【毕业学位论文】Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270热激反应基因表达差异研究-资源加工与生物工程

分类号 密级 U D C 编号 士学位论文 论 文 题 目 3270 热激反应基因表达差异研究 学 科、专业 生物工程 学院(系、所) 资源加工与生物工程学院 研 究 生 姓 名 肖水明 导师姓名及 专业技术职务 邱冠周 教授 刘学端 教授 2008 年 5 月 分类号 密级 硕士学位论文 3270 热激反应基因表达差异研究 of 3270 姓 名： 肖水明 学 科、 专 业： 生物工程 学院（系、所） ： 资源加工与生物工程学院 导 师： 邱冠周 教授 刘学端 教授 论文答辩日期 答辩委员会主席 中 南 大 学 2008 年 5 月 - I - 摘 要 嗜酸氧化亚铁硫杆菌（ A. 为微生物冶金的主要菌种，最初应 用于低品位铜矿、铀矿的微生物浸出生产，随后拓展至金、锌、钴等多种金属。 A. 微生物浸出活性容易受到各种环境因素的影响， 如温度、重金属离子浓度和 。该菌最适生长温度为 26 30，但夏季矿物生物浸堆内部温度普遍高于35，同时硫化矿物的微生物浸出是放热反应 ，靠人工降温来满足细菌的生长温度要求十分困难。高温加之其他环境压 力因素影响细菌菌体活性，导致金属的微生物浸出效率不高。因此，开展 A. 耐热性研究对我国的微生物冶金工业具有重要的理论和现实意义。 本研究通过对微生物冶金模式菌 A. 3270 热激前后基因表达谱芯片分析来揭示 A. 3270 热激反应的基因转录水平变化，并采用实时定量 法验证芯片实验结果和计算机生物信息学分析， 为阐明 A. 3270 热激反应的保护机制，最终通过基因工程手段提高 A. 热性和高温条件下微生物浸出活性奠定理论与实践基础。 本研究以对数生长期 A. 3270 作 42热激 25 期未经处理， 30正常培养的 A. 3270为对照组。全基因组 达谱芯片杂交结果显示，占 A. 3270 基因组总预测基因数（ n=3217）约 n=473）的基因发生明显的表达差异 （ P。 其中 248 个基因表现为热激后上调 （ ，225 个基因表现为热激下调表达 （ 。 差异表达的基因涉及蛋白质命运、环境响应、信号转导、物质运输、蛋白质代谢、脂肪代谢、糖代谢，假定蛋白编码等多个功能分类与代谢途径。 特别是其中有大量介导蛋白质正确组装、修复和降解的热激蛋白和分子伴侣基因 上调表达，且上调表达的程度明显高于其它功能基因的上调倍数。 同时，细胞膜蛋白编码基因的差异表达表明细胞可能通过改变细胞膜组分或结构应对环境温度的上升。此外，生物合成部分相关基因表达受抑 制，核糖体蛋白，鞭毛蛋白等编码基因下调表达应答环境温度升高。 选取表达谱芯片检测结果中 14 个热激上调表达基因，包括 32因子，部分热激蛋白和分子伴侣编码基因，利用 法对芯片杂交结果进行验证，其中 13 个基因与芯片结果基本相符，表现出相同的上调 - 表达趋势。 通过时间梯度 析， 热激相关基因先随时间 （ 40 加呈上调表达，应答环境温度上升变化，随后热激蛋白和分子伴侣基因表达量回落，基本恢复原转录 水平以适应新的稳态温度。最后，基于基因的表达上调和计算机的生物信息学分析 ，预测得到热激诱导上调表达基因上游转录调控位点 2 个保守区域平均间隔约为 19 关键词： A. 激反应，表达谱芯片， - s of A. in of to A. is to of as of or pH on of So of . in to is to To s to in to by NA . CR a of a of . 