PCR质量控制

临床基因扩增检验质量要求,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,制定依据,医疗机构临床实验室管理办法（卫医发200673号）医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法（卫办医政发2010194号）医学实验室质量和能力认可准则 ISO15189(CNAS-CL02)医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域的应用说明（CNAS-CL36）医学实验室质量和能力认可准则在病理学检查领域的应用说明（CNAS-CL37）,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,临床基因扩增检验质量控制,分析前患者准备、标本（采集、运送、验收、保存）、医生报告单申请分析中样本分样、仪器、检测过程、结果的有效性判断分析后检测报告、报告传递、结果的接收、结果解释,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,标本,标本采集时间对扩增检测结果的影响标本的类型和采集量采样及运输容器采样质量的评价标本采集中的防污染,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,标本采集时间,1、血清（浆）：无特殊要求2、如用泌尿生殖道分泌物做CT、NG项目：应在抗生素应用前或停药两周后采集标本，如不能停用抗生素，应于下次抗生素应用前采集。3、如用痰做TB：应在抗结核药物应用前或停药两周后采集标本，如不能停用抗结核药物，应于下次抗结核药物应用前采集。 因为PCR方法所检测的靶物质为核酸，不受标本生物活性的限制，对于已经死亡的病原体仍可检测出来，即感染后在药物治疗有效的情况下，患处仍会有少量已死亡的病原体存在。,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,标本采集量,标本的类型和采集量应根据所测病原体而定。一般来说，如果样本的量对病原体培养够用的话，则其量亦足以用于核酸提取及其后的扩增检测。,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,采样容器,采样所用的抗凝剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。如全血、骨髓和血浆标本，用EDTA抗凝，不使用肝素，因其是 Taq酶的强抑制剂，且在核酸提取过程中很难完全去除。 使用玻璃器皿，必须为密闭的、必须经高压灭菌，以使可能存在的RNase永久性失活。,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,标本验收、拒收,血液标本：溶血、严重脂血等应拒收泌尿生殖道分泌物：镜下观察到上皮细胞存在。痰液：镜下观察上皮细胞很少，一般25个。标本拒收原因分析，采取有效措施予以纠正,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,标本运送,实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床标本的运送条件（温度、时间）作出相应规定。靶核酸为DNA的标本，如在无菌条件下，则可以在室温下运送，建议采集后8h之内送至实验室；靶核酸为RNA的标本，如在无菌条件下，可在室温下运送，如为较长时间，则应在加冰条件下运送，建议采集后4h之内送至实验室； 所有标本采集后送至实验室之前，所有临床标本在采集后送至实验室前，均应放28临时保存。淋病奈瑟菌有自溶的特性，标本采集后应立即送检。,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,标本保存,靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因此标本的保存对于核酸扩增测定的有效性极为重要（避免反复冻融）靶核酸为DNA的标本2-8保存1-3天，靶核酸为RNA的标本应20下保存20下保存1个月70以下可长期保存如为提取核酸后用于DNA扩增分析的样本，可于10TE缓冲液mmol/L Tris,1mmol/L EDTA(pH7.58.0)2-8下保存。 用于RNA扩增分析的样本，则应于上述 TE缓冲液中-70保存。,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,标本接收,标本接收建议在三个测定区之外接收的标本应收集在原始容器中，不能接受从其他检测如生化、免疫检验等分出来的标本，因其有较大的发生标本间污染的可能性,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,标本处理,血清（浆）：应1小时内分离血清，抗凝后4小时内分离血浆，然后转移至1.5ml灭菌离心管中保存。若血清分离不充分，可1500rpm离心5min 。如甘油三酯含量超过6mmol/L或肉眼可见血清/血浆呈白色浑浊状的标本，应413 000rpm离心15min,吸取下层清亮血清或血浆转移至1.5ml灭菌离心管中保存 泌尿生殖道分泌物一次性采样管（含保养液）配套棉拭子（不含保养液） 痰液结核分枝杆菌DNA检测标本：用4%NaOH摇匀，室温下放置30分钟左右液化，转移至1.5ml灭菌离心管，离心，去上清，留沉淀用于核酸提取。需注意的是液化时不能加热，液化时间不能过长。 非结核分枝杆菌DNA检测标本：痰标本在室温悬浮于灭菌生理盐水中，充分震荡混匀，促使大块黏状物下沉，取上清离心，去上清，留沉淀用于核酸提取。切记不能用NaOH液化痰标本。,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,实验室仪器设备,分册建立仪器档案仪器卡、仪器运行状态标识定期维护保养定期校准/检定相同检测项目在不同的仪器或系统上进行检测时，应做比对 （2次/年，每次至少20份标本，计算回归方程，系统误差应7.5%）当设备出现故障时 ： 1）应立即停止使用，并加上明显标识 2)修复的设备必须经校准、检定（验证）或检测满足要求后方 能再次投入使用 3)实验室应检查由于上述缺陷对以前所进行的检测工作的影响， 并记录相关分析、处理意见,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,检测、验证方法（适用于定量项目）,可校准的项目实施校准质控品检测结果在允许范围内与其他仪器的检测结果比较（5个样本，覆盖测量范围，至少4个样本测量结果偏移7.5% ）使用留样再测结果进行判别(5个样本，覆盖测量范围，至少4个样本测量结果偏移7.5% ）,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,仪器校准,需校准仪器：温度计、温湿度计、移液器、恒温金属浴、生物安全柜、高速冷冻离心机、扩增仪、杂交仪、测序仪校准单位资质合格的校准/ 检定报告校准周期：参照国家计量部门或生产厂商的要求进行，厂家没有规定的则每年至少进行一次 