【毕业学位论文】（Word原稿）油菜开花时间变异分析和拟南芥晚开花突变体鉴定与基因克隆作物遗传育种学博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士 学位论文 油菜开花时间变异分析和 拟南芥晚开花突变体鉴定与基因克隆 of of I 摘 要 开花时间决定植物生殖发育的时期和质量，是重要的发育性状。开花时间性状受光温等环境因素调控，一般由多基因控制，存在位点的多态性。研究油菜开花时间多态性及相应控制基因 有助于培育适应不同季节和轮作方式的品种。 本研究 包括油菜开花时间变异与 析，拟南芥入突变体的筛选与晚开花基因克隆。 在 2003 2005 两年间利用已培育的 78 份油菜 开花时间变异广泛的 品系 （甘蓝型油菜 70 份，白菜型油菜 4 份和芥菜型油菜 4 份），于武汉和西宁两地秋播和夏播， 观察 油菜 开花时间变化规律，并利用 术检测 了 油菜 开花时间变异的 分子多态性 。获得的结果如下： 1、 78 份油菜材料在武汉两年秋播的开花时间变化极显著，两年夏播的开花时间变化不显著。通过分析日平均气温、积温、日照时数和日照总时 数等环境影响因子，发现武汉两年秋播开花时间差异大的原因是两年的气温差异较大所致。 2、通径分析发现武汉秋播条件下从播种到开花期油菜所需积温差异是导致开花时间变异的主要原因，其它环境因子是通过积温而影响开花的 。 3、选取 22 对选择性引物组合对 78 份油菜品系进行了 析。 一共扩增出 1323 条扩增带，平均每个引物扩增 53 条带。经方差分析，得到 137 条与两年两地油菜开花时间都相关的 聚类分析 ， 将 78 份油菜分成 5 类 ： 第 1 类是 1 2 月上旬开花 的材料； 第 2 类 仅 1 份 材料，表现特殊； 第 3 类 为 2 月中旬开花 的 材料； 第 4 类是 2 月中下旬到 3 月上旬开花 的材料； 第5 类 为 3 4 月份开花的 材料 ， 全为 白菜型 和 芥菜型油菜。 本研究的第二部分是筛选拟南芥突变体，鉴定克隆开花时间突变的基因。所筛选的拟南芥突变体库系用 体系统构建的 入突变体（野生型为 态型）。拟南芥突变体植株的筛选在人工生长室内进行，共筛选观察了 51 660 个 突变体单株，发现了 4 株晚开花突变体表型，并且为 性。对其中一个株系 进一步研究结果如下： 1、株系 播种到开花的天数变幅为 34 72 天，平均为 51 天，野生型的变幅为 3033 天，平均为 32 天。 交结果表明，其 单拷贝插入，因此推断该插入功能失活突变体株系的上代单株为杂合体，且为一个插入突变位点。 2、利用 法克隆了该晚开花突变体的插入位点基因的侧翼序列。将这个片段回收、测序、去掉载体序列后得到拟南芥基因组中 入左侧侧翼序列，长度是 798 4、通过生物信息学分析，发现 插入到 因中，该 798侧翼序列和因对应序列相似性为 100。没有发现序列有对应的并经过实验研究的功能，仅发现该插入功能失活的 因的推定功能为膜整合蛋白；该基因与酵母 因的序列相似性为 酵母 因是调节 量的基因，因此推断 因的功能可能是通过 信号途径或调节细胞 量而影响开花，并且和细胞膜有关。这是首次发现植物开花时间通过 信号途径或细胞 量调控，尽管需要进一步通过转基因深入研究验证。 关键词 拟南芥 油菜 开花时间 析 晚开花 变 体 基因克隆 is an of is in a by on to in In 8 003as 1. 8 Pbe by on of 2. to 3. of 8 323 3 137 to 0038 to of 0 5 on in is to 1 660 of 3 of as 1. to of 4 2 d of 0 3. (as In 3:1 on hi CR 3:1 on hi a a . A a of 98 bp in in 3. 98 bp 00%. a of we NA 98 98 bp of we in or by It is a of a is is 录 2006 . 错误 !未定义书签。 第一章 绪论 . 1 南芥开花时间调控途径简述 . 1 . 1 . 4 . 6 . 6 条开花控制途径的整合 . 7 菜开花时间基因简述 . 8 . 8 . 8 菜开花与温光因子 影响 . 9 菜 子标记研究进展 . 10 子标记技术的基本原理 . 10 子标 记在油菜研究中的应用 . 11 南芥 入突变体研究进展 . 13 入突变体的原理 . 