3270 42 5 30 ) as (n=473, 248 25 of . 3270 n=3217) on or P5to 42 ). in As a of to in or in to in A of in to CR to 4 - we 13 to of P a 25to to to a 2 . on a in 35 in 10 9 of A. - V - 符号说明 缩略词 中文名 英文名 准柠檬酸钠溶液 二烷基磺酸钠 ,41,4激蛋白 补 碳酸二乙酯 氧三磷酸核苷 聚合酶链式反应 分钟转数 基对 E 冲液 甲基亚砜 使 B 洗脱缓冲液 t 循环阈值 荷耦合器件 噪比 to s 秒 h 时 糖体 D 光密度 国菌种保藏中心 国遗传学研究所 电倍增管 二胺四乙酸 沉降系数 部相似性基本查询工具 - 国国立生物技术信息中心 - 目 录 摘要 . I .号说明 .一章 绪论 .究进展及其工业应用 . 微生物冶金 . A. 究进展及在微生物冶金中的应用 .激反应研究进展及分子机理 . 热激反应 . 热激反应机制 .因表达研究方法 . 基因表达研究 . 基因芯片技术 . 实时定量 .论文的研究目的、意义及内容 . 本论文的研究目的和意义 . 本论文的研究内容 . 本论文课题资助情况 .二章 A. 3270 热激反应基因表达谱芯片分析 .料与方法 . 供试材料 . 总 提取及纯化 . 荧光标记的 合成 . A. 3270 基因芯片的制作 . 芯片的杂交、洗涤与扫描 . A. 3270 全基因组信息资源 .果与讨论 . 不同温度 A. 3270 生长及代谢情况 . 总 量分析 . 芯片杂交结果分析 .- 异表达基因的功能分类 .三章 利用 法验证芯片杂交结果 .料与方法 . 供试材料 . 总 提取及纯化 . 反转录 成 . 物设计及标准曲线的制作 .果与讨论 . 总 量分析 . 量分析 . 阳性质粒的 定和序列分析 . 果分析 .四章 热激相关基因启动子及模体预测 .料与方法 . 供试材料 . 热激相关基因启动子区预测 . 动子模体预测 .果与讨论 . 启动子区特征分析 . 启动子模体特征分析 .五章 结论 .考文献 .谢 .读学位期间主要的研究成果 .士学位论文 第一章 绪论 - 1 - 第一章 绪论 究进展及其工业应用 生物冶金 随着社会的快速发展，人类对自然资源的需求量与日俱增，而自然矿产资源逐渐枯竭，因此对矿冶技术提出了更高的要求。微 生物冶金技术是随着近代学科的交叉发展，生物工程技术和传统矿物加工技术相结合 产生的一种新工艺，该技术能耗少、成本低、污染轻、工艺流程简单等，在矿物加工 、三废治理等领域展示了广阔的应用前景，并取得了良好的经济效益1。 微生物冶金通过利用以矿物氧化为能源的微生物的作用，氧化分解矿物使金属离子进入浸矿溶液，进一步分离、提取金属，具 有流程短、成本低、环境友好和污染低等优点，特别是微生物冶金技术能处理低品位、复杂、难处理的矿产资源。 1、微生物冶金技术原理2按照微生物在矿物加工中的作用可将微生物冶金技术分为：生物浸出、生物氧化、生物分解。现重点阐述本课题所涉及的生物浸出技术原理。 硫化矿的微生物浸出的实质是使难溶的金属硫化物氧化，使其金属阳离子溶入浸出液，浸出过程实际上是硫化物中 能的机理如下： 1直接作用：细菌吸附于矿物表面，对硫化矿的直接氧化分解作用。可用反应方程式表示为： 22+4H+ 22 （方程式 1 式中 M 为 金属。 