【毕业学位论文】（Word原稿）BYDV-GPV与GAV混合侵染蚜传专化性研究植 物 病 毒 学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 合侵染蚜传专化性研究 on of PV AV on of PV AV i 摘 要 小麦黄矮病是麦类作物的重要病害之一。普通小麦种质资源中未筛选到抗性材料， 基因工程育种是培育抗病品种的手段之一 。病毒的外壳蛋白（ 因介导的抗病性在抗病毒基因工程育种中研究最早、应用最广泛的。我国也已获得抗 小麦转 因的材料，但抗病毒转 因植物带来的 病毒外壳 蛋白的异源装配及 组等 生态安全性问题也越来越受到关注。本研究对大麦黄矮病毒（ 间混合侵染的蚜传特异性与分子变异进行探索，旨在为小麦抗病毒基因工程的生态安全性评价体系建立一种可能的模式。 以我国麦区的大麦黄矮病毒流行株系 材料，利用它们的蚜传特异性，将由禾谷缢管蚜（ .， 播、 麦长管蚜（ . ， 能传播 的由麦长管蚜传播、 禾谷缢 管蚜不能传播 的 合侵染到岸黑燕麦上，观察发病情况。对混合侵染的病株再用禾谷缢管蚜和麦长管蚜继代传毒，系统观察 介体专化性的变异 。蚜传实验结果表明：在 获得的 93 株独立的混合侵染蚜传体系中，有 16 株在继代传毒中发生了蚜传专化性的改变， 占总数的 蚜传表现型的变化说明可能存在异源包装现象。 采用 对 混合侵染后代进行了测定，结果表明： 69 个混合侵染后代样品均与美国的 血清有强烈的特异性反应，无论麦长管蚜传毒株还是禾谷缢管蚜传毒株，均传播的是 一步证明了存在异源包装现象。 根据已报道的大麦黄矮病毒 外壳蛋白基因序列、通读蛋白（ 因序列设计了六对特异性引物， 用 术对 12 个 混合侵染后代的检测结果表明： 用 因引物从其中 6株中扩增出了目的基因片段；而用 P 与 毒株可扩增出 检测不到 明在所测定的混合侵染后代中存在异源包装。部分侵染后代的 长管蚜 传毒株还是 禾谷缢管蚜 传毒株，均未 发现异常序列，仅有几个碱基的差异。初步认为所测定的混合侵染后代中没有发生基因重组现象。 本文还探讨了大麦黄矮病毒 酸斑点杂交检测技术。 关键词： 小麦黄矮病 混合侵染 介体专化性 异源装配 is of To is of no in or so In To of to of is to PV AV of PV in to be as a of of In is .( . (AV is a, p. In PV AV by p a， 3 16 in PV in in of 9 of P a，in of on P TP of 12 of of PV AV P 2 no TP 2 no be NA of p, so PV AV in 9%. no NA in In NA AV P to (, i 目 录 第 一章 引言 . 1 1 大麦黄矮病毒的研究进展 . 1 2 抗病毒转基因植物的风险性 . 8 3 本研究的目的意义、主要内容及技术路线 . 11 第二章 . 13 1 材料 . 13 2 方法 . 14 3 结果与分析 . 15 4 讨论 . 25 第三章 . 26 1 材料 . 26 2 方法 . 27 3 结果与分析 . 31 4 讨论 . 33 第四章 . 34 1 材料 . 34 2 方法 . 35 3 结果与分析 . 41 4 讨论 . 42 第五章 P 与 . 43 1 材料 . 43 方法 . 44 3 结果与分析 . 45 4 小结与讨论 . 51 第六章 结论与讨论 . 52 参 考 文 献 . 54 缩 略 词 . 61 致 谢 . 63 作 者 简 介 . 64 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 1 大麦黄矮病毒的研究进展 大麦黄矮病毒（ 一类归属于黄症病毒科（ 正义单链 毒。