【毕业学位论文】（Word原稿）角蛋白降解菌Streptomyces fradiae var. k-11中蛋白酶基因的克隆及表达生物化学与分子生物学博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 角蛋白降解菌 I 中文摘要 角蛋白（ 一种广泛存在于自然界中的硬性蛋白，主要存在于各种动物的毛发、鳞片、羽毛、蹄、角等结构中。 角蛋白化学结构稳定，不溶于水，也 不能被一般的蛋白酶，如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等水解。 从微生物中纯化的角蛋白酶活性很强，可以水解多种难降解的纤维蛋白，如角蛋白、弹性蛋白和胶原等，具有广泛的应用前景。 本研究 确定 了角蛋白降解菌 弗氏链霉菌 有利于 蛋白酶纯化的最佳产酶培养条件 。 通过蛋白酶的同工酶电泳，从 角蛋白降解菌 弗氏链霉菌 培养液上清中，发现了六种分泌的蛋白酶， 初步摸清了 弗氏链霉菌 分泌蛋白酶酶谱。 纯化了弗氏链霉菌 产的两种分泌蛋白酶，并进行了部分氨基酸 序列测定。 构建了 弗氏链霉菌 用多种基因克隆技术组合， 克隆得到了 六种蛋白酶基因 中四个基因 在 册，注册号分别为 克隆得到的六种分泌蛋白酶中，有三种 (已报道的同源性最高的蛋白酶的 源性在 80%以下， 氨基酸同源性在 72%以下，是三种新发现的蛋白酶基因 。 克隆 的另一蛋白酶基因 成熟蛋白的氨基酸序列与已报道的 源性高达 基本上可认为是同一蛋白酶，根据我们及前人的研究结果，这一蛋白酶具有较高的角蛋白酶活性，是一极具应用潜力的蛋白酶， 但前人的 工作只得到了成熟蛋白的部分基因序列（编码成熟蛋白的 576的 492蛋白酶的 、信号肽编码序列及基因侧翼序列均未得到，而且未验证基因功能 , 而蛋白酶的 对蛋白酶的活性表达具有重要作用。本研究从蛋白纯化出发，经蛋白测序，进而调出部分基因序列，通过构建基因文库，首次获得了包括信号 肽、 编码序列在内的完整的基因序列。 通过 步研究了 弗氏链霉菌 六种蛋白酶基因在 羽毛培养基和高氏 1 号 培养基中，不同发育时期的表达情况。 研究结果表明，所研究的 几种分泌蛋白酶的表达均为组成型表达，与生长环境中是否存在角蛋白无关 。 构建了组成型和蔗糖诱导型分泌表达的枯草芽孢杆菌表达系统，为今后开发利用上述基因建立了初步的表达技术平台。 在大肠杆菌 表达了 因，验证了基因的功能，证明克隆的 因是蛋白酶基因，为今后对这些基因的开发利用打下了良好的基 础。 在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中均表达了 成熟蛋白基因和蛋白酶原基因，证明蛋白酶的 对蛋白酶的活性表达起着重要的作用。 测定了在大肠杆菌中表达的蛋白酶 部分酶学性质，发现 一种具有较强角蛋白酶活性的蛋白酶。研究发现，还原剂的存在，能极大地提高其角蛋白酶活性。克隆和表达的 有较大的应用潜力。 关键词 ： 弗氏链霉菌 蛋白酶 角蛋白酶 基因克隆和表达 I is a be in of It is in t be by as as So of of by of in of NA of 0% NA of 2%. So of a so be as 492of 576“of an in In NA NA is of in of in . of . . it in of . on of in 录 中文摘要 A B S T R A C T 第一章 引言 1 1 研 究 目 的 和 意 义 1 2 国 内 外 研 究 现 状 1 生角蛋白酶的微生物 2 真菌 2 放线菌 2 细 菌 2 角蛋白酶的理化性质 3 物特异性 