【毕业学位论文】（Word原稿）血管活性肠肽真核表达质粒的构建及鉴定

第一部分 文献综述 血管活性肠肽 简介 血管活性肠肽 ( 是 一种由 28 个氨基酸组成的多肽， 20 世纪 70 年代早期由 1970)首次从猪十二指肠分离并命名。因一级结构和二级结构 的相似性 ， 认为是胰高血糖素 见表 1)。胰高血糖素 7 和垂体腺苷酸环化激活多肽 (8(et 1989; et 1990)，胰高血糖素 (et 1978)，胰泌素 (1968)，胰高血糖素类似肽（ et 1987)，生长激素释放因子 (1et 1982)和毒蜥素 ( et 1984)。 表 1 关肽的一级和二级结构 IP 源 5 10 15 20 25 30 8% 泌素 32% 高血糖素 21% 21% 25% 蜥素 54% 泛分布于中央神经系统的类胆碱突触前神经细胞和外 周 肽能神经细胞中 ，通过它可对 多种器官 进 行 神经支配，比如心脏，肺，消化系统和泌尿生殖道，眼睛，皮肤，卵巢和甲状腺 (et 2000)。 中枢 和 外周 神经系统中是一种重要的信号肽，在生物体 内涉及到多种 生物学功能 (et 2006)，包括 参与 新陈代谢 、 外分泌和内分泌 、 细胞分化和平滑肌 舒张 (1991)、 激素分泌 (et 2001)和免疫应答调控(et 1999)。基于它的多种生物学功能，血管活性肠肽 (认为是一种对多种疾病包括糖尿病，哮喘，阳 痿和风湿 有治疗 前 景的药物候选物 (2003; 2004; et 2006)。 管活性肠肽的结构 一种 由 28 个氨基酸组成的直链小分子神经肽，相对分子量 为 3323 于胰高血糖素 因长度为 88371987)，定位 于 第 6 号染色体长臂 近末端处 ， 成熟的 由 170 个氨基酸组成的前激素原经剪切得到。 管活性肠肽的来源 要是由外周神经和中枢神经系统产生，由副交感 神经节后纤维释放，并且与乙酰胆碱共同存在 (文卫东等， 2000)。内分泌细胞和胃肠粘膜分散的神经中也存在 合成与释放，另外分泌 经纤维在生物体内的大部分淋巴器官中也有发现 (胡满等，2000)。许多与免疫有关的细胞，如嗜酸粒细胞、肥大细胞和多形核细胞等也会产生少量外，如结肠癌细胞和胃癌细胞等肿瘤细胞，也可自分泌一定量的 翁跃颂，2006)。 体内由肝脏分解，肾脏排泄，在体内循环中的半衰期是 1钟，正常时无法起到循环样激素的作用 (1998)。 管 活性肠肽在体内的分布 最初 从 小肠中分离出 后，又在各种淋巴组织及 外周 和中枢神经系统 ， 消化系统和心血管系统中发现 存在 (姚泰， 2001； 李国华 ， 侯晓华， 2003； et 2003; 1998)。 在外周神经系统中 ， 要分布 于 泌尿生殖道、泪腺、胰腺、胃肠道、肺、心等器官中 (et 1984)。 体内广泛分布 ，但其 浓度在体内不同部位存在差异。在胃肠道中的 量最高 ， 外周神经末梢和中枢神经中 次之 ，外周血中 量最低（ 喻召才等， 1999）。外周血中 浓度显著低于垂体门 静 脉血 (et 1995)。 管活性肠肽的受体 血管活性肠肽（ 垂体腺苷酸环化激活多肽 (受体是 G 蛋白偶联受体的一种，是由 3 个细胞外 ( 旋和 3 个细胞内 ( 旋连接的 7 次跨膜结构域， 以及 一个长 N 端细胞外结构域和一个 C 端细胞内结构域 构成 。