前 微波处理 4 分钟可以使多糖得率及多糖含量 分别提高 2通过对三种脱蛋白方法 (三氯醋酸法、 及等电点法 )的对比研究 ， 得出最佳除蛋白的方法为 ： 1%多糖溶液先用等电点法进行除蛋白一次 ， 然后再运用 处理两次 ， 即可将溶液中 的 大部分游离蛋白除去。 3对黄伞粗多糖溶液色素的 去 除进行了系统的研究， 通过 活性碳吸附法、氧化脱色法及离子树脂交换法进行色素去除的比较，发现将弱酸性阳离子树脂柱及弱碱性阴离子树脂柱串联起来对除蛋白后的多糖溶液中的色素有较好的去除作用，同时对其中的蛋白也有一定的吸附作用。 4. 采用 胶柱层析进行了分级实验，并通过电泳法及高压液相色谱法确定了所得 黄伞胞内 多糖 一种分子量均一的大分子多糖，经过紫外扫描确定其中不含核酸及蛋白 质 。 5通过薄层层析初步鉴定黄伞菌丝体多糖 是 由葡萄糖、果糖、甘露糖以及半乳糖四种 单 糖组成的一种杂多糖。但 四种单糖的 比值 以待今后进一步研究 。 6. 通过 黄伞多糖在纯化过程 各级产品 对模拟产生 的 自由 基 、 的 清除作用的变化进行了 功效 研究。研究发现，弱酸性阳离子弱碱性阴离子串联树脂柱对多糖进行纯化对其清除羟自由基及 超 氧自由基的作用影响较大，而单独的弱酸 性阳离子树脂柱 的 处理对多糖清除自由基的作用有提高作用，多糖对自由基清除作用的下降主要是由于弱碱性阴离子树脂柱引起的。 7. 对 黄伞发酵液中的多糖进行了提取，得到了多糖含量为 黄伞胞外多糖， 并对其清除自由基的作用进行了研究，发现胞外多糖对自由基具有一定的清除作用 ， 可作为一种天然 抗氧化剂，有深入研究的价值 。 关键词 黄伞 ， 多糖 ， 纯化 ， 多糖 组分 ， 自由基 y as is on of of is of of By of in of as 1. By of on of it is be by by of ; is no of on of by of of of 2. of of it is by in % be 3. of of of it is a on a of of 4. of by At is by to be 5. of is to be So is of is 6. of on H、 It is of a on to 7. in is of is it is it be a of ， 录 菌多糖的研究历史 . 1 菌多糖的分离提取与纯化 . 2 菌多糖的制备与提取 . 2 菌多糖的分离纯化 . 4 菌多糖的分级纯化与 纯度鉴定 . 4 菌多糖分子量的测定 . 5 菌多糖结构的分析研究 . 5 菌多糖的结构 . 5 菌多糖的结构分析 . 6 菌多糖结构与功能的关系 . 8 菌多糖的 应用 现状 . 9 伞及其研究进展 . 9 文研究的目的及内容 . 10 验材料 . 12 试样品 . 12 验试剂 . 12 器设备 . 13 验方法 . 13 伞多糖的提取 . 13 伞多糖的纯化研究 . 14 析方法 . 16 验结果与讨论 . 18 同 菌丝体干燥方法 对 粗多糖得率的影响 . 18 同预处理方法对粗多糖得率的影响 . 18 伞粗多糖纯化的实验结果 . 19 胶柱层析分离纯化结果 . 26 章小结 . 27 验材料 . 28 试样品 . 28 验试剂及配制 . 28 器设备 . 29 第一章 文献综述 . 1 第二章 黄伞多糖的提取与纯化 . 12 第三章 黄伞多糖 纯度的鉴定及组分 的初步研究 . 28 V 验方法 . 29 糖纯度的鉴定 . 29 糖组成的薄层层析分析 . 30 验结果与讨论 . 30 糖纯度的鉴定结果 . 30 糖组成分析结果 . 32 章小结 . 33 验材料 . 34 试样品 . 34 验试剂及配制 . 34 器设备 . 35 验方法 . 35 糖对 超 氧自由基 的 清除作用 . 35 糖对羟自由基 的 清除作用 . 35 据处理 . 35 验结果与讨论 . 36 糖对 超 氧自由基清除作用的变化 . 36 糖对羟自由基清除作用的变化 . 36 章小结 . 37 验材料 . 38 试样品 . 38 验试剂及配制 . 38 器设备 . 39 验方法 . 39 伞的摇瓶培养 . 39 伞胞外多糖的提取 . 39 试样品的配制 . 39 . 39 据处理 . 40 验结果与讨论 . 40 伞胞外多糖对 超 氧自由基的清除作用 . 