13 入位点两侧基因的克隆 . 14 点 . 15 离子的作用 . 15 和 道 . 15 间分布 . 15 号转导 . 16 与 开花 . 16 第二章 油菜开花时间多态性分析 . 19 言 . 19 验材料 . 20 验方法 . 21 . 21 . 21 . 21 . 24 验结果 . 24 . 24 . 29 V . 33 论和分析 . 33 第三章 拟南芥晚开花突变体鉴定和基因克隆 . 36 言 . 36 验材料 . 36 . 36 . 36 验方法 . 37 . 37 . 37 . 38 . 39 . 41 . 41 . 43 验结果 . 43 . 43 . 44 . 46 . 48 . 49 论和分析 . 58 第四章 结论 . 59 参考文献 . 60 致 谢 . 72 作 者 简 历 . 73 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 油菜是十字花科芸苔属油用植物，是世界四大主要油料作物之一 ， 包括甘蓝型油菜、芥菜型油菜、白菜型油菜 3个栽培种 (1998) 。 油 菜是我国中、北亚热带唯一能在较低温条件下 (0 5 ) 生长发育、能利用冬季 空闲土地的油料作物。因此，它对扩大复种指数作用巨大，在种植业结构调整中占有重要地位，其种植面积呈逐年增加趋势（廖桂平， 2001）。 拟南芥(十字花科 (南芥属 (年生草本植物 ， 广泛分布于欧洲、亚洲、北美洲 和 中国 各 地。 20世纪初植物学家 许多优点 ：（ 1）形态个体小，高度只有 30 2）生长周期快，从播种到收获种子一般只需 6周左右；（ 3）种子多，每 株每代可产生数千粒种子；（ 4）形态特征简单；（ 5）基因组小（ 125 只有 5对染色体，基因组测序已经完成（ 2000）。拟南芥具有短生育周期和冬性一年生两种不同的生态型。短生命周期是在 8星期之内完成一个生命周期， 态型属于此类。最近十余年来，利用拟南芥为模式植物，对高等植物开花时间调控机理与信号转导途径的研究取得了长足的进步（张素芝， 2006）。开花时间是植物的进化特性，是作物的重要数量性状，它的变化受环 境和遗传因素调控。开花是植物由营养生长向生殖生长转型的最重要的一个过程，在合适的时间完成这个转型是植物实现生殖发育所必需的。利用拟南芥为模式植物，对高等植物开花时间调控机理与信号转导途径的研究取得了长足的进步，已经鉴定出来至少 4个不同的开花调控途径。 南芥开花时间调控途径简述 周期反应途径 在光周期途径中的主要调控基因有 长日照 (提前开花，突变体 co,gi,ft,件 下延迟开花，但在短日照 (件下开花时间与野生型相似。 长日照下促进拟南芥开花的转录因子。 通过上调花分生组织特性基因 性促进开花。 CO 长日照下比短日照下表达丰度高，表明 长日照诱导。在长日照下 明昼夜节律钟控制 录（ et 1999） 。 光对开花时间的调节是通过生物钟 (现的，生物钟通过信号输出途径将日照长度信号传输给 而诱导其下游基因 表达，启动日照长度对开花时间的调控， 在此过程中，任何影响光信号检测 (如光受体 )、生物钟组分和光信号输入、输出生物钟途径的突变都会影响拟南芥的开花时间 (,2001)。 早期激活目标基因，由光诱导的 录后激活 达，在长日黎明后 20 小时夜表达达到高峰，在 变体中没有 达高峰。 昼夜节律钟和 因之间的连接基因，在长日途径内昼夜节律钟调节下游基因 表达 (et 2000； 国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 2 et 2001)。长日照下 体基因是 )。 O 的上游， 变体抑制 因的早花表型。 与昼夜节律钟相关的基因有 ) 和 ） 等。 因通过磷酸化作用调控） 基因表达 ( 000)， 制 和 表达，这三个基因共同启动花的发育转换和花被特性基因的表达，当缺少其中之一时，由其它两个基因控制相对缓慢的阶段转换。 性突变体诱导所有的顶端分生组织转变成花分生组织，提前开花，证明 因抑制花序顶端形成花，并且抑制营养生长向生殖发育的转换 (et 1997； et 1997； 991；992)。 )编码一个 同源基因，抑制 表达，在长日照下被 导。 叶脉组织中共表达，在整个发育过程中 制 表达，导致不依赖长日照的早开花。在 表达后， 以降低表达量， 通过抵消 激活作用来沉默 完全抑制其表达的，说明 止在茎顶端过早形成花器官（ et 2003）。 