迄今为止，已有 3 种类型的 体 被克隆和分类，分别为 et 1998)。 于 着 相同的亲和力 ( 1 主要通过腺苷酸环化途径激活。 较高亲和力 ( 0.5 是对 亲和力较低（ 500 时具有腺苷酸环化酶活性和磷脂酶 C 活性 (2007; 2009; et 2009)。 3 种受体在 不同的组织和器官中表达存在差异 。 达于大脑（脑皮层和海马体）和周边 组织如肝、肺和肠， 在免疫细胞中 也有 表达。 达于中枢神经系统 (主要在丘脑和神经叉上核，在海马体、脑干、脊髓和背根神经节低水平表达 )，并且在许多 外周 组织中表达，如胰腺、骨骼肌、肺、心脏、肾脏、脂肪组织、睾丸、胃、血管和生殖系统。 要存在于脑部 (大脑嗅球、丘脑、海马体、海马体齿状回和小脑 )，并且存在于肾上腺髓质中。这些受体的广泛存在表明了 括 中枢 神经系统 ( 外周 组织 在内的许多器官都会产生影响 ，。 管活性肠肽的生物学功能 初被认为 是一种存在于肠道的激素 ，直到 1976 年在中枢和外周神经系统中发现了 疫反应阳性现象，才开始认识到 一种神经递质 (et 1976)。 随着 对 究 的 深入 ， 发现 生物体中的 有多种生物学功能。比如，在神经系统中作为神经递质；在消化系统中作为胃肠激素；在免疫系统中， 与 免疫细胞相 应的受体结合，产生免疫效应 (王轶等， 2008)。但是在血浆中， 度低且 迅速降解。由此可以看出 旁分泌 起 局部作用的一种激素 ，而不是一种 循环激素 (楚更五， 2000)。 管活性肠肽的胃肠道激素功能 经元按其功能的不同可分为分泌神经元与运动神经元，分泌神经元可以调节肠胃吸收，保护肠黏膜，刺激肠液和胰液分泌；运动神经元 能够 则可以 舒张胃肠和括约肌 (赵智强等， 2006)。 胃肠道中主要以神经递质的形式发挥局部作用， 可以 舒张血管和松弛平滑肌、促进肠道内的电解质和水的转运、促进吸收和分泌，还可以刺激小肠液和胰液的生成 (2001)。 胰泌素 可以 刺激胰岛释放出胰岛素，释放肝糖 ， 抑制胃酸的分泌，在短时间内将血浆葡萄糖水平升高 (李寻等， 1990)。 管活性肠肽的神经肽功能 够 激活脑组织的 升高体温 、 引起觉醒效应； 它还 能 刺激胰高血糖素、生长抑制素、黄体生成素、生长激素等激素 的 释放； 参与 调节人体的昼夜节律 ，并在外周神经中起到神经递质的作用。对于控制心房心律不齐的迷走神经， 样 起到了重要的作用 (胡仲明，柳巨雄， 2003)。 大量研究表明， 5节 作用 (et 2000)。 是一种 催乳素释放因子 ， 具有调节催乳素释放 的作用 (et 1989)。也有研究证明，在星形胶质细胞和神经元中 作用 是转导信号， 它 可 以 有效地保护星形胶质细胞 (2000)。 管活性肠肽的免疫功能 能由淋巴细胞产生，并在外围淋巴器官和中央淋巴器官中起到旁分泌的功能，说明 与了免疫系统和神经系统的双向通讯。 为免疫调节肽，其受体基因在中央淋巴器官和外围淋巴器官中 都有 表达 (1994)。 它 可以很好地调节机体免疫，尤其是 在 局部粘膜免疫的 调节 方面 (王伟，李伟毅， 2005)。 