它的寄主范围广泛，可侵染 150 多种单子叶植物，特别是大麦、小麦、燕麦、水稻等多种禾谷类作物（ 1970a）。所引起的麦类作物黄矮病，最早见于 1951 年在美国加利福尼亚的报道，此后陆续在世界各国麦区发生，逐渐成为一种全球性的病毒病害。每年，此类病毒对世 界粮食生产造成一定程度的危害，大发生时会造成严重减产。迄今为止，这类病毒在小麦上没有抗病品种，培育抗病品种是黄矮病工作者长期以来的研究目标。除此之外，大麦黄矮病毒的基因表达机制、进化与功能以及传播介体和寄主的作用机制，一直是病毒界人士的研究热点。 麦黄矮病毒的生物学特性 对称的球形病毒，由蚜虫以持久性非增殖的方式传播、并在感染植株的韧皮部组织中增殖。寄主韧皮部组织受感染的病理变化常表现为叶片黄化或变红和卷曲、矮化。 1971）根据明显的介体专化性将美国纽约的 分为 5 个不同的株系： 禾缢管蚜（ 麦长管蚜 (非专化性传播； 麦长管蚜 (化性传播； 麦二叉蚜 (化性传播； 禾缢管蚜 (化性传播； 玉米蚜 (化性传播。周广和等（ 1986、 1987）鉴定出我国大麦黄矮病毒的 4 种主要株系，即由麦二叉蚜、禾谷缢管蚜非专化性传播的 麦长管蚜和麦二叉蚜非专化性传播的 麦二叉蚜、禾谷缢管蚜和麦长管蚜非专化性传播的 及由玉米蚜传播的 中 美国的 5 种分离物均无血清学关系，为我国特有的株系类型。 属尚未确定，它与 清学上非常近似，主要差别在于比后者多一种传播介体。 麦黄矮病毒的分类学 1975 年 人将黄症病毒首次正式列为一个独立的组，其成员包括 系，甜菜西方黄化病毒（ 大豆矮化病毒（ 986）。随着植物病毒鉴定和分离、提纯技术的发展，有关 分类研究已经历几个不同的阶段。起初，这类病毒变异株的划分主要依据是蚜虫传播特异性、寄主范围与反应类型、对寄主毒性等生物学特性。后来获得病毒的多克隆抗体，乃至单克隆抗体后，人们可以根据血清学反应进行鉴定并区分病毒之间的相互关系。根据细胞病理学差异及血清学关系， 分成两个亚组：亚组 I 和亚组 组 I 包括 系，亚组 括 系。随着分子生物学的发展，特别是病毒基因组核酸序列的测定，通过核酸杂交、基因同源性分析以及基因组结构比较，进一步证实 两个亚组之间的差异。许多证据支持将大麦黄矮病毒中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 2 划分为两种病毒，甚至分属于两个属。特别是对基因组结构、非结构基因、顺式作用信号的研究表明亚组 接近。另外，它们之间在基因功能、表达机制、复制策略以及是否支持卫星 能力等方面的差异也说明这一点。近年来，国外 已完成 分离物（株系）基因组全序列或部分序列分析。随着研究的深入，基因组序列和结构的日益清楚，其分类也出现新的变化。根据 第七次报告， 某些株系已升格为种并被归属于黄症病毒科（ 黄症病毒属（ 马铃薯卷叶病毒属（ 其中黄症病毒属目前已确定包括 个种，而于马铃薯卷叶病毒属。其它 成员，如 尚未明确归属。 壳蛋白基因核苷酸和氨基酸序列与 源性很低，与 同源性相对较高（核苷酸和氨基酸的同源性分别为 ，但两者却无血清学关系（成卓敏等 , 1996）。 壳蛋白基因核苷酸和氨基酸同源性比 要高，很可能是马铃薯卷叶病毒属的成员。本实验室已完成了对 基因组核苷酸全序列的测定，同源性比较结果显示，它与 离物氨基酸同源性最高，全基因组为 晋治波等， 2003）。近来，在印度发现了一种新的黄症病毒 鹰嘴豆矮缩 病相关病毒（ 它在血清学上与关，但与 不同的寄主范围，且为一种蚜传病毒，依据这些特性和序列同源性将其归为黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属的一个新种（ 2004）。 