长日条件下推迟开花，短日下没有作用或作用很弱。 达是受昼夜节律钟调节的，转录水平峰值出现 在黎明后 8 10 点。 达产物是一类新的膜蛋白。 是昼夜节律钟特殊的输入组分，因为 变体中影响被时钟调节的基因表达类型，如 位基因影响光信号向节律钟的输入，在 变体的 因表达水平降低，证明在光周期促进开花途径中 节开花时间基因的表达 (et 1999； et 1999)。 量异位表达可以修复 变体表型， 用于 上游 (et 2000)。 因介导 因在 光下的节律性表达。 光受体的功能是感受光周期的，是光周期途径的输入系统。拟南芥至少依赖 9 个光感受体来调节自身的大多数光反应，包括 5 个光敏素 ( 2 个隐花素 ( 2 个向光蛋白 ( ，光敏素和隐花素都调节开花时间。新发现的蓝光受体有 一种受蓝光诱导而发生自身磷酸化的黄素蛋白，主要介导高强度蓝光下叶绿体的避光反应（ 002）。 拟南芥的光敏素 自编码 辅基蛋白， 促进开花的光受体， 其它 都是 抑制开花的。 制开花阻遏物的生物合成， 导远红光促进开花和抑制下胚轴延长，持续远红光下 变体不开花。红光下（ 660进开花， 抑制开花，这是不依赖生物钟功能的，也不依赖 转录调节。 调 表达，因此 能与不同开花途径结合激活下游基因的表达。 变体提前开花 (et 1995)。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 3 图 1 拟南芥花发育途径 ( B,2000) B,2000) 隐花色素介导蓝光反应，隐花素的表达随光周期变化。 码含有黄素的蓝光受体，促进开花。光周期长度信号接受或传导受 因调控， 是 正向调节基因。 基因表达水平在长日下比短日下大，两者的总活性比其它光受体的大，因此 因表达丰度变化可能是由于光诱导下光受体 蛋白的水解造成的，二者是主要的日长感受因子，是通过 拮抗作用来调节开花的 (et 1994；et 1995)， 光接受和 昼夜节律表达高峰一致性很高，这对诱导开花基因 达和光周期促进开花很关键。 因的突变或超量表达都导致对光周期的反应降低（ 997； 1991； et 1998； et 1999）。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 4 ) 是中心振荡器的组分，是通过昼夜节律钟反馈环来调节昼夜节律表达，当组成型表达时它们又抑制所有观察到的节律。它们的表达水平受昼夜节律钟调控，在黎明后出现高峰。在长日照条件下过表达 起晚花表型，功能丧失的 基因缩短昼夜节律期长度约 3 小时。 因在中心振荡器和输出途径都起作用 (et 1997； 1998)。 F 也称作 与了多蛋白复合体的形成， 晚间 录水平高，在持续光照条件下出现昼夜节律。持续光照下 变体的昼夜节律周期很短，说明 通过反馈环来控制自己的节律表达。 蛋白共同来调节其它基因（如 的表达。 早期核内光敏色素信号转导的组分，核内 蛋白复合体是光信号影响昼夜节律钟发挥作用的结合点。 白能在核内结合 动子， 抑制 因的表达。在 变体中， 达周期长度很短，表达水平降低，因此， 一个负向反馈调节环。 成一个含有假反应调节因子 互补反馈环，从而利用反馈机制进行自身的调节 (et 2000)。 昼夜节律钟的正向调节因子。它位于核内，通过参与光输入途径来调节一些光反应基因的表达。 变体在长日和短日下均比野生型开花早，在持续光照条件下没有昼夜节律性，而在持续黑暗中能够维持节律性。 因 功能是测量 日长和抑制短日下的开花 (et 1996； et 2001b) 。 化反应途径 冬性一年生的植物（如冬油菜、冬小麦、黑麦等）成花主要受低温的影响，生长初期给予一定时期的低温处理，可大大加快其开花进程，并正常结实，这种低温促进植物开花的效应被称为低温诱导作用或春化作用（ 植物春化发生反应的时间与发生效应的时间间隔很大，具有时间分离性，这一点不同于光周期反应。植物春化作用有以下几个明显特点：（ 1）一般认为茎尖生长点和胚芽是接受低 温的部位。（ 2）不同植物春化所需的低温有所不同，一般有效低温介于 0 10之间，最适温度为 5 7。春化过程是一个缓慢的量变过程（一般 4， 4 8 周），春化过程的代谢方式具有严格的顺序性和多步骤性，最适宜的低温是在其他条件相同时，完成春化时间最短的温度。（ 3）春化效应可以被高温所解除，即脱春化作用（ （ 4）春化效应随着有丝分裂一直保留在茎端生长点，即正在进行细胞分裂的组织才具有感受春化的能力，并通过细胞分裂传递春化效应。