以通过对辅助性 T 淋巴细胞 ( 腺苷酰磷酸胞嘧啶核苷 (效应细胞 的 作用， 调节多种 胞特异性因子 的 水平 ， 同时 还 抑制 表达、阻止由抗原诱导产生 的 胞克隆的清除，帮助局部产生记忆 胞， 有 效 抵抗存活细胞的细胞凋亡，因此在体内外 使 后 向 胞分化，之后产生以 主的免疫应答 (张 松照，2005)。 许多研究表明，淋巴细胞尤其是 T 淋巴细胞 (径 )的活动明显受 抑制。可以调节胸腺细胞的成熟、分化和增殖 。 还有研究表明， 一定程度上可以影响免疫细胞的迁移、附着以及生物体 内的 再分布 (et 2000)。 管活性肠肽的主要生理作用 管活性肠肽对胃肠道的作用 为促胰液素族成员， 它 对胃肠道起到 着 不可忽视的作用。 它可以 有效促进胰岛素的分泌 ，同时也 能 抑制胃蠕动和胃 酸的分泌。 刺激胰腺使其分泌碳酸氢盐和水分，这种作用和促胰液素相类似；它还能促进脂肪和糖元的分解，升高血糖； 刺激小肠上皮分泌 上 也拥有无法替代的作用， 它可使 肠液 电解质的分泌明显增加 (胡仲明，柳巨雄，2003)。 普遍认为 胃肠道平滑肌 具有 舒张 作用 。 管活性肠肽对心血管系统的作用 很多研究结果表明中枢神经系统和外周神经系统中的 刺激 迷走神经能够 使其 释放 静脉注射 以强烈 地 降低血压和舒张血管 (李 莲军等， 2001)。此外， 生理学作用 还 包括 使 心率加快、 增加 血管 的 通透性以及增强心肌的收缩力。研究还发现 心脏和动脉血管有较强的收缩作用， 它可以 降低血压并促进全身血液的流动，以及降低外周血管的阻力 (杨钢， 1996)。 一种内源性的血管舒张剂。一定生理剂量的 药于骨骼肌、消化腺、汗腺、肺和肾脏 ，可对这些部位 的血管产生舒张作用，还观察到脑和心在使用了生理剂量的 舒张血管并随血管的紧张度升高作用增强。肾上腺素能受体和胆碱能的阻断剂 对 张血管的功效没有影响，所以作为血管的舒张剂 非胆碱能、非 肾上腺素能的，胆碱和异丙肾上腺素对血管的舒张作用强于 作用时间要长于胆碱和异丙肾上腺素 (et 2000)。 管活性肠肽对肿瘤生长的影响 于一部分肿瘤的生长具有促进作用。陈潜 (1994)等发现带有 体的胰腺癌细胞生长在 10-6 和 10-7 时得到 明显的促进。 (2000)发现使用核素肿瘤受体 显像 时 ， 胃癌原发灶的 体检出率为 100%。 (1991)证实 100-5 的 外源 性 促使不同的胃癌细胞细胞株生成 是对于的 它们 生长并没有明显的影响。 管活性肠肽对于免疫 的影响 为一种免疫调节分子有着重要的作用，当存在强烈的致病因素诱导时， 主要免疫功能就 体现于它的抗炎作用 。当不存在强烈的致病因素诱导时，未成熟的树突状细胞在 诱导下成熟， 免疫应答得到促进，通过产生抗体提供保护作用，从而避免了急性炎症的诱发。 抗炎作用是通过抑制重要的前炎性细胞 (比如中枢神经系统中的小胶质细胞、巨噬细胞 )产生趋化因子和细胞因子，成熟后的树突状细 胞抗原呈递功能通过抑制共刺激分子的表达而受到抑制，并抑制炎症部位的 胞的聚集和促进胞的迁移，从而防止了慢性炎症的发生和促进了急性炎症的消退。还有一点 就是 ，过耐受型树突状细胞发挥诱导作用诱导抗原特异性免疫耐受。