2间接作用：金属硫化物被溶液中的 化，可用以下反应式表示： 2+2程式 1 生成的 细菌的参与下氧化生成 4H+ 42 （方程式 1 3原电池效应：两种或两种以上的固相相互接触并同时浸没在电解质溶液中时各自存在电位，组成原电池，发生电子从低电位 向高电位转移，并产生电流。原电池的形成可加速阳极矿物的氧化，同时细菌的存在强化了原电池效应。 本论文下文中的微生物冶金，未作特殊说明即指微生物浸出技术。 细菌参与 细菌参与硕士学位论文 第一章 绪论 - 2 - 2、微生物冶金技术的应用 近 20 多年来，微生物冶金已经成为冶金领域的热门研究课题。迄今为止，工业上应用微生物冶金技术回收的金属主要有铜、铀 、金、钴，对锌、镍、锰、稀土元素、铂族金属元素、钼、铅、硅酸盐及铝土矿等的回收也有研究3，全世界铜产量的 25%是采用微生物浸出技术获得，美国黄金总产量的 1/3 是用生物堆浸法生产4。 最初微生物浸出铜主要用于从废石和低品位硫化矿中回收铜，近年来该方法已用来处理含铜品位大于 1%的次生硫化铜矿。目前，全世界有十几座铜的微生物冶金提取厂，最典型的是智利 的微生物浸出厂，该厂日处理能力达 17300 t/d，铜的浸出率可高达 82%，年产 75000 t 铜。 我国已开采的铜矿中约 85%属于硫化矿，在过去的开采过程中受当时选矿技术和经济成本的限制产生了大量的表外矿和废石，废石含铜通常为 在“九五”期间，江西德兴铜矿采用细菌堆浸技术处理含铜 废石，建立了生产能力 2000 t/a 的微生物湿法炼铜厂5。 福建紫金山铜矿已建成我国第一家万吨级微生物冶金提铜厂，于 2005 年 12 月顺利投产。 . 究进展及在微生物冶金中的应用 1947 年， 首先从酸性矿坑水中分离出能氧化硫化矿的嗜酸氧化亚铁硫杆菌( A. 其后 ， 对该自养细菌的生理特性进行了研究，发现该细菌能将 化成 并把矿物中的硫化物氧化为硫酸。 1954 年， 等人比较系统地研究了各种硫化物的微生物浸出过程及 A. 硫化矿浸出过程中的作用。 1958 年，美国肯尼柯铜矿公司首先利用 A. 滤硫化铜矿获得成功10， 1966 年，加拿大的细菌浸出金属铀获得成功11。目前生物冶金的对象主要是利 用铁、硫等的氧化细菌进行铜、铀、金、锰、铅、镍、铬、钴、钒、铁、 砷、锌、铝、银、锗、钼等硫化矿的生物浸出12。 1、 A. 生理特性 A. 泛分布于自然界，在无机矿床环境中繁衍旺盛，通过氧化 子或还原态的硫化物获得能量，在纯培养时 可快速分解硫化矿物。因此该菌广泛应用于微生物冶金工业，是微生物冶金中最常用的菌种。它能利用化学能来驱动 铁矿（ 其利用的典型能源13。 A. 原核生物界、化能营养原核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属。该菌化能自养，好氧并嗜酸，革兰氏阴性菌，菌体长 m 到数 m，宽约 m， 呈杆状， 生有鞭毛， 能游动， 鸟嘌呤( G)和腺嘌呤( C)的摩尔百分含量为 57 62%，硕士学位论文 第一章 绪论 - 3 - 广泛生存于土壤、海水、淡水、硫磺泉和沉积 硫内，尤以金属硫化矿和煤矿等酸性矿坑水中最为常见。其生长条件 度为 25 3514。 2、 A. 业应用中的问题 然而在工业应用中，微生物冶金技术的不足之处在于微生物浸出速率较慢、生产周期长，其关键问题是所使用的菌种生物浸出 活性不高，多为天然的菌种或经人工驯化的菌种。 不论是采用何种方法处理不同的矿物， A. 化活性都会受温度、矿物的矿粒大小、空气分离器、 菌载体的影响15。