3 子量 3 适 3 白酶抑制剂和各种离子的作用 4 它 4 角蛋白的酶解机理 4 性作用 4 解作用 5 氨基作用 5 角蛋白酶的分子生物学研究进展 5 蛋白酶表达调控的研究进展 5 蛋白酶基因 6 蛋白酶的晶体结构 6 蛋白酶的基因工程 6 蛋白酶的应用前景 7 料和饲料添加剂 7 药 7 药和化妆品 7 蛋白酶与疯牛病 7 它用途 7 题与展望 8 前存在的问题 8 望和对策 8 V 3 研究内容和方法 9 究内容及目标 9 究方法 9 第二章 蛋白酶 基因的克隆 10 1 材料与方法 10 验材料和实验设备 10 株与质粒 10 物合成 10 剂盒、工具酶和生化试剂 10 液 10 养基 10 验仪器 10 验方法 10 氏链霉菌 羽毛和头发的降解 10 氏链霉菌 诱导产酶 11 白酶的纯化 11 白酶的氨基酸序列测定 12 氏链霉菌 提取 12 白酶基因部分序列的克隆 12 向 15 因文库的构建和筛选 15 2 结果 18 弗氏链霉菌 降解羽毛和头发 18 白酶的纯化 18 白酶 的氨基酸序列测定 结果 20 白酶部分编码基因序列的克隆 20 20 肽 酶 分编码基因序列的克隆 20 分编码基因序列的克隆 21 分编码基因序列的克隆 21 分编码基因序列的克隆 21 分编码基因序列的克隆 21 反向 果 21 基因文库的构建和筛选 21 种蛋白酶基因的 列 23 23 25 26 27 30 31 3 讨论 32 本章小结 第三章 弗氏链霉菌 白酶基因的表达研究 47 1. 材料与方法 47 株 47 物合成 47 剂盒、工具酶和生化试剂 47 养基 47 验仪器 47 验方法 47 样 47 胞总 提取 47 醛变性电泳 48 48 一轮 增 49 二轮 49 2. 结果 50 一轮 应结果 50 二轮 应 （ 果 51 3. 讨论 52 本章小结 第四章 蛋白酶基因的异源表达 54 1. 材料与方法 54 实验材料 54 株与质粒 54 物合成 54 试剂盒、工具酶 和生化试剂 54 养基 54 验方法 54 草芽孢杆菌表达载体的构建 54 肠杆菌感受态细胞的制备和电击转化 58 草芽孢杆菌感受态细胞的制备和电击转化 59 59 60 肽酶 表达及检测 61 2. 结果 61 草芽孢杆菌穿梭表达载体的构建 61 61 62 丝氨酸蛋白酶 表达及检测 63 大肠杆菌中 的表达 63 枯草芽孢杆菌中的表达 66 70 70 诱导表达 70 肽酶 表达及检测 71 组表达载体 构建 71 诱导表达 72 3. 讨论 73 本章小结 第五章 蛋白酶 酶学性质 79 1. 材料与方法 79 验材料和实验设备 79 株 79 、底物和生化试剂 79 养基 79 验仪器 79 实验方法 79 表达和初步纯化 79 白酶活性测定方法 79 酪蛋白为底物测定 部分酶学性质 80 天青角蛋白为底物测定 部分酶学性质 81 . 结果 82 酪蛋白为底物测定 部分酶学性质 82 最适 82 最适反应温度 82 天青角蛋白为底物测定 部分酶学性质 83 适 和 定性的测定 83 适反应温度和热稳定性的测定 83 制剂对 性的影响 84 胰蛋白酶、蛋白酶 K 比较 85 3 讨论 86 本章小结 第六章 结论 87 参考文献 89 致谢 97 作者简历 98 中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 1 研究目的和意义 蛋白酶是一种应用范围广、使用量大，有巨大市场潜力的酶制剂，蛋白酶酶制剂的生产可产生巨大的经济效益和良好的社会效益。我国工业酶制剂 2000 年产量为 吨，其中蛋白酶在10 万吨左右，年增长率在 20%以上，角蛋白酶由于具有比普通蛋白酶更为优良的性质，作为蛋白酶的一个新品种，可望占据较大的市场份额。 