由于树突状细胞能否有效地将抗原呈递给 T 淋巴细胞直接受到其在体内的迁移过程的影响，免疫应答的发展和发生从而也受到影响，因此，关于树突状细胞免疫受 调节作用的一个重要方向就是对于树突状细胞趋化因子与其受体的表达受到 调控。 管活性肠肽在免疫细胞的表达和内源 性 在淋巴器官中 两个不同的来源，也就是自身神经系统和免疫细胞本身。 淋巴组织中的 要来源于其本身的免疫细胞 。免疫细胞特别是 细胞表达 加工 前体和分泌 熟肽。产生 多的是 2 细胞，用来应答抗原刺激 (2001a, 2001b, 2001c)。有趣的是 ， 中性粒细胞和肥大细胞分泌的 段 ( 体 不起到 信号 作用， 但在最近被发现具有抗菌活 性 (et 2008; et 2009)。 由免疫细胞生成的内源性 调控方面起着重要的作用。早期的研究表明 败血症和类风湿性关节炎 中 高 很可能是在试图抑制免疫反应 (et 1989; et 1994)。在患有自身免疫性甲状腺炎和红斑狼疮的病患体内，存在低水平的高水平的 ，这些现象都表明了 平降低可能导致疾病的 发展 或加剧(et 2003)。 体内 乏的 小鼠对脂多糖 (发的败血性休克更为敏感，并且更容易发展为支气管哮喘和肺部高血压，它们有更高数量的免疫细胞 浸润 ，并在支气管肺泡灌洗液中有更高水平的促炎细胞因子 (et 2006; et 2006)。这 一结果 与之前发现的外 源性 少促炎细胞因子和趋化因子的产生 ， 使 非特异性 免疫细胞特别是巨噬细胞失活 相一致。 管活性肠肽在炎症和自身免疫性疾病中的作用 限制炎症和免疫 应答 的进行 中 起 到了 重要 的 作用 ， 并能促进炎症的识别。 使用外源 性 疗 很多 病理 实验模型 可 以减少发病频率及减轻症状的严重程度 ，如败血症、胰腺炎、肝炎、呼吸道炎症性疾病、神经变性失常、类风湿性关节炎、炎症性肠道疾病、 型糖尿病、多发性硬化症、 肖格伦综合征和自身免疫性葡萄膜视网膜炎。在以 恶化 的炎症反应为特点的疾病中， 有益影响表现为 可 在全身或局部范围内 广泛 下调炎性细胞因子、趋化因子和氧化应激 介质的水平 。 过抑制小神经胶质细胞的激活 ， 对神经变性如脊椎损伤 (et 1999; et 2000)、脑创伤 (2003a, 2003b, 2003c; et 2007)和帕金森综合症 (2003a, 2003b, 2003c; et 2006; et 2010)也 同样 具有治疗作用 。 在自身免疫性疾病中， 治疗效果 与 引发自身免疫的早期 炎症反应的 下调 和 对慢性激活的 晚期 炎症反应 的 下调 紧密相关 。在体内， 弱自身反应 胞 的发育和它们向靶 器官 的迁移 ， 减少 促炎细胞因 子和趋化因子 的 释放， 导致 巨噬细胞和中性粒细胞 的 召 募与 激活 下降 ，并且诱导 产生 。 T 细胞分化和功能的影响 是 直接或间接的通过树突 状 细胞的免疫调节完成。 管活性肠肽在炎症和自身免疫疾病方面的应用 治疗炎症、自身免疫性疾病方面 有 广泛 研究， 主要 集中于 治疗感染性休克、炎症性肠病和类风湿性关节炎 和 一些其他的炎症 。在治疗 自身免疫性疾病方面 ，有报道采用制 T 细胞的增殖和 产生等 ， 从而对肉芽肿的形成进行调节 (991)。