因组结构 黄症病毒是单链正义 毒，基因组约 5端无 其它帽子结构， 3端无多聚腺苷酸尾巴，也不折叠成类似 构（ ,1988a； ,1992； ,1996； 1999）。目前，已经获得 ， 1991）一些分离物的基因组核苷酸全序列。本实验室测定了我国的 因组的全序列，该病毒分离物的 5685个核苷酸组成，内含六个开放阅读框架（ 四个非编码区（ 基因组大小和结构与黄症病毒属（ 大麦黄矮病毒 似（晋治波， 2003）， 卓敏等 , 1996）。 所有的黄症病毒属病毒基因组含有六个开放阅读框架（ 图 1）。 ，而马铃薯卷叶病毒属病毒基因组也含有六个 是两属之间差别非常明显。 近 3端含有一个较小的 没有此阅读框架。然而， 近 5末端存在一较大的阅读框架。两者其余的五个 基因的排列顺序、表达机制上很接近，因而依次被定名 于 端的小读框和 端的大读框分别为 1990）。 黄症病毒组相关病毒的比较发现：在复制酶方面，大麦黄矮病毒与香石竹环斑病毒（ 较接近；而马铃薯 卷叶病毒和南方菜豆花叶病毒（ 切相关。 两条 别编码各自的聚合酶， 聚合酶与亚组 似， 近似于亚组 I（ , 1997）。 框架重叠是黄症病毒科基因组的共同特征。 叠 657 叠 629 , 1991），但 叠较少仅 13 个 所有的黄症病毒中， 含于 中。 重叠，由一琥珀密码子隔开。这样的基因中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 3 组结构使得核苷酸数目大为减少，使较少的核苷酸数目囊括足够多的遗传信息，使得它在生物进化上较为有利。 黄症病毒属中的大麦黄矮病毒基因组中还含有四个非编码区（ 它们分别位于 间； 间以及 游。 非编码区核苷酸序列同源性较高， 较发现，间。许多研究表明在这些非编码区中含有许多顺式作用因子，例 如：在 5端 在不依赖于帽子结构的增强子。通过序列同源性分析发现除黄症病毒属外，在香石竹环斑病毒属（ 坏死病毒属（ 含有 19 个 共有序列（ ，1997）。另有研究表明， 下游 为保守，特别是 3末端约 109一级和二级结构与病毒的复制密切相关（ , 2002）。此外，在缺失突变研究过程中，还发现在 5010除后，不论具有帽子结构还是没有帽子结构的 翻译 效率显著降低。这一部分序列对于 翻译是必需的，或者与 稳定性有关（ , 1999）。非编码区的保守性以及其它研究证据说明，非编码区对于病毒复制翻译等生命活动具有重要的调控作用。 图 1. 黄症病毒属的 因组结构 长方形代表开放阅读框 , 框内数字代表 号 , 框外数字代表蛋白分子量大小 , 依赖于 合酶 , 外壳蛋白 , 运动蛋白 , 蚜传蛋白或通读蛋白 , 2, 3: 亚基因组 2, 3 of of in k). NA MP,of NA 因产物及其功能 随着研究技术的发展、研究手段的不断完善，基因产物功能分析也取得了很大进展。 多数基因产物的功能虽有所研究，尚没有足够的证据。 基因产物是 小约为 30黄症病毒马铃薯卷叶病毒所特有的一个开放阅读框架。它在黄症病毒 保守性最低，其功能尚未完全清楚，推测可能与症状表现和病毒寄主范围有关（ ， 1993； ， 1992）。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 4 有自己的起始密码子，它的表达是通过核糖体移码与 合表 达的，产生一包含大部分 2的融合蛋白。该融合蛋白的 端一侧具有含有 基序， X 代表任何氨基酸。这一序列为很多植物与动物病毒编码的依赖于 ， 1988a， 1988b； ， 1992； ， 1991）。 缺失 ，则丧失复制能力（ , 1995； , 1993）。 