40 伞胞外多糖对羟自由基的清除作用 . 41 果分析 . 43 章小结 . 44 伞多糖的提取与纯化 . 45 第四章 黄伞多糖纯化过程中其抗自由基活性的变化 . 34 第五章 黄伞胞外多糖的初步研究 . 38 第六章 全文结论 . 45 伞多糖 纯度鉴定及组分 的初步研究 . 45 伞多糖纯化过程中其抗自由基活性的变化 . 46 伞胞外多糖的初步研究 . 46 附录 . 52 参考文献 . 47 致谢 . 57 作者简历 . 58 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 菇多糖 洲分子生物学组织 铵盐十六烷基 三甲基胺溴化物 六烷基吡啶 效液相色谱 Mw 均分子量 Mn 均分子量 IR 外光谱 GC 相层析 ,气相色谱 MS 谱 磁共振 欧沃豪斯效应 原子轰击质谱 喷雾质谱 CI 学电离 FI 致电离 FD 解吸电离 行时间质谱仪 里叶变换质谱仪 相色谱 CE 细管电泳 二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳一聚偏氟乙烯薄膜电迁移 偏氟乙烯 丙烯酰胺凝胶电泳 光度 CD 二 色谱 晶牛 血清 白蛋白 二胺四乙酸 丝体提取多糖 弱酸阳离子柱后的多糖 多糖 ,51磁共振波谱仪 氧 化脂质 （ 乳过氧化物酶 ） 二醛 萄糖 糖 糖 李糖 乳糖 拉伯糖 露糖 层层析 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 多糖是 一类 来自于高等植物、动物细胞膜、微生物细胞壁中的天然大分子物质，是生物体内除蛋白质和核 酸外又一类重要的生物大分子，是几乎所有生命有机体的重要组成成分与维持生命所必需的结构材料。人们对多糖的认识首先是把它看作食物中的能量来源， 20 世纪 60 年代以后作为广谱免疫促进剂而引起人们的极大兴趣，尤其是人们发现真菌多糖具有抗肿瘤活性以后，多糖的研究受到越来越广泛的重视。现已确认，多糖具有抗肿瘤和免疫促进、抗炎、抗病毒、抗凝血、降血糖、抗感染、抗衰老等广泛的生物学活性。 真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中 提取 的一类可以控制细胞分裂分化、调节细胞生长和衰老的活性多糖，一般 是 由十个分子以上的单糖通过糖苷键 连接而形成的高分子多聚物，它是一类重要的保健食品功能因子，是当今医药和食品工业共同关注的焦点。我国有着丰富的真菌资源，已知对肉瘤和艾氏癌抑制率在 60%以上的真菌有 266 种，分属 51 科 72 属 （周国英， 2004） ，大多数功能真菌的抗肿瘤活性成分为多糖。国内外已从高等担子菌筛选到 200 余种有生物活性的多糖物质，目前我国发现有重要价值的真菌多糖 也已有 30 多种。真菌可以大规模生产、周期短且不受季节限制等适合工业化生产的特点使多糖具有较好的应用前景，而且迄今为止，人类在核酸和蛋白质的研究方面均取得了重大进展，推动了生命 科学及相关科学领域的发展，多糖 必 将成为最后一类有待攻破的生物活性大分子。 菌多糖的研究历史 自德国著名科学家 究糖类以来已有百余年的历史，但长期以来，人们过于低估了糖类对生命过程的贡献，只简单地把它作为一种能源来源和细胞结构的支撑物。再者研究糖类方法的复杂性与技术的局限性，使糖类研究远远滞后于同时代诞生的蛋白质和核酸的研究。 1936 年， 现了多糖的抗肿瘤活性，但由于技术上的落后，多糖作为药物研究却始于1943 年 （ 1976） 。然而，在其后较长时间内，由于多糖 分子本身结构的复杂性，这一天然大分子化合物仍没有得到足够的重视。上个世纪五十年代，随着化学和生物学的发展及分离技术的提高，人们才开始认识到多糖的结构是非常复杂多样的，其生物学功能也决非仅仅是能量和结构上的功能。 1957年， 吞噬细胞活性有影响。随后人们对酵母聚糖进行了分离纯化。 1961 年 定了酵母聚糖中的这种活性成分是葡聚糖，从而开创了葡聚糖作为免疫活性物质的新纪元 （ 1985） 。自此，多 糖作为广谱免疫促进剂引起人们极大的兴趣，科研工作者逐渐发现多糖具有复杂的、多方面的生物活性和功能。 1969 年 人从香菇子实体中分离得到了香菇多糖，并证明了 -(1 1969） 。从那时起，人们陆续从云芝、茯苓、猪苓、灵芝等多种食药用真菌中分离提取多糖，并评价它们的免疫活性和抗肿瘤能力。 