抑制肺组织中的 活性，阻止肺上皮细胞 的 凋亡，还可 抵 抗肺部的氧化和炎症状态，保持气道、肺部上皮的完整性 。 治疗肺部疾病如急性呼吸窘迫症等具有重要的意义 (000)。 对于 其 它 具有自身免疫和慢性炎症表现的疾病如多发性硬化和糖尿病等的防治上 ， 样被认为 是有 价值 的 (et 2003)。 感染性休克是一种临床常见疾病，导致休克的急、慢性炎症主要由革兰氏阴性菌感染所引起。其他类型的细菌、霉菌、原虫及病毒也可引起这种感染。在感染性休克 时， 促炎因子 通过 抑制血液中的 升高抗炎症因子如 平防止感染性休克发生。 炎症性肠病 (为一种慢性疾病其主要 表 现为肠道炎症，包括克隆氏病 (溃疡性结肠炎 (在 病的作用中免疫学因素已得到肯定并已有深入的研究，特别是粘膜的固有免疫和神经肽的免疫调节方面 (et 1996)。 (1994)研究指出类神经肽如 水平 ， 从而 发挥了 保护性粘膜固有免疫调节 功能，因此 以用于慢性 治疗。 类风湿性关节炎 (一种对人类健康严重威胁的自身免疫性疾病，其主要临床表现为骨和软骨破坏以及慢性对称性多关节炎，骨及关节软骨破坏、炎性细胞浸润、滑膜增生、功能丧失甚至残疾是其最显著的病理特点。 发病机制目前尚不清楚，但是自身免疫和炎症反应已被证实是引起骨和软骨损伤及类风湿性关节炎 (两大主要因素。以通过对炎症和自身免疫这两条途径的下调有效防治类风湿性关节炎 (et 2001d)。 清抵抗素 血清抵抗素 (一种肽激素，它以分泌蛋白的形式出现， 富 含 半胱氨酸，是因的编码产物，在人体内是一段 108 个氨基酸的前肽，在分泌前被剪切 形成抵抗素 。在外周血中的抵抗素主要是以二聚体结构存在，其二聚体结构是由两段 92 个氨基酸构成的多肽组成，这两段多肽通过 二硫键连接。抵抗素很可能就是 胰岛素 抵抗和 肥胖 之间的重要联系。小鼠体内的血清抵抗素在脂肪细胞、骨骼肌细胞和干细胞中发挥功能，使这些细胞对胰岛素的 敏感性 降低，小鼠的血 清抵抗素 由 脂肪细胞 产生和分泌。 抵抗素 可抑制 胰岛素 刺激 的糖摄取 ， 血清抵抗素的含量在 肥 胖 小鼠体内有所提高，在使用抗糖尿病药 物 或者对小鼠禁食后抵抗素含量会降低 (et 2009)。 清抵抗素的表达调控 甾体类激素、神经肽 Y、高血糖、生长激素等 可诱导 抵抗素 组织或脂肪细胞中 的 表达 ，衰老因素也具有相似的作用 。空腹、内皮素 状腺素、异丙肾上腺素和肾上腺素 可以使抵抗素的表达受到抑制 。 与 炎症和动脉粥样硬化 密切相关的 因素 对于调节人单核巨噬细胞中 抵抗素的表达具有重要的意 义 (et 2009)。 清抵抗素与胰岛素抵抗 抵抗素 可降低 一些细胞 ，如 脂肪细胞、骨骼细胞和肝细胞 对于胰岛素 的 敏感度 ，从而诱发胰岛素抵抗，进而可 导致糖耐 受 量降低，空腹血糖含量升高 (et 2007)。 在 7 天后 ，随着血清中抵抗素水平的升高， 抵抗素过表达 的 小鼠葡萄糖灌注率降低13%肝糖的输出降低 27%游离脂肪酸的水平被胰岛素抑制降低了 7%，存在胰岛素抵抗现象。一些组织中 如 骨骼肌、肝脏和脂肪组织中的蛋白激酶途径的激活 受到显著 的抑制。