本研究的目的就是从 一株能迅速 降解羽毛和头发等多种角蛋白的 菌株出发， 利用现代生物技术手段，研究该菌株的蛋白酶表达规律，克隆出该 角蛋白降解菌中与角蛋白降解相关的蛋白酶基因，并使用适宜的表达系统，重组出基因工程菌株，为进一步构建高效生产菌株 , 开发新型的蛋白酶品种打下基础。 2 国内外研究现状 角蛋白（ 一种广泛存在于自然界中的硬性蛋白，主要存在于各种动物的毛发、鳞片、羽毛、蹄、角等结构中。角蛋白可分为 角蛋白和角蛋白两大类。含 螺旋的角蛋白称为角蛋白，又分为 软 角蛋白和 硬 角蛋白两种。 软 角蛋白主要见于皮肤组织，而 硬 角蛋白是皮肤附属物如毛发、指甲等的主要成分。角蛋白含折叠重复结构，是羽毛的主要成分 （谭盈盈等 ， 2001） 。 角蛋白化学结构稳定，不溶于水，也不能被一般的蛋白酶，如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等水解 (， 1986)。角蛋白不溶于水和抗蛋白酶分解的性质主要决定于如下几个方面：胱氨酸残基所提供的分子间二硫键的高度交叉连接；氢键的作用；分子间的相互疏水作用等 (1973； ， 1998)。二硫键可因可逆的氧化和还原作用而发生断裂和重建。角蛋白不易降解，然而，在自然界并没有发现角蛋白废弃物的大量积聚，这应归功于角蛋白降解菌的作用。 早在 1899 年， 报 道了真菌马爪甲团囊菌（ 分解角蛋白。此后，在真菌、放线菌和细菌中陆续发现了许多具 有分解角蛋白能力的微生物，如 马发癣菌（ ， 弗氏链霉菌（ 地衣芽孢杆菌 。生物作用需要酶的参与， 1963 年， 将具有分解角蛋白活性的酶称为角蛋白酶（ ， 1963）。 上述 微生物能够分泌角蛋白酶， 降解 毛发、羽毛、蹄、角等 角蛋白。 从微生物中纯化的角蛋白酶活性很强，可以水解多种难降解的纤维蛋白，如角蛋白、弹性蛋白和胶原等，具有广泛的应用前景。 目前，人们对角蛋白酶的认识还很肤浅，已发表的工作主要涉及菌种筛选、酶的提取和活力测定等基础工作，对角蛋白酶的结构和作用机理的研究较少，分子生物学方面的研究尚处于起步阶段 (2002， 2004； 1968； 2000； 1998； 003； 2003； 2005； 2004； 2004)。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 2 生 角蛋白酶的微生物 目前，已在真菌、放线菌和细菌中发现了许多具 有分解角蛋白能力的微生物，这些微生物能够分泌角蛋白酶， 降解 毛发、羽毛、蹄、角等角蛋白。 菌 1899 年， 道了真菌马爪甲团囊菌（ 分解角蛋白，此后陆续发现了许多真菌 能够分泌角蛋白酶， 降解 毛发、羽毛、蹄、角等角蛋白。 现轮枝孢菌（ 和马发癣菌（ 有 较高的羽毛降解能力 (1980)。 研究了 21 种真菌，发现其中猴发癣菌（ 降解羽毛能力最强。 离到降解羽毛的烟曲霉（ (1996)。 从污泥中 分离到能降解鸡毛、人发和羊毛的四种真菌，包括二种皮肤真菌和二种腐生真菌 （ 2002） 。 目前，从 ， 1989； ， 1985； ，1996； ， 1979)， ， 1989； ， 1968， 1971)和 M. ， 2001； ， 1987； ， 1998； ， 1982； ，1984)等真菌中已分离得到多种角蛋白酶。 线菌 1959），他们以羊毛为基质来培养该放线菌，并初步探讨了角蛋白的降解机理。 将从土壤中分离得到的纯白高温放线菌（ 于羊毛分解试验，发现以羊毛作为唯一的碳源和氮源时能诱导角蛋白酶的合成。 