【毕业学位论文】（Word原稿）桔梗种质资源主要性状描述评价与遗传多样性研究野生动植物保护与利用硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士 学位论文 桔梗种质 资源 主要性状描述评价与遗传多样性 研究 of of I of of 要 本文对来源于 吉林左家、山东淄博等地的 32 份桔梗种质 的生物学性状和品质性状进行了描述评价，并采用过氧化物同工酶和 记进行遗传多样性研究 ，为桔梗种质资源的收集、保存、评价及利用提供了科学的依据。研究结果如下： 利用 国家科技基础平台项目 所制定“桔梗种质资源描述标准和规范” 对于 32份桔梗种质进行了描述 ， 并在“规范”的基础上， 制定了主要数量性状分级标准 。 通过对 32份桔梗种质的描述评价， 初步筛选出 具有优良性状 的种质： 份种质 根重大 ,大； 份种质 主根长， 份 种质 主根较长； 份种质 总皂苷含量较高； 份种质 折干率高。其中 根较长二个优良性状。 以雌蕊为桔梗过氧化物同工酶标记的试验材料， 32 份桔梗种质共呈现 17 条酶带，其中具多态性酶带 13 条 , 多态性百分率达 比同类研究中以叶片为试验材料的1 5 条酶带多 10 条以上酶带。获得特异性酶带 7 条 , 32 份种质呈现 16 个酶谱类型 , 其中 12 个为特异性酶谱类型 ,更全面地揭示桔梗种质资源间的遗传差异。 利用 10 个随机引物对 32 份桔梗种质进行 增，共扩增出片段 111 条 ,其中106 条具多态性 ,多态率为 各引物多态性百分率为 利用 2 个多态性强的引物 将 32 份种质鉴别。 同地区中的种质中 ，吉林左家 、山东淄博、沈阳法库、黑龙江青岗种质的多 态 性水平分别为 不同地区不同茎色类型中，黑龙江青岗绿茎型多态性较高 , 多态性百分率 为 其次是吉左家绿茎型和上部紫茎型，多态性百分率为 山东紫茎型最低 ,多态性百分率 利用 据进行聚类， 供试种质聚为 3 个类，吉林左家的种质独自聚为一类，其它地区的种质没有形成很好的聚类，并且出现山东桔梗与黑龙江地理距离较远种质聚类的现象 ,可能与栽培区之间的种源交流有关 。 在类内 ，绿茎类型聚为一类， 紫 茎与 上部紫 茎 型 聚为一类， 说明紫 茎型与 上部紫 茎 型的亲缘关系较近 ，绿茎型与它们的亲缘关系较远。可见 利用 记既可揭示形态相似种质间的遗传关系。 关键词 ： 桔梗 ， 种质资源 ， 描述评价 ， 过氧化物同工酶 ， he 2 in by as 32 to by of A on 2 In of 9 of s Of 7 by 2 7 13 of 0 as In 7 16 of 2 12 of NA 2 by 0 A 11 Of 106 to be o f he of a a of t or a a It V 目 录 第一章 引 言 . 1 梗种质资源研究进展 . 1 源鉴别研究 . 1 白质同工酶研究 . 3 胞学研究 . 3 子生物学研究 . 4 量评价研究 . 5 品种选育研究 . 5 究的目的和意义 . 7 第二章 桔梗种质资源描述评价研究 . 9 料与方法 . 9 验材料 . 9 验方法 . 9 果与分析 . 10 质资源描述 . 10 要数量性状评价 . 10 要数量性状的变异及性状间相关 . 13 第三章 桔梗种质资源过氧化物同工酶研究 . 15 料与方法 . 15 验材料 . 15 验仪器 . 15 要试剂及配制 . 