血清抵抗素 可以 引发胰岛素的全身抵抗，从而导致慢性高胰岛素血病症与高三酰甘油血病症。 人的胰岛素敏感性和人血清抵抗素呈现出 显著 负相关性，抵抗素引发胰岛素抵抗 (张望，张健， 2007)， 其可能的机制是抵抗素可以减弱胰岛素刺激的脂肪细胞摄糖作用从而引发胰岛素抵抗 。并且，在抵抗素高度表达的动物模型中，骨骼肌和肝脏对葡萄糖的摄取可以被高抵抗素血症减少，使骨骼肌细胞和肝脏细胞中的胰岛素的信号转导途径减少，这包括了使 活减少， 活减少， 酸化及蛋白含量减少 (et 2006)。这些说明了，在骨骼肌、肝脏及脂肪组织中 ，抵抗素作为一种信号，使胰岛素作用下的葡萄糖摄取减缓从而减弱了胰岛素的作用，引发了 胰岛素抵抗。 清抵抗素与炎症 近年来研究已经表明 ， 炎症因子和血清抵抗素的关系呈现出正相关性， 并认为 炎症状态就是一种抵抗素水平升高的状态。在外周单核细胞有血清抵抗素的表达，当使用诸如内毒素等炎症刺激因子作用于外周单核细胞时，可以检测到抵抗素表达水平显著升高，在急性内毒素败血症患者体内的血清抵抗素含量可提高达正常值的七倍 (章建梁等， 2009)。类风湿性关节炎患者 体内有血清抵抗素的聚集，其聚集在患病者的关节腔内，并且炎症指示物的水平与血清抵抗素的含量 之 间具有关联 (杜娟 和 王纯莹， 2007)。 清抵抗素与高血压 人体胰岛素抵抗是肥胖、高血压、糖尿病等疾病发病的基础。但是高血压与血清抵抗素之间的关系还不明确。研究表明 (李志臻，傅祖植， 2006)，血清抵抗素非编码区部分基因的单核苷酸 多态性与许多因素有关，这些相关因素包括肥胖、腰围、胰岛素的敏感性和高血压等 (刘玉岚等， 2006； et 2008)。还有研究表明，脂肪细胞的活性能够 显著 的被某 些 高，这和细胞的氧化应激存在着潜在的关联。肥胖和 型糖尿病的引发有可能和血清抵抗素的分泌水平 升 高有关。血清抵抗素的表达、分泌和功能受到血清抵抗素基因的多态性影响，从而影响到糖尿病的病发，因此胰岛素的敏感性也可以间接或直接的受到影响，从而与糖尿病和高血压产生了联系。 清抵抗素与动脉粥样硬化 许多的研究结果显示，动脉粥样硬化是由白介素 肿瘤坏死因子 白介素 一些炎症刺激因子参与形成，在动脉粥样硬化的发生与发展过程中，这些炎症刺激因子起 到了重要的作用。同时人单核细胞的抵抗素 达水平也可以被这些炎症刺激因子上调，这表明 了这些炎症刺激因子影响到动脉粥样硬化的另一个机理就是调节抵抗素 表达 (et 2009)。 动脉粥样硬化是一种具有炎症表现的慢性疾病，动脉粥样硬化斑块是许多因素相互作用引起的，这些因素包括了单核 /巨噬细胞、内皮细胞、 种细胞因子、生长因子。炎症因子能够显著 地 诱导血清抵抗素的表达 ，同时和动脉粥样硬化有关的炎症 过程也有血清抵抗素的参与，从而引发了一系列的生理和病理结果。研究发现血管壁的主要成 分如核 /巨噬细胞和内皮细胞等均直接受到血清抵抗素的作用从而促进动脉粥样硬化。动脉粥样硬化相关的病理形成过程也可能有血清抵抗素的参与 (张远梅， 2012)。 管活性肠肽对血清抵抗素的作用 近些年来 有 研究证实， 自身炎症和免疫调节方面发挥着极其重要的作用(2001)。血清抵抗素作为一种脂肪因子 具 有促进炎症的功能。