难浸低品位原生硫化铜矿石微生物浸出的研究已取得了长足的进步， 但还存在许多问题有待进一步研究及解决16： 1高性能浸矿菌种的选育，细菌培育生长与工艺条件的匹配； 2微生物浸矿的机理研究，包括酶催化机制， 矿冶工艺中细菌代谢过程等； 3微生物浸矿过程热力学、动力学、电化学的研究； 4微生物浸矿的工艺流程、工艺参数的研究与开发； 5微生物浸矿的特有设备研制及过程的模型模拟与仿真； 6微生物浸矿的工业应用。 激反应研究进展及分子机理 热激反应 低品位、复杂硫化矿微生物冶金速度慢、浸出率低是国际上未能解决的难题，而其根源在于缺少专属性、环境适应性好的菌种。 微生物冶金工业应用中，夏季矿物浸堆内温度普遍高于 35，加之硫化矿物的微生物浸出是放热反应，对大型堆浸床，靠人工 降温来满足细菌的生长代谢温度要求十分困难17。环境温度影响细菌活性、细菌氧化 最终影响金属浸出率18，加之其他环境压力的影响，金属的生物浸出效率不高 。现阶段大部分育种工程仍处于实验室阶段，主要应用传统诱变技术和现代基因工程 手段进行改良，以期获得繁殖速率快，氧化能力强，适应性强，特别是对高温、多种 重金属离子、表面活性剂、氯离子的耐受性强的优良工业用菌19。 微生物代谢和生理对环境压力因素的应答机制使其能够在超出其最佳生长条件范围外的环境中迅速作出相应反应并逐渐适应20。 A. 常遭受各种环境压力，如温度变化，重金属离子浓度增加和 境的变化影响势必影响细菌浸矿活性21。热激反应（ 机体细胞为应对各种硕士学位论文 第一章 绪论 - 4 - 环境压力，被相对高温（比正常生长温度高约 5 10）或一系列其他体内外应激因素所诱导，迅速、复杂、短暂的细胞活动程序的 重新调整过程，以应激蛋白的大量表达为特征。温度上升导致的细胞热激反应已被广 泛作为研究环境压力对生物体系影响的系统模型22。 热激反应诱导热激蛋白（ 上调表达，研究表明， 且也能被一系列其 他体内外应激因素所诱导，如重金属离子、高盐、高 /低 外线、病毒感染、乙醇、 香类化合物23。热激蛋白主要起分子伴侣（ 用，介导蛋白质的正确折叠、组装、降解和蛋白质的跨膜运输，维持生物体正常生理功能24，提高生物体对不良环境的耐受力。 激反应机制 1、热激蛋白生物学功能 1分子伴侣功能 分子伴侣广泛存在于各种原核生物和真核生物细胞内，不仅可在细胞处于应激状态下调节细胞的生理功能，而且在蛋白质的跨 膜转运、折叠、降解及特定构象维持等方面起重要作用25, 26，但分子伴侣不是这些蛋白质功能结构组分27。 质 止前体蛋白形成不可解开的构象，也可以防止已松弛的前体蛋白聚集。 作为分子伴侣， 2维持细胞或生物体的动态平衡，保护其免遭环境压力因素损害 在此功能中表现最为明显的是细胞热耐受能力的形成，热激反应是生物体对相对高温逆境（一般为高出正常生长温度 5 10）的一种反应，即当细胞或生物接触亚致死温度后，迅速而大量表达热激蛋白，表现为 致死温度下的存活率明显增加28。在热耐受的形成中， 录表达 用 9。 热激蛋白的诱导与生物体耐热性具有相关性。首先，生物体不同生长发育时期的耐热性与体内的热激蛋白的积累相关。另外， 突变体的研究和转基因的实验都证明，某些种类的热激蛋白对生物体的耐热性起着决定性的作用。 热激蛋白应该至少在两方面对细胞耐热性有贡献30： 第一，参与蛋白质的降解：热激状态下有机体对蛋白质的主动降解具有重要的生理意义。首先，高温导致生物细胞内的大量蛋 白变性、失去正常的生理功能，细胞对变性蛋白的降解是维持细胞正常代谢平衡的重 要手段；更为重要的是细胞可通过对特定蛋白的降解调控基因的表达，使机体适应高温环境。 硕士学位论文 第一章 绪论 - 5 - 热激蛋白在蛋白质降解中的作用是多方面的，它既可以直接参与到蛋白质降解的代谢途径中，又能以分子伴侣的身份协助蛋白 质的降解。