15 验方法 . 16 果与分析 . 17 宜材料的确定 . 17 工酶谱分析 . 17 第四章 桔梗种质资源 纹研究 . 20 料与方法 . 20 验材料 . 20 验试剂 . 20 验仪器 . 20 验方法 . 20 果与分析 . 21 因组 量检测 . 21 物的筛选 . 22 增结果 . 22 类分析 . 24 五章 讨 论 . 27 要性状描述评价 . 27 要数量性状的变异及性状间相关 . 27 工酶标记 . 27 记对桔梗种质资源研究的实用性 . 28 传多样性分析的取样 . 28 类结果 . 29 第六章 结 论 . 30 质资源描述评价 . 30 要数量性状的变异及性状间相关 . 30 工酶标记 . 30 记 . 30 质间的亲缘关系 . 31 参考文献 . 32 致 谢 . 36 附 录 . 37 附录 附表 . 37 附录 附图 . 53 作者简历 . 54 英文缩略表 英文全称 中文名称 m 随机扩增多态 n 聚合酶链反应 en 限制片段长度多态性 t 扩增片段长度 多态性 卫星 显性 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引 言 梗种质资源研究进展 桔梗 梗科 多年生草本 植物，以干燥根入药。 具有 宣肺 、 利咽，祛痰 、 排脓之功效 （中华人民共和国药典编委会， 2000） 。用于治疗外感咳嗽，咽喉肿痛，肺痈吐痰，胸满肋痛，痢疾腹痛等症 。 在我国东北地区及日、韩、朝等东南亚国家 ，桔梗 被作为常用蔬菜。 现代药理学研究表明，桔梗具有抗炎、祛痰、镇咳、抗溃疡、降血压、 扩张血管、解热镇痛、镇静、降血糖、增强人体免疫力等广泛的药理作用（舒娈等， 2001）。桔梗在我国大部分省区均有分布，约在北纬 20 55 、东经 100 145 之间。 此 外，在东亚、前苏联远东地区、朝鲜半岛、日本列岛也有分布（周荣汉， 1993）。 桔梗为桔梗科桔梗属植物 ， 该属在全世界仅此一种。 文献报道桔梗有紫花、白花和黄花类型 (中国医学科学院药用植物研究所 ， 1991；谢宗万， 1963)，魏建和等 (2002)还发现粉花桔梗。 白花桔梗 近年还发现 新的栽培变种 重瓣桔梗 学森，1996） 。 据笔者观察，桔梗种内的 存在丰富的 变异，根据茎色不同有绿色、紫色、上部紫色等类型，根据叶片形状有披针形、宽 披针形、卵形、卵状披针形、近圆形等类型。 这些丰富的遗传资源是资源利用的 物质 基础 。 多年来 国内外学者开展了 一系列 有益的 研究工作 ， 为 桔梗种质资源的利用奠定了基础 。 源 鉴别 研究 (1)性状鉴别 吴向莉（ 2005） 对桔梗及其伪品霞草的药材性状进行鉴别显示，桔梗根茎有半月形茎痕 ，质 脆 而 易折断。断面具裂隙，呈菊花心 ， 形成层环明显 ， 味微甜后苦；霞草根茎部无半月形茎痕 ， 质坚实 ， 不易折断，断面纤维性，有黄白相间的异型维管束，味苦。 舒皖庆等（ 1997）、 肖如萍 （ 1994） 对 桔梗及伪品长柱沙参根、石头花根、灯心 蚤缀的性状也进行了鉴别。 (2)显微鉴别 吴向莉（ 2005） 对桔梗及其伪品霞草的组织显微结构进行鉴别表明，桔梗皮层窄常见裂隙 ， 形成层成环 ， 韧皮部宽广 ， 木质部导管呈放射状排列 ， 主要为梯纹、网纹导管 ， 有菊糖和乳汁管；霞草皮层较宽 ， 有异型维管束 ， 主要为网纹导管 ， 有大量草酸钙簇晶 分布 。 