血清抵抗素的基因可被 过一系列的级联反应诱导表达，这一系列的级联反应包括了分泌促进炎症的细胞因子。 有调节免疫和抗炎的作用， 通过其 受体 以 显著下调由 导的急性炎症状态下产生的促炎因子血清抵抗素 (水平 (谢珊珊等， 2009； et 2009)。 题的提出 有广泛的生物学活性 ， 提示 有广阔的临床应用前景。 但 是，到目前为止只开 展了 少数临床实验。 床 应用的 一个主要障碍 就 是 它 在在体内 受到蛋白 酶 作用 、抗体 中和、 自发水解而 半衰期很短 ， 这使 体内半衰期 不足 1 分钟。 尝试提高 稳定性的方法， 包括 对其母体进行化学修饰、使用稳定的 体激动 剂或 似物、 肽酶抑制剂组合使用或将 确地嵌入到微粒或纳米粒子中 (et 2010)。 氨基酸的化学修饰或替换作为一种常用的方法早已被提出并用来增加神经肽的稳定性 (er 2010)。 他的同事最近得到了两个 衍生物具有相当可观的稳定性 (在 40 超过 60 天 )，它被做成可吸入的粉末制剂在哮喘和慢性阻塞性肺病 (型上具有一定功效 (et 2009; et 2010)。但是这些 衍生物在治疗其他疾病上面受到了限制。之前也有提出使用微胶粒或脂质体包埋神经肽使其在体内缓慢释放，近期这种方法也被用于 体内抗炎模型的应用上(er 2009)。然而这种脂质体包埋的神经肽进入目标器官受到了其颗粒大小的限制。为了克服这个潜在的问题，一个近期的研究描述了一种将 埋于由银保护的纳米粒子，它的功能和体内固定 小神经胶质细胞相类似 (2009)，这项研究第一次提供了使用金属纳米粒子对神经肽靶向给药的资料，但是在炎 症状态下的基于纳米粒子的治疗效果还需进一步证明。虽然已有多种延长 体内半衰期的方法，但是仍需找到一种简单、经济且安全可靠的方法。 人血清白蛋白 (为人血清的主要成分，对体内血浆体积和渗透压的维持起到了至关重要的作用。 分子量为 非糖基化蛋白，它具有非常低的肾清除率，在人体内的半衰期为 1420 天。 体内常作为体内因子和药物的转运的载体。所以， 以作为小分子蛋白在血液中的载体从而延长小分子蛋白在人体内的半衰期 (唱韶红等， 2006)。 的研究发现，通过克鲁维氏酵母表达的合蛋白在以家兔作为动物模型的实验中，其半衰期达到了 体的 140 倍(et 1992)。通过维氏酵母表达的 的半衰期在猕猴体内比8 倍 (et 2002; et 2003)。 为了延 长 体内的半衰期，我们希望通过构建重组 表达载体，将 连，从而延长 体内的半衰期。之后将表达载体转染入 胞表达得到 目标 重组蛋 白。 目前， 要的临床应用是 对治疗炎症、感染性休克 、 自身免疫性疾病方面。 血清抵抗素作为一种脂肪因子 具 有促进炎症的功能。 有调节免疫和抗炎的作用， 通过其受体 导 可以 显著下调由 导的急性炎症状态下产生的促炎因子血清抵抗素 (水平 (谢珊珊等， 2009； et 2009)。 因此，我们考虑 利用 征 重组 血管活性肠肽（ 融合 蛋白的生物活性。 文献显示 (谢珊珊等，2009)，在给体重 20 g 左右的小鼠按照 5 g/g 体重注射 以使小鼠体内的血清抵抗素由正常的 10 g/L 左右升高至 35 g/L 左右，当 同作用时可以使小鼠体内血清抵抗素降低至 5 g/L 左右 。