尽管纯白高温放线菌所产的嗜热角蛋白酶与弹性蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶 但具有更高的水解 和角蛋白的活性。其活性是蛋白酶 倍，是枯草杆菌蛋白酶 5倍（ ， 1999）。丁正民等从鸡毛堆肥中分离到一株放线菌菌株 该菌具有很强的降解鸡毛的能力（丁正民等， 1993）。 可降解羽毛角蛋白（ 1999）。涂国全等分离到一株具有很强的角蛋白分解能力的菌株 弗氏链霉菌 该菌能迅速分解羽毛、人发等多种角蛋白，具有很好的应用前景（涂国全等， 1994）。 细菌 目前已经筛选和分离到很多能降解角蛋白的细菌，如： 1， 21，23， 2000； 2002， 2003， 2004； 1999； , 2005） 。其中研究最系统、最深入的当属地衣芽孢杆菌 的羽毛发酵池中分离得到的， 能在以羽毛为唯一的有机底物的培养条件下生长，以羽毛作为碳源、硫源和能量的来源。 以羽毛粉末为培养基质时，这种细菌的最适生长温度为近 50 。虽然地衣芽孢杆菌 它的好氧生长速度明显高于厌氧生长速度。然而，它厌氧生长时降解角蛋白所产的游离氨基酸的量要高于好氧生长时，可能是因为在好氧条件下氨基酸很快被进一步转化。地衣芽孢杆菌 能降解未用高温蒸煮的羽毛。要使羽毛降解，必须使羽毛高温蒸煮至少 2分钟以上 (990)。该菌的角蛋白 酶已被纯化，其角蛋白酶基因 第一章 引言 3 （ 1997； 1999， 2003， 2004； 2002）。 从中纯化到一种膜结合角蛋白酶，该酶最适温度高达 100（ 2002）。 菌科， ， 与芽孢杆菌不同，这种羽毛降解菌是中温性细菌，在 25 30 下生长良好，在 2天内可使羽毛几乎完全降解，包括羽小支和羽轴。更重要的是，这种细菌能够降解未经蒸煮的羽毛（ 2000），因而不仅具有更大的商业开发价值，而且为研究角蛋白降解菌降解角蛋白的作用机理提供了很好的材料。 蛋白酶的理化性质 各种微生物所产的角蛋白酶有着各自不同的起源，因此它们的理化性质既有共性又各有不同。 物特异性 目前发现的多数角蛋白酶的底物范围相当广泛，如 地衣芽孢杆菌 能降解角蛋白外，还可分解多种多肽和其他蛋白质，如胶原蛋 白、弹性蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白等（ 1992）。但也有一些角蛋白酶的底物范围很窄，如鸡毛癣菌角蛋白酶只能利用鸟类羽毛，因此它只感染鸟类。再如密旋链霉菌，在 位点对苯丙氨酸和精氨酸有专一性。该酶对底物表现出高度的立体选择性和二级结构专一性，它能快速分解鸟类羽毛，但较难利用其他天然角蛋白（ 1995）。 子量 许多微生物产生的 角蛋白酶已被分离纯化并研究了它们的性质，各种不同的菌产生的角蛋白酶分子量差异很大。单体的角蛋白酶分子量 一般为几十 地衣芽孢杆菌 单体酶，其分子量分别为 3340 0 1992； 999； 2000)， 但也有大于 100 的角蛋白酶分子量为 134 002） ，有的菌所产的角蛋白酶为酶复合物，其分子量更大，如 嗜热厌氧菌 所产的膜结合角蛋白酶 分子量在 2002002） 。 适 目前已经纯化得到的 角蛋白酶以中性和碱性蛋白酶居多，其 最适 地衣芽孢杆菌（ 热厌氧菌 最适 别为 8， 8 9和 9（ 1992； 1999； 2000； 2002） 。但也有少数角蛋白酶是酸性蛋白酶，如白色假丝酵母 （ 所产的角蛋白酶，其 最适 1983， 1984）。 多数 角蛋白酶的 最适反应温度在 40 55之间，如 地衣芽孢杆菌（ 1992； 1999； 2000； 2002）。