舒皖庆等（ 1997）、 肖如萍 （ 1994） 对桔梗及伪品长柱沙参根、石头花根、灯心蚤缀 也 进行了显微鉴别。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 2 （ 3） 理化鉴别 肖如萍 （ 1994） 对桔梗及其伪品丝石竹根进行了理化特性鉴别 ， 桔梗含有植物甾醇，其水浸液遇三氯 乙 酸由红色渐变为紫色，而 灯心蚤缀不含植物甾醇，故无此变色反应 。 曾肖蓉等 （ 1999）、 周建平等 （ 1997)用 桔梗及其伪品丝石竹根 粉末各 1g，分别加甲醇 10于水浴上加热回流 30滤液置蒸发皿中 ， 于水浴上蒸干 ， 加醋酐 2解 ， 倾上清液于干燥试管中 ， 沿管壁加入硫酸 1接界面处溶液呈棕红色环 ， 且上层蓝色立即变为污绿色即为桔梗样品；界面清楚无色 ， 且下层溶液为黄色者为丝石竹根样品 ，利用此方法能明显地把及桔梗伪品区别开来。 刘军等（ 1998）对 桔梗及伪品丝石竹药材断面进行荧光鉴别 ， 在紫外光灯 (254观察 , 桔梗皮部呈淡蓝色 荧光 ， 木部 呈 黄绿色荧光 ； 丝石竹皮部呈亮蓝色的荧光 ， 木质部束 呈 黄绿色的荧光。 韩灵国等 （ 2005） 将桔梗、南沙参、霞草粉末的不同溶剂浸出液滴于滤纸上，在紫外灯下观察 ， 在 365，桔梗的水、 10%氯仿浸出液显蓝紫色荧光 ， 10%出液显黄蓝色荧光，乙醇浸出液在 254暗紫色荧光；在 365沙参的水、 10%氯仿浸出液显亮蓝色荧光 ， 10%出液显亮蓝紫色荧光 ； 霞草水浸出液呈亮天蓝色荧光。可明显区别桔梗及其伪品南沙参、霞草。 陈波 （ 1989）、 程道福（ 2003） 对桔梗与丝石 竹进行紫外鉴别 ， 证明两者的无水乙醇提取液紫外鉴别效果好，桔梗在 267 有最大吸收峰，而丝石竹没有。程道福将桔梗和霞草浸出液用紫外分光光度计在 190 340长范围内进行扫描，结果桔梗在波长 (190 有最大吸收，而霞草则在 (长处有最大吸收。桔梗及 其 伪品长柱沙参根、石头花根 的 紫外光谱鉴别显示，桔梗在 253、268、 282 各有一吸收峰；长柱沙参仅在 269有一最大吸收峰，石头花在280有一最大吸收峰 （舒皖庆， 1997） 。 黄桂华 （ 1998） 对 桔梗及 其 伪品长柱沙参进行了 理化 鉴别。 李海鹰等 （ 1995） 利用纸层析对桔梗及其伪品霞草 进行鉴别 ，结果桔梗与霞草根甲醇提取物的纸层析图谱中，斑点的数目、大小、位置均有区别 。 周容等（ 2003） 利用 红外光法直接鉴定人参及北沙参、桔梗、 峨 参的红外光谱图 ， 结果表明它们都具有较明鲜的指纹特征 ，因此 认为 ， 尽管中药材为一复杂的混合物体系，它们的化学组成较为相似，但由于它的来源的不同，生长环境的不同，都会导致谱图的差异，根据红外光谱的这些特征 “ 指纹 ” ，可达到分类鉴别的目的。李海鹰等 （ 1995） 研究 表 明 ， 桔梗与霞草根红外光谱在 指纹区的吸收峰有较大差异，霞草根在 1310800 二个尖峰，而桔梗无吸收；在 500围内吸收峰也不同。另外，桔梗在 1620 收较弱，而霞草在在 1620 较强的吸收 。 肖如萍（ 1994）、 刘军等 （ 1998） 以桔梗总 皂苷 为对照品，将桔梗及伪品丝石竹氯仿提取液，分别点于硅胶 G 板上 ， 以氯仿 环己烷 (2： 3： 4)为展开剂 ， 以 25%磷钼酸乙醇溶液显色剂 ， 两个样品供试品在与对照品色谱相应的位置上有相同色斑的是桔梗 ， 没有相同色斑者是丝石竹根。 