低温产生的春化效应会因减数分裂或其他有性生殖过程而消失 ，不能遗传给子代，即植物有性繁殖导致春化作用的消失。 通过代谢抑制剂进行研究，发现春化过程是一个漫长、复合多步骤、分阶段性的复杂过程 ，有阶段性和顺序性，一般在生长点发生质变。汤佩松、谭克辉提出春化过程可划分为以糖的氧化过程为主、以核酸代谢为主及以蛋白质代谢为主的 3个过程。所以春化是某些重要基因在特定的条件下按照一定的时空顺序、不断解除阻遏而得到程序性表达的遗传控制的生理生化过程 (996； 1999；汤佩松， 1963；谭克辉， 1981； 1992；刘磊， 2005)。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 5 )基因在春化反应过程中起中心作用，也是多条开花途径的汇聚点。 录因子，编码一种阻抑蛋白来调节开花时间，并在春化过程中起关键作用 (et 1997)。春化途径与开花基因去甲基化有关， 甲基化程度诱导的 录物低，因此 因在开花起始时起关键作用。冬性一年生拟南芥的春化与 水平表达有关，晚花生态型和突变体的 录水平高而且稳定，春化反应降低 表达水平并促进开花。冷处理条件下的 度下降，降低水平是与开花时间渐进 一致的 ( 1999a; et 1999)。 拟南芥基因组的显性单拷贝基因，开放阅读架是 609 个氨基酸。 码一个生物化学功能未知的新蛋白 (001； et 2000)。 因产物通过参与蛋白质蛋白质之间的相互作用来提高 丰度 ( 1999b； et 1999)。分析拟南芥晚花生态型 早花生态型 杂交后代，发现激活的 位基因是依赖 位基因的活性的， 调 达，高水平 制开花。过表达 以在缺少 ， 带 可以被春化反应修复 (et 2000； 995)。冬性的晚花表型是两个显型等位基因 同作用的结果，大多数早花生态型是由于 位基因序列缺失打断了开放阅读架所致，自然发生的晚 花生态型 因增加 表达，因而推迟开花，春化处理后提前开花，证明 这些早花 类型是来自 因失活的晚花类型 (001)。 自主促进开花途径也像春化反应途径一样通过降低 表达水平促进开花， 自主促进途径可以单独调节 自主途径中 对 基因功能分析结果证明春化作用是通过延长低温时间来降低 表达水平，但 是春化反应必须的基因。长日途径、自主途径和 径在长日条件下促进 开花，并分别被 因抑制。自主途径分别通过抑制 表达，激活长日途径和 径促进开花。春化处理的 突变体比 突变体开花时间早，表明春化作用可以不依赖于 功能促进开花。不依赖 径的春化作用分子机理还不清楚，因此，春化反应促进开花可以依靠 可以不依靠 因功能。依赖春化反应的途径对开花时间的启动不是必须的，如果一条或多条途径被突变或者环境条件阻抑，而其它途径对开花促进信号作用有限的时候，就可以通过冷处理激活春化反 应途径促进开花 ( 001)。 因通过改变染色体的结构变化来调节开花时间，在 变体中 因附近染色体结构改变。在冷处理初期 变体中 度降低，升高温度后 变体不能维持 明 et 2001； et 2002）。 显著调节抗冷反应的基因是 F 因编码一个 蛋白，它可能是泛素蛋白连接酶，这意味着它在大量植物信号传导途径中作为负向调节基因，但在冷信号传导途径中还未得到确认。 变体是春化和冷胁迫之间的联系基因 ( et 1998； et 2001)。 春化作用 不 改变植物的基因，不具有遗传性。 低表达水平后，在随后春化处理形成的植物器官中也是很低的，不能通过有性生殖传递给后代，减数分裂不能维持春化作用，因此植株中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 6 需要重新进行春化作用。可能甲基化调 控的基因表达才是春化作用的基础，脱甲基化的拟南芥晚花突变体提早开花（ 998； et 1999）。春化作用的异位调节可能是通过染色体结构的改变来调节的，它与甲基化的联系尚不清楚 。 主调控开花途径 是在长日照和短日照条件下组成型促进开花的基因，不依赖环境因子， 变体对光照和春化敏感，在所有光周期条件下都是晚花表型( 999b； et 1999)。晚花突变体开花需要春化处理，也可被远红光修复。与 径或 径晚花突变体及野生型相比，自主途径突变体 达量很高（ 999b； et 1999; 001)。 白包含两个 合区 一个 白蛋白作用域， 体外可以结合到 (et 1997)。 成花转变早期必需的基因