但也有低于 40或高于55的（ ， 1985； 1984； 1979），更为极端的是 嗜热厌中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 4 氧菌 ，该酶的最适温度高达 100 （ 002）。 白酶抑制剂和各种离子的作用 不同来源的角蛋白酶有不同的专一性抑制剂，暗示角蛋白酶可能没有共同的起源。目前已发现的角蛋白酶以丝氨酸蛋白酶居多，其酶活可被丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟等所抑制（ 1995）。其次是金属蛋白酶，其酶活可被 2002； 2004） 。 不同来源的角蛋白酶对各种离子的反应是不同的，如 增强一些角蛋白酶的活性，而 抑制酶活（ , 2002）。但也有一些角蛋白酶的酶活为 抑制（ 1975）。对多数角蛋白酶而言， 增强其稳定性。 它 目前已发现的角蛋白酶中，多数属于胞外蛋白酶，也有少数是胞内蛋白酶 (987)或膜结合蛋白酶（ 2002）。 蛋白的酶解机理 目前普遍认为，微生物降解、利用角蛋白的过程可分为：变性作用、水解作用和转氨基作用等三个步骤。 性作用 二硫键对于角蛋白的不溶性和高稳 定性起着很重要的作用，因为二硫键可稳固角蛋白的立体化学结构，使其抗化学试剂和水解酶的攻击。二硫键可因氧化和还原作用而发生断裂和重建，一旦二硫键遭到破坏，角蛋白就很容易变性，从而丧失它不溶于水和抗蛋白酶作用的能力 （ 1934； 1995） 。例如，用还原剂巯基乙酸盐处理角蛋白，可打开二硫键，从而增加胰蛋白酶和芽孢杆菌碱性蛋白酶水解角蛋白的能力（ 934） 。再如，在 0530 的培养基中加入 还原剂 二硫苏糖醇 ， 角蛋白降解率 可从 10%提高到 70%。 将角蛋白高温蒸煮或将其碾磨成粉末，均能降低角蛋白中胱氨酸的含量 （ 1949），从而有利于角蛋白的降解。叶亚建认为，在角蛋白酶降解角蛋白的过程中，不需要还原剂或辅酶的参与，角蛋白酶中的二硫键还原酶是角蛋白降解的关键，它作用于二硫键，将胱氨酸（ 原为半胱氨酸（ 使角蛋白高级结构解体而形成变性角蛋白（叶亚建， 1989）。 不同的 微生物降解角蛋白的机理各不相同，降解过程中的产物也不相同 （ 1997； 1986， 1988；叶亚建等， 1989， 1998） 。目前，对多数角蛋白降解菌如何还原破坏胱氨酸二硫键，角蛋白酶是否具有二硫键还原酶活性还不清楚。由于不同的降解菌其角蛋白酶起源不同，故其作用机理可能不尽相同。某些真菌还原二硫键是通过菌丝体表面所分泌的亚硫酸盐及其产生的酸性环境；链霉菌则是通过产生还原酶来还原二硫键（ 2000）。角蛋白不溶于水，它只能以颗粒的形式存在于胞外，因此，二硫键的还原只能发生在代谢能力强的整体细胞表面，最有可能发生在细胞表面的胞联氧化还原系统 （ 中，它需要 不溶性的角蛋白与细胞紧密接触（ 1997） 。 对纯白高温放线菌 (研究发现，二硫键的还原是通过胞联氧化还原系统进行的 （ 1999） 。在链霉菌 角蛋白时，没有检测到释放的巯基中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 5 (1997； 1992)，这可能是由于胱氨酸二硫键还原产生的半胱氨酸很快被转化成了其它产物所致。 也有人认为 , 角蛋白酶本身具有一定的二硫键还原酶活性 , 但这还需进一步的实验证据来证实。 解作用 角蛋白只有在变性后，才能被角蛋白酶水解（ 1988）。变性的角蛋白失去了其固有的稳定结构，变得容易接近，在角蛋白酶及其它蛋白酶的作用下，变性角蛋白逐渐水解成多肽、寡肽和游离氨基酸（叶亚建， 1989）。 氨基作用 在添加羊毛的培养液中，随着纯白高温放线菌的生长，羊毛被降解成可溶性多肽和氨基酸，经脱氨基作用产生氨，使培养液的 渐升高。这是微生物在以蛋白质为基质