要是在细胞中单独表达，仅有一少部分与 成融合蛋白。还不清楚 独表达的 功能。有人认为它具有解旋酶的功能，在复制时可解开双链（ 1989）。 993)却认为它与已知的解旋酶不具有同源性，而且基因组小于 6病毒没有解旋酶。 码病毒的结构蛋白，病毒的外壳主要由 码的外壳蛋白构成， 定 因的功能的方法主要有两种（ ,1988b; , 1992; , 1988）：（ 1）比较由 0导的氨基酸序列和纯化病毒的外壳蛋 白直接测定的氨基酸顺序。（ 2）病毒抗体和 原核表达产物以及无细胞体外翻译的产物特异性结合。 因突变或缺失的侵染性转录物在植物细胞中的积累减少，从而推断 能影响病毒复制，但是这一现象也可能是由于 外壳蛋白的包被，虽然复制量不变，但在提取部分降解造成的。 达产物（ 末端的延伸。通过免疫金电镜， 读蛋白的抗体能够吸附在病毒粒体的表面，说明通读蛋白暴露于外（ , 1990）。 （ 1994）曾利用原核表达的 5的抗体组分，还发现参与构成粒体 的50白不含有通读蛋白的 C 端部分。有趣的是，在原生质体中 复制与积累不是必不可少的，而且 缺失与突变不影响粒体的组装，但是若把 终止密码子 侵染细胞中没有 病毒粒体的积累。人们进一步对病毒在蚜虫体内的运行路线的研究发现，病毒需要穿越三道屏障：一、后肠上皮。病毒包被于小泡中进入体腔，在后肠的识别呈现对黄症病毒的专化性，多数 可进入其介体和非介体蚜虫的血淋巴，而不相关的病毒 就不能通过。二、附唾液腺（ 底膜。三、附唾液腺质膜。最后，进入主唾液腺，病毒就可以伴随唾液分泌排出体外。在 1993）， 不能吸附于非介体蚜虫的基底膜上。 够聚集于非介体的基底膜处，却不能穿过它（ ， 1993 和 1980）。 （ 1996）用更为直接的证据证实 5 为蚜虫传播所必须，但不是在病毒进入后肠细胞释放入血淋巴这一段，而是在病毒运转通过蚜虫唾液腺膜。 由 达产生的 有细胞间运动蛋白的生化特性。 1987）采用导入烟草花叶病毒（ 30白基因的转基因烟草植株，接种 温度敏感型株系，发现它可以弥补这种株系在限制温度范围内的侵染缺陷，从而推断 30白与病毒在体内的运转有关。进一步的研究表明，它可以与胞间连丝结合，扩张胞间连丝的通透孔径以利于病毒核酸的通过（ 1987； 1989），而且，它可被磷酸化修饰且具有单链核酸结合活性（ 1990, 1993）。此后，在对马铃薯卷叶病毒 （ 研究中也证明其 码的 17白具有上述相似的特性 ,并且通过构建一系列缺失突变体确定核酸的结合部位位于蛋白的 C 端 ,而N 端没有核酸结合活性，但其中的疏水的 ， 1991； 1993）。根据它能够非特异结合单链核酸的特性，人们仍然认为它的功能是病毒核酸结合蛋白（ 随中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 5 后，在对它的翻译效率的研究中发现它在体内的翻译效率比外壳蛋白（ 七倍（ ，1990）， 有类似的现象（ ， 1992）。这些研究表明 17白在感染的植物体内积累较多。由此可知，病毒 功能不是唯一的。 1997）采用纯化的大肠杆菌表达的 7白制备的抗血清对 染的马铃薯进行体内免疫定位，发现它与胞间连丝结合在一起。 （ 1996）运用互补实验证实 码蛋白与系统侵染有关。后来， 1998）采用原位杂交检测技术研究了 17白在燕麦体内的定位情况。观察结果表明， 17白与细胞核、细胞质及病毒诱导的泡状结构的丝状结构结合在一起，而在这些丝状物中包含有病毒的核 酸。在胞间连丝上却未观察到标记的目的蛋白。由此推测 17白是病毒核酸从核膜到细胞内其它膜系统运转过程中所需要。黄症病毒科的 17白均位于，而且在 N 端氨基酸序列中都含有 有序列。