黄桂华 等（ 1998） 将桔梗和霞草粗粉甲醇浸出液分别点于同一硅胶 U 薄层板上，以乙 酸 乙酯 水 (14： 3： 3)为展开剂，用浓硫酸显色，桔梗提取液在薄层板上可见一黄红色斑点，而霞草提取液无此对应中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 3 的斑点。 a 等（ 1990） 对桔梗和党参这类含菊粉的植物进行了化学分类研究 ，比较了其菊粉晶体、树脂含量及 皂苷 和炔类化合物的薄层色谱指纹，结果发现 ， 尽管党参与桔梗的解剖学性状非常接近，但二者的化学性状在属和种的水平上有很大不同。 白质同工酶研究 杨久艳等 （ 1999）采 用聚丙烯酰胺凝胶电泳 对人参、西洋参和桔梗进行蛋白电泳 ，结果显示， 人参、西洋参和桔梗的电泳谱带有明显差异，有 各自的 特征谱带，该法能够鉴别三种药材 ， 且方法简便 ， 结果可靠。 李喜凤等 （ 2007） 对河南不同产地与年 生 桔梗的蛋白质、过氧化物同工酶、酯酶 同工酶 进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，不同产地与生长年限的桔梗，均显示 11 条谱带，且谱带位置颜色深浅是一致的，表明同一种桔梗药材的蛋白质电泳谱稳定性，不受产地与年限的影响，具有种特异性，认为蛋白质电泳是对桔梗进行鉴别是一种迅速有效的方法； 不同产地与生长年限的桔梗 ， 无论是过氧化物酶同工酶还是酯酶同工酶 ， 均具有相同的共有谱带 ,表 明它们具有相同的遗传背景 ,可作为桔梗的特征谱带 。 同时 ， 同工酶酶谱在数目和级别上又有所差异 ， 说明同工酶分析可用来鉴别从外部形态上难以区分的遗传变异 。 胞学 研究 染色体是植物基因的载体，其数目和形态是植物体内比较稳定的重要特征。 细 胞学标记主要有染色体核型和染色体带型分析两种方法。 染色体核型分析是对染色体的各种特征进行定性表述的一种基本方法，其主要内容有：染色体的数目和形态，染色体数目分析包括染色体基数、多倍体、非整倍体、 色体形态包括染色体的绝对长度、相对长度值、次缢痕 以及随机的数目和着丝点位置等特征，这些对于研究植物系统演化、物种之间的亲缘关系、起源、进化和分类，远缘杂交都有重要的意义。染色体带型分析其原理是借助于特殊程序，使染色体的一定部位出现深浅不同的染色带纹，这些带纹具有物种及不同染色体的特异性，每个染色体上的带的数目、部位、宽窄、浓淡具有相对的稳定性，是染色体的鉴别和结构功能的研究的重要工具。 把染色体分类学的方法和技术应用于中草药研究，可为药用植物及中药材的鉴定提供新的、比较稳定可靠的客观指标。 杨久艳等（ 1998） 对紫花桔梗根尖细胞中期分裂相染色体的观察表明， 桔梗的染色体数为 2n=18；根据 色体分类原则，通过臂比值，得出桔梗的 9 对染色体均为中部着丝点染色体，其中第六对具有随体 ，从而 得出桔梗的核型公式为2n=2x=18=16m+2m( 李国泰 （ 1998） 报道了桔梗染色体核型为 1B 型 ， 全部为中部着丝点染色体 ， 第 6 对染色体具有随体 ， 无臂比大于 2 的染色体 ， 核型公式为K(2n)=2X=16m+2 高山林等（ 2002） 对二倍体桔梗和 人工诱导 四倍体 桔梗的 根尖染色体鉴定表明，它们的染色体数分别为 2n=2x=14 和 2n=4x=28。 