在原核生物中许多热激蛋白本身就是蛋白酶，如 族蛋白均为丝氨酸蛋白酶， 以协助异常蛋白的降解31。实验证明大肠杆菌（ E. 因突变后，异常蛋白的降解速度明显变慢32。后来研究发现 3和酵母线粒体 4都可以与 白酶形成复合体，从而促进异常蛋白的降解。 其次，对热损伤蛋白的保护和修复：虽然热激蛋白的家族众多，不同家族有着不同的生理功能， 但热激蛋白大都被认为具有分子伴侣的功能 （如 ） ，在正常条件下这类蛋白参与新生肽链的正确折叠，寡聚蛋白质的组装、分解以及蛋白质的跨膜运输等代谢过程。 3保护遗传物质 对生物生长、发育和分化的作用 研究发现，预热处理的细胞若再次接受药物刺激，其存活率较未预热处理的细胞显著升高且 胞内 而为 5。 4参与体内许多调节过程及其他功能 类固醇、肿瘤坏死因子、癌基因等)有着密切的联系。如类固醇激素是 们在靶细胞核内与相应的受体结合而起作用。此外，在正常的中枢神经系统内即有 功能尚未完全清楚。在神经系统缺血、缺氧和过度兴奋性刺激等应激状态下， 6。 2、热激反应研究的相关应用371对基础研究的推动作用 目前对热激反应的整个过程及其内在机理尚未完全明了，因为：第一，其过程非常复杂，涉及基因表达调控，信号的传递、放 大、连接，蛋白质的结构与功能关系等方面，而且各方面互相关联，协同作用，构成 一个整体；第二，现已建立的可用于解释类似过程的有关理论如基因的转录调控理论 ，蛋白质的组装、修饰、转运、结构与功能等学说，都还不足以用来阐明热激蛋白的 表达和作用过程以及生物的耐热机制。因此，通过对热激反应的研究，可以进一步了 解生物体内环境的运行机制，了解生物适应性的产生过程和原理，并为其它复杂问题的揭示和解决提供新的模式和思路。 2在工农业方面的广泛应用 因为热激能够诱导生物体产生对进一步热激的耐受力，所以在农业上可对不易耐受高温的瓜果、蔬菜、花卉等的幼苗进行适度 的高温预处理，来提高它们在未来高温环境下的生存能力或产量。在微生物发酵、微 生物冶金等工业上，有利于进行工艺调硕士学位论文 第一章 绪论 - 6 - 控；其次，热应激还能用来提高生物体对其他各种不良环境的耐受力。 3为育种工作带来的新希望 通过对生物耐热性的研究，可以运用一定手段进行定向选育，甚至采用基因工程的方法，在不影响其它优良性状的前提下，导 入相关基因，使热激蛋白或其它有关蛋白能够大量表达，这样可得到所需的可在不良 环境中正常生长的品种。该研究在植物耐热方面已有较广泛的应用。 4在医学方面广阔的应用前景 热激反应研究有利于提高癌症治疗成功率。人肿瘤细胞置于高于正常温度 4 8时死亡，如果具备了对反复热处理和机体耐 受能力的了解，可提供热治疗的最佳恢复时间和最适治疗间隔，从而提高抗癌物理疗法成功率。 另外，生物的耐热性与热激蛋白的研究还将给生物工程技术的发展、环境保护及极端环境的开发等带来极大的益处。 3、 对于 ：协助蛋白质跨膜运输，防止蛋白质前体积累并协助蛋白质跨膜转移； 与未折叠蛋白质形成复合物以维持其转移能力；维持蛋白质的正常折叠状态，促进错 误折叠的蛋白质降解；在蛋白质折叠及应激条件下稳定多肽链、防止蛋白质失活的作用。 不同的 以 作用方式为例，见图 1靶蛋白上 6 9个疏水氨基酸残基结合，并在 进靶蛋白的 正确折叠，维持转移到内质网上的靶蛋白的三维结构。 将靶蛋白包围，在其正确折叠后释放。 图 1 靶蛋白作用机制 he 士学位论文 第一章 绪论 - 7 - 4、热激蛋白表达调控38鉴于 细胞分裂、分化、凋亡等生命基本过程中的关键作用，大量研究集中于