目前对大麦黄矮病毒 17 植物病毒在体内的扩展与运动机制多种多样，不同的病毒参与病毒体内运动的蛋白不同，氨基酸序列差异也较大。另外，许多运动蛋白具有多种特性，且参与病毒运动的蛋白并不唯一。黄症病毒属中大麦黄矮病毒的不同种 因氨基酸数目基本相同，但序列的同源性差异较大。 运用 件分析显示 , 7白氨基酸同源性分别为 96、 71，它与7白氨基酸的同源性仅 37。 码约 蛋白 ( , 1988; 1992)。在侵染的原生质体中大量存在一种包含 体外翻译实验中可以作为 ， 1994）。有实验证实， 系体外转录物在 5013产生 +1 的移码突变后，运用 侵染的原生质体中没能检测到外壳蛋白，说明 病毒复 制和基因表达是不可缺少的（ , 1991）。然而时报道 移码突变，在侵染的原生质体也未检测到外壳蛋白，这与 1994）的报道相矛盾。至今，在体内尚未检测到 白（ , 1997）。 因的表达机制 其它黄症病毒基因组大小约 6000 个核苷酸，但却含有完成生活史需要的各种蛋白的基因信息及调控信号。在这种意义上说，病毒基因组是一种多顺反子，而真核生物核糖体是翻译单顺反子的 毒一般通过三种方式解决这一问题。首先，产生亚基因组 从而暴露内部读框的起始密码子，特别是 3端部分的 次，产生融合蛋白表达两个不同的基因，分别有两种表达方式：一、移码翻译；二、通读翻译。这两种方式均属低效表达，但它们的调控机制却是非常复杂而精妙。第三，内部 起始。重叠的基因中位于前面的 者两者随机表达，机会均等，从而两基因都得以表达。对于第二个始的解释主要有两种，一是渗漏扫描模型（ 1986），处于有利的序列背景下的 于被识别， 从而保持较高的翻译效率。另一是由于第一个 于二级结构中，阻碍了核糖体的识别，则有利于下游 起始翻译。至于内部 起始频率和时期可能受到由顺式信号和反式因子参与的调控系统的制约。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 6 麦黄矮病抗病毒基因工程的研究进展 迄今为止，普通小麦中尚未发现有抗性材料。选育和推广抗耐病品种目前仍是防治小麦黄矮病乃至多种病毒病最经济有效的方法。小麦黄矮病的自然抗性基因主要存在于中间偃麦草、偃麦草以及赖草属等小麦近缘种属中。辛志勇（ 1991）等运用细胞工程技术，即运用常规杂交育种手段结合现代生物技术方法 ，将自然抗性基因从上述外源植物中导入到栽培小麦中。通过中间偃麦草和普通小麦杂交获得抗小麦黄矮病易位系，并选育出抗病品种 “临抗 1 号”。但是，常规育种的方法存在周期长、定向性差，易带入不良性状的缺陷。 近十年来，基因工程技术为病毒病的综合防治开辟了新途径，而且把病毒基因转入寄主植物也是研究病毒基因功能与致病机制和植物抗病机理的有效方法之一。在分子生物学和植物生物技术迅速发展的近十余年中，植物病毒抗病基因工程的技术路线已趋向成熟，并且仍在不断发展。迄今，应用的主要策略有： （ A）病毒自身基因介导的抗性（ 括导入病毒外壳蛋白基因（ 利用病毒非结构蛋白基因，如复制酶基因、运动蛋白基因、其它一些功能基因等）；利用人工构建的缺损干扰颗粒（ 利用病毒弱毒株系全基因组介导的抗性。 （ B）植物自身抗病基因，如 N 基因、 R 基因等。 （ C）利用植物源抗病毒活性物质基因，例如美洲商陆蛋白基因、天花粉蛋白基因等。 （ D）直接或间接作用于病毒核酸的策略，包括反义 术；核酶基因； 酶基因，如 因等； 2 聚腺苷系统（ 2 A）。 （ E）其它的抗病毒基因工程策略，包括利用卫星 利用抗体基因介导病毒抗性；利用干扰素基因介导病毒抗性。 病毒外壳蛋白基因介导的抗病性 植物病毒外壳蛋白基因介导的抗病性是研究最早、应用最广泛的抗病毒基因工程策略。在小麦抗黄矮病的基因工程方面，已获得由 导的抗性转基因材料。 