赵桦等（ 2004） 认为 ， 桔梗染色体核型为 1A 型 ， 无随体 ， 8 对中部着丝点染色体 ， 1 对近中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 4 中部着丝点染色体 ， 核型公式为 K(2n)=2X=16m+2无臂比大于 2 的染色体 。 王立平等 (2006)研究认为， 桔梗染色体核型公式为 2n=2X=6m(212没有发现B 染色体 ； 根据 的染色体分类标准 ， 3 对 染色体为中部着丝点染色体 ， 6 对染色体为近中部着丝点染色体 ， 第 6 号染色体具有随体 ， 核型不对称系数为 核型为 2A 型 ， 表现为较不对称性和较原始的特点 。 在染色体数目上，除高山林外，其他四位学者的结果一致，但 是，在核型上，李国泰与杨久艳的结果完全相同。与王立平、赵桦的结果不同。 可能是试验材料的不同所致 ， 但也不排除与试验分析方法有关 。另外，高山林的得出的 2 倍体染色体数目与 其他学者 完全不同， 可能是人工诱导过程中染色体数目发生了变异 。 魏建和 （ 2006） 研究 7 份种质材料的染色体核型，结果 7 份种质染色体数目基本一致，为 2n=18，均具 1 对随体，且位于染色体的短臂上。各种质染色体长度比、核型类型等差异小，但染色体的类型和位置有明显区别。 子 生物学研究 限制片段长度多态性 (随机扩增多态性 扩增片段长多态性(微卫星 等分子标记技术， 以 研究对象，在植物体的各个组织、各发育时间均可 检测 出 ，不受季节环境限制； 且标记 数量多，遍及整个基因组；多态性高，自然存在许多变异；许多标记表现为共显性（ 能够鉴别纯合和杂合基因型，提供完整的遗传信息（贾继增， 1996）。在药用植物种质资源研究中，应用最广泛的是 术，比较而言， 以下的特点， 引物具有通用性， 可以在受试物种缺乏任何分子生物学研究的背景下，直接对基因组进行多态 性 分析；操作简便，一次增实际上就是一次 应，适合大量样本的快速分析；所需 板少，一般一次扩增只需 5 50 对于珍 稀 濒危药用植物资源基因组的分析十分有效 （杜立新， 1995） 。 此技术 已经广泛应用于药用植物种质资源鉴定及亲经缘 关系分析（梁之桃等， 2002；吴霞等， 2003）。 魏建和等（ 2006） 采用 6 条 随机引物对桔梗栽培种质、野生种质及遗传材料进行了 纹研究，得到多态性条带 58 条 ， 所有种质的多态性位点比率 (P) s 基因多样性指数为 生和遗传材料中各份种质的基因多样性指数和多态性比率很低； 类和 类可以将各种不同来源的种质很好地区分开来。因此认为桔梗栽培种质在遗传背景来上为混 杂群体，纯系材料遗传背景均一，不同栽培产区桔梗种质已出现明显遗传分化。严一字等 （ 2006）利用 25个随机引物对 56 份来自不同国家和地区的桔梗种质资源进行 析，共扩增出 212 条带， 其中 104 条多态性带， 其多态率为 用 建立了56 份桔梗种质资源的亲缘关系树状图，结果表明 ， 56 份种质资源的聚类结果与地理分布几乎一致 。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 5 量评价 研究 龙绮群（ 1989） 对产于辽宁、河北、内蒙古、贵州的野生桔梗和产于河南 、 吉林、四川的栽培桔梗的总 皂苷 含量进行薄层析检测 表明 ，家种桔梗与野生 桔梗 总 皂苷 成分一致，而二年生家种桔梗较野生 桔梗 总 皂苷 含量高。 