我们给小鼠注射 其血清抵抗素 被 诱导升高，再给小鼠注射重组 白，收集小鼠血清，使用小鼠血清抵抗素 剂盒检测小鼠血清中的抵抗素含量，希望通过注射重组 白能够降低其被 导升高的血清抵抗素含量，从而验证重组 白的生物学活性。 同时对小鼠进行行为学的观察，用来辅助评价 组蛋白的生物学活性。 第二部分 重组血管活性肠肽克隆的 构建及表达 为一种重要的小分子 信号肽，在生物体 内涉及到多种 生物学功能 (et 2006)。 基于它的多种生物学功能， 认为 在 对多种疾病 如 糖尿病，哮喘，阳痿和风湿 等的 治疗 上 都 具有广阔的前景 (2003; 2004; et 2006)。 但是由于 体内的半衰期不到 1 分钟 (1998) ，它在应用方面受到了限制。目前采用 化学修饰、使用稳定的 体激动剂或 似物、 肽酶抑制剂组合使用或 将 埋到 微粒或纳米粒子中 (et 2010)，但这些方法都具有一定的局限性。 为载体蛋白延长小分子蛋白在血液中的半衰期是目前的一种通行技术 (唱韶红等， 2006)。许多相关研究已表明 小分子蛋白的融合蛋白在体内的半衰期相比小分子多肽单体延长了数倍 (et 1992； et 2002; et 2003)。 本实验将构建以 为载体蛋白的 合蛋白克隆表达载体，我们将 段通过一段 连接肽连接并插入到 体上，筛选出正确克隆后转染 胞，表达得到目标重组蛋白。 验材料 验仪器 移液枪、超净工作台 (安泰 )、磁力搅拌器、微波炉、高温蒸汽灭菌锅、 低温冰箱(超纯水仪 (制冰机、离心机 ( 恒温金属浴、恒温振荡培养箱 (上海一恒 )、 ( 台式冷冻离心机 ( 电泳仪 (伯乐 )、 00 型凝胶成像仪 (。 段与载体 本实验所用质粒 美国 司产品 (图 1)，带有 本 实验室 储藏 (图 2)。带有 段的质粒为华大基因公司全合成 。 图 1 粒图谱 2 粒图谱 片段 2196 个碱基组成，其序列如下： 合成的 段带有 酶切位点，全长 114 序列如下： () 种及细胞株 大肠杆菌 胞株均为实验室已有。 游引物 ： 游引物 ： 主要试剂 本实验所用到主要试剂见表 2。 表 2 主要试剂 剂名称 公司名称 司 司 司 合酶 司 合酶 司 接酶 司 司 司 司 柱式质粒 量抽提试剂盒 生工生物工程有限公司 柱式 回收试剂盒 生工生物工程有限公司 柱式 物纯化试剂盒 生工生物工程有限公司 酵母提取物 粒 量提取 试剂盒 司 氨苄青霉素 生工生物工程有限公司 普通试剂如 琼脂糖 、甘油、无水乙醇、 白胨、 于国内试剂公司 。 要溶液的配置 按照表 3 称取蛋白胨、酵母提取物和 900 馏水，置于磁力搅拌器上充分溶解，用 1 N 的 定容至 1000 入高温蒸汽灭菌锅中 121 灭菌 20 分钟，冷却后保存于 4 备用。 表 3 养基的配置 B 养基 蛋白胨 酵母膏 馏水 B 培养基（ 1 L） 10 g 5 g 10 g 1000 B 体培养基的配置 配置好 体培养基，灭菌，冷却后在无菌工作台内将氨苄青霉素 (入到 氨苄青霉素终浓度为 100 g /匀后保存于 4 备用。 体 配置好 体培养 基并调完 ，向 100 B 液体培养基中加