1993 年，成卓敏等最早报道将 因通过花粉管通道法导入普通 冬小麦品种，并获得具有较强抗性的转基因小麦。贾力等（ 1999）用花粉管通道法也获得了转 因小麦。 （ 1995）将 因导入燕麦获得了抗性植株；夏光敏等（ 1996）利用基因枪方法，将分别含有 P 和 因的植物表达载体共转化小麦品种济南 177 等幼胚中，也获得了转基因植株。1996）采用 因转化小麦，发现转基因植株具有延迟发病并且减轻症状的作用。 病毒复制酶基因介导的抗病性 利用病毒的复制酶基因获得转基因植物具有抗 病毒及其 性程度强和抗性持续时间长等优点，已成为非常有用的抗病毒基因工程策略之一。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 7 在禾谷类作物抗黄症病毒病的基因工程中， 1998 年 报道，如果接种导入含有制酶基因的 5端部分的燕麦的 ，转基因植株在接毒初期表现出发病症状，但随后发病减轻或停止，并可开花、结实，而对照植株则在植株达到 25前死亡。吴茂森（ 2000）将 系的复制酶基因片段 用花粉管通道法分别转化小麦品种陕 160、陇鉴 127、晋麦 47、京东 8 号，获得 3 个 基因 系。其中， 2 个为陕 160， 1个为陇鉴 127。温室及田间抗病性鉴定，陕 160 转基因系表现出高度的抗性，在对照植株严重发病时不表现症状或仅出现轻微的叶尖发黄；陇鉴 127 转基因系有减轻发病的作用，对照叶片全部黄化时，可保持旗叶不黄化或小于 1/3。张文蔚（ 2003）采用农杆菌介导法将 因转化不同基因型小麦的不同受体上也获得了抗性植株。 病毒运动蛋白（ 因介导病毒抗性 对植物病毒运动蛋白的功能和特性的研究启发人们尝试探索运动蛋白介导的抗病毒转基因策略。根据植物病毒运动蛋白的功 能和病毒在细胞间运动的机制，假如在植物体内引入某种分子，这类分子可能会封闭或干扰 正常功能，则限制或阻止病毒在植物体内的扩展，从而达到抗病的目的。本实验室构建了 4 个有关 动蛋白基因的植物表达载体，分别是：全长片段、5缺失片段、 3缺失片段、两边缺失片段；运用基因枪介导法将 因导入小麦品种扬 158，首次得到基因组中整合有全长基因片段和 3端缺失的突变体的转基因小麦，经初步鉴定获得具有转 因缺失的突变体的抗性植株。这方面的研究不仅具有理论研究上的意义还具有重要的应用价值。 抗介体传播转基因策略 植物病毒的 47 个属中，已被证明可以通过天然生物媒介传播的病毒有 40 个属。植物病毒的介体有昆虫、螨、线虫和真菌。 这些植物病毒由其特定介体的协助才能完成对寄主的侵染和传播。在长期的进化中，特别是对介体依赖相对较强的病毒自身形成与之相关的功能基因。这类功能基因的编码产物与介体身体的某种物质相互作用才能完成病毒传播。以蚜虫传毒为例，起初，人们以为非持久型传播的病毒简单地由于蚜虫吸食病毒汁液时病毒沾染口针所致。随着研究的深入，人们发现蚜虫的获毒、释毒是一个蚜虫受体与病毒识别、结合、释放的复杂过 程。这类受体一般为糖蛋白，因蚜传特性不同，而位于蚜虫的不同部位。吴云峰（ 1993）利用荧光素、胶体金、乳胶免疫标记技术确定棉蚜和桃蚜与非持久型传播病毒的识别受体主要位于蚜虫下颚口针表面，距针尖 50m 处。对于 种循迴型持久方式传播的植物病毒而且介体在传播过程中具有特异性。研究证明 介体的特异性识别发生在附唾液腺基底膜上，那么受体可能是存在于这种膜上的一种蛋白质。王锡锋（ 1998）利用覆盖测定技术证实 系的介体麦长管蚜和麦二叉蚜头部蛋白提取液中含有两种分子量为 31 50蛋白与 特异性亲和反应。上述文献涉及到在病毒自身方面和蚜虫受体发生作用的功能域的定位。理论上讲，如果把受体蛋白基因导入植物，植物表达这种蛋白后，便会干扰病毒的介体传播；另一方面，病毒自身与识别密切相关的蛋