聂盛贤（ 1997） 对四川产桔梗与南、 北桔梗总 皂苷 含量进行了分析，认为川产桔梗中以梓潼产含量最高；与北桔梗比较，低于山东，高于辽宁；与南桔梗比较，高于安徽，与浙江桔梗无显著差异；巴中、中江桔梗总 皂苷 含量差异较小，明显高于辽宁、安徽，而次于山 东、浙江；盐亭桔梗总 皂苷 含量低于南桔梗，与北桔梗比较，低于山东，而与辽宁桔梗无显著差异 。 芦金清等 （ 2002） 将 湖北产栽培桔梗与野生桔梗进行了质量比较，结果显示，栽培桔梗与野生桔梗在外观性状及主要化学成分上无差异 ,薄层色谱相似 ，桔梗总皂苷的含量均符合中国药典的规定，且栽培桔梗总皂苷含量高于野生桔梗。高铁祥等 （ 2001） 对 野生 桔梗与栽培 桔梗 的止咳作用进行比较 ， 结果显示，野生桔梗与栽培 桔梗 对小鼠均有止咳作用 ， 两者之间无显著性差异；野生 桔梗 与栽培 桔梗对豚鼠均有止咳作用 。但 止 咳作用强弱有区别， 野生桔梗与 2 年生 栽培 桔梗作用强 ，但 两者无显著性差异。 又研究了 同一产地的桔梗野生与栽培 桔梗 溶血及止咳作用 ，结果显示，野生 桔梗 与栽培 桔梗 的溶血作用有差别 ， 其中野生 桔梗 与 2 年生 栽培桔梗 差别不明显 ， 野生 桔梗 与 1 年生 栽培 差别明显；两者均具有化痰作用 ， 野生品与栽培品化痰作用无显著差异。 因此认为 野生桔梗与 2 年 生 栽培桔梗的溶血及化痰作用无显著差异 （ 高铁祥等， 2001） 。 郑毅男 （ 1983） 利用比色法和高效液相色谱法，测定 野生紫花桔梗和栽培白花桔梗的总皂苷含量和桔梗皂苷 D 的含量，证明紫花桔梗总皂苷含量和桔梗皂苷 D 的含量均高于白花桔梗 ， 药理试验表明 ， 二者的功效基本一致 （张树臣等， 1984） 。 许传莲等 （ 1999） 应用 测定不同产地中桔梗 皂苷 D 含量 ， 结果显示 ， 不同产地的桔梗 ， 皂苷 D 含量有差异 。 以 吉林 长春桔梗中桔梗 皂苷 D 含量最高为 吉林 通化 的 含量最低为 这可能与桔梗的生长环境、年限等有关；东北地区桔梗 皂苷 含量 (华 中地区 (华北地区 (；紫花桔梗桔梗 皂苷 含量(高于白花桔梗 (近 60%，与郑毅男的研究结果一致 。 国外学者采用 种来自中国、 5 种来自韩国、 3 种来自日本的商品桔梗，来自日本的 8 种栽培桔梗和 3 种野生桔梗。共分离出 12 个峰。桔梗 皂苷 D、 A 和 C 在桔梗中含量较高且分离较好，因此可用于 评价 桔梗质量。计算不同来源桔梗的桔梗 皂苷 D、 A 和 C 的峰面积比值显示， 桔梗 皂苷 D、 A 和 C 的含量都很丰富 ， 来自中国样品比值为 1： 2：3，桔梗 皂苷 D 含量最高；来自韩国的样品比值为 2： 4： 1，桔梗 皂苷 C 的含量丰富；来自 日本桔梗比值为 1： 2： 1， 桔梗皂苷 A、 C、 D 的含量均很丰富 （樊雅莉译， 2000） 。 品种选育研究 (1)选择育种 t（ 1992） 从人工自花授粉的野生紫花桔梗后代中，获得 1 种淡红色用于观中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 6 赏的新品系 。 高文远 等 （ 1997） 从紫花桔梗中筛选出一种直立型和一种倒伏型桔梗，并对其植物学特征、物候期、产量及有效成分含量进行了比较，表明直立型具高产、优质、抗倒伏特性。 安徽省太和县高效农业开发研究所经过 6 年的时间，从自然变异单株中，通过系统育