上个世纪七十年代以后，随着分子生物学、糖生物学、糖化学以及糖工程学等学科的建立和发展，加上对膜的化学功能、免疫物质的化学研究及新药物资源的研究开发 （ 黄芳 ， 1999） ，人们逐渐认识到糖及其复合物分子具有极其重要的生物功能，涉及到生命过程中众多深奥理论的基础问题，与免疫调节、细胞信息传递与识别、细胞间物质运输、癌症的诊断与治疗等密切相关。中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 2 八十年代以后，人们得到了有关糖的结构和功能的越来越多的信息，特别是进入九十年代以后，人们对糖的认识有了质的飞跃，认识到糖是除核酸和蛋白质之外另一重要的生命物质（ 1984） ，涉及到特别是多细胞生命的全部时间和空间，如受精、着床、分化、发育、免疫、感染、癌变、衰老等 （ 1992） 。因此，对糖 类的研究再次成为人们关注的焦点。各国学者竞相从各种生物材料中寻找和提取具有生理活性的多糖物质，从而使糖类的研究有了空前的发展。尤其是真菌多糖，因具有增强机体免疫功能及抗肿瘤等药理作用，而且几乎没有毒性，愈来愈引起人们的兴趣。有关真菌多糖的研究，国内外已有很多报道，涉及到生化、药理、临床等各方面，阐明了它的结构、功能，以及构效关系，对中药创新药的研制及食用菌保健品的开发等多方面具有十分重要的意义，并已从高等担子菌中筛选到 200余种有生物活性的多糖物质。国内学者结合我国传统的中医药学，对许多食药用菌的多糖进行了 分离、纯化，并在化学组成和结构、生物活性及临床应用的研究中取得了成果 （ 顾学裘 ， 1989） 。我国发现有价值的真菌多糖有 30多种，其中化学结构较清楚的有 15种，香菇多糖（ 是研究较透彻的多糖之一。 近年来，国际上相继多次召开了有关“糖生物学和糖工程”的专题会议。 1993年，在美国召开了首届“国际糖工程”年会，会上会议主席 ，生物化学最后一个重大前沿，糖生物学的时代正在加速来临。 1995年 3月，亚洲分子生物学组织 (在日本举办了“糖生物学和糖工程”培训班 （ 金城 ， 1995） ，进一步验证了 预言。在 1999 年 9 月 1 4 日召开的第 122次香山科学会议上，来自国际糖生物学界的专家们从国际研究的水平，以“糖缀合物与人类健康”为主题，对国际糖生物学、糖化学及糖工程领域内药物化学、医学及基础研究方面的最新方法和应用研究的最新进展进行了交流。基于此，日本、美国以及欧洲等发达国家相继制定和实施“糖工程前沿计划”、“糖库计划”、“糖类研究开发网络计划”等糖类研究开发的战略目标，由此近十年来，糖类复合物包括多糖领域的研究获得了长足的发展并展示了美好的应用前景。 在 2001 年 3 月 23 日出版的美国科学杂志（ 291, 编了 7 篇综述和 6篇简介 ， 组成一个专辑“糖和糖生物学”。在 这 些专辑前有一篇导论，题为“灰姑娘的马车已经来了”。这预示着长期以来被人们看成灰姑娘的糖类已经搭上了仙人的马车，必将以其天生的丽质出现于科学领域的最前沿 （ 王克夷 ， 2001； 2001； 2001； 2001） 。 菌多糖的分离提取与纯化 菌多糖的制备与提取 真菌多糖的来源虽然很广泛，可以从食药用菌子实体、固培菌丝体、液培菌丝体、液培发 酵液、菌核 (茯苓 )等中提取，但是，真菌多糖的大批量生产主要还是通过食药用真菌的液体发酵 方式 来进行。液体发酵可以在较短时间内获得大量菌丝体及其他发酵产物，并且这一过程周期短、产量高、成本低、工艺设备简单，适合工厂化规模生产真菌多糖。 在进行液体发酵时，各种理化因素都会影响菌 丝 的生长速度、生物量及代谢 过程 等，同样，多糖的产生也会受到许多因素的影响，除了营养物质之外，其它环境因素也是相当重要的。从培养基中 C/N 的角度来讲， N 含量高，有利于菌丝的生长， 菌 丝得率就高；而 C 含量高时，应该更有利于多糖的积累 （ 1989） 。 是影响多糖合成的基本因素之一。李平作 （ 2000） 等在研究灵芝产胞外多糖的过程中发现，灵芝产胞外多糖的最适初始 且，如果在发酵中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 3 过程中采用流加碱的办法控制 ，灵芝胞外多糖的产量最高。同时，还可以通过培养基碳氮源的选择来控制 以红薯粉为碳源时具有较强