内部校准的辅助设备，实验室应根据国家计量部门或生产厂商的规定制定内部校准操作规程和要求，并有内部校准的详细记录校准或检定的设备，应贴校准或检定标贴，标明其校准或检定状态，并标明下次校准或检定的日期,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,扩增仪,结构：温度控制及导热系统、光路系统、 检测系统 维护： 75%乙醇定期清洁热盖和反应槽或孔 用无水乙醇清洁光路部分校准： 校准单位：厂家 校准周期：定期校准、仪器搬动 校准参数：光路部分、背景荧光、温控部分（温度准确度、均一性、温度升降速率）,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,恒温金属浴,维护：75%乙醇擦拭加热孔校准： 校准单位：厂家、计量院、内部校准 温度准确度（1 ）（应涵盖试验过程中所涉及的温度） 孔间温度的均一性（1 ）（内部校准应规定测定孔的选择、测量时间、各孔温度偏差允许范围）,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,移液器,维护： 75%乙醇擦拭校准：校准周期、外校（厂家、计量所）、 校准量程（应涵盖试验过程中所涉及的量程） 计量性能要求（容量允许误差、测量重复性）内部校准-参照定量、可调移液器试行检定规程(JJG646-2006) 注意：环境的要求 计量性能要求（标称容量、标定点、容量允许误差、测量 重复性） 校准点涵盖试验过程中所涉及的量程,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,生物安全柜,清洁: 75%乙醇擦拭,不宜用次氯酸钠溶液清洁检定：有资质的第三方检测机构检定参数：高效过滤器完整性、流入气流流速、下降气流流速、气流模式,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,高速冷冻离心机,维护保养：75%乙醇擦拭校准：转速、温度,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,耗材、试剂要求,耗材 带滤芯吸头、离心管爆管和抑制物质检试剂盒的质检 包括外观质检和性能质检 选择或更换试剂品牌：试剂性能评估 更换试剂批号：试剂批间差，应评价核酸提取效率和扩增效率,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,更换试剂批号质检,设置阴性对照、低值阳性对照试剂不合格 1)低值阳性对照和标准品均未检出，或低值阳性对照未检出而标准品检出率大幅下降，表示试剂失效或检测灵敏度大幅下降。 2)低值阳性对照未检出，标准品检测正常，提示样品提取液存在问题。重复新旧提取液阳性对照实验，确定提取液失效问题。 3) 阴性对照有扩增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。 4)低值阳性对照检出，标准品未检出或扩增曲线明显系统性CT值偏大5个循环以上，提示阳性标准品存在问题。试剂合格 阴性对照无扩增、低值阳性质控品检出 或高、低两个临床样本检测结果在0.4log10范围内，可接受,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,室内质量控制,目的 监测和控制实验室常规工作的精密度，即实验室测定的批内和批间重复性IQC结果决定了实验室即时测定结果的可靠性和有效性,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,质控品来源及使用,来源:第三方、试剂盒自带、自制使用: 1)冻干质控品复溶时，要确保所用溶剂的质量；当溶剂为焦碳酸二乙酯（DEPC）水时，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。因DEPC是一种潜在的致癌物质.它可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制物。 2)冻干质控品复溶时，所加溶剂的量要准确 3)冻干质控品复溶时应轻轻摇匀，切忌剧烈振摇 4）避免反复冻融 5）自制室内质控品应监测检测全过程,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,质控品设置、数量,定性检测已知弱阳性质控样本（基质与待测标本相同）：至少带1份，监测核酸提取和扩增检测的有效性已知阴性质控样本（基质与待测标本相同）：至少带1份，判断核酸提取过程中是否发生污染(实验室的以前扩增产物的污染、标本间的交叉污染、强阳性标本气溶胶经加样器导致污染、强阳性标本经操作者手导致污染 翻盖离心管在较高温度温育时盖子崩开、扩增反应试剂的污染 定量检测已知高、中、低质控品（基质与待测标本相同）已知阴性质控样本（基质与待测标本相同）,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,质控品位置,室内质控品在扩增仪中的排列顺序：不宜固定位置,尽可能监测每一个孔扩增有效性板上杂交和膜上斑点印迹杂交的质控：在板上杂交和斑点杂交时，阳性和阴性质控应该在同一板或膜上与病人标本平行进行分析，这可排除不同反应中因使用不同杂交条件所致的对结果的错误解释。,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,质控品均值建立,暂定均值的建立：20d内得到20个数值，或至少在5d内，每天作不少于4次重复检测获得20个数值。对数据进行离群值检验（剔除超过3s外的数据），计算出均值，作为暂定均值。若使用定值质控品，均值必须在实验室内使用自己现行的测定方法进行确定，质控品说明书上的原有标定值只能作参考。常规均值的建立：以最初20个数据和三至五个月在控数据汇集的所有数据计算的累积平均数作为质控品有效期内的常规均值，并以此作为以后室内质控图的均值。,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,常用质控规则的符号及定义,符 号 定 义12S 一个质控测定值超出2s控制限。13S 一个质控测定值超出3s控制限。22S 两个连续的质控测定值同时超出+2s或2s控制限。R4S 同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间 的差值超出4s控制限。41S 四个连续的质控测定值同时超出+1s或1s控制限。10X 十个连续的质控测定值同时处于均值的同一侧。,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,统计质控方法,Levey-Jennings质控图方法 Levey-Jennings质控图结合Westgard多规则质控方法 “即刻法”质控方法,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,Levey-Jennings质控图方法,根据常规条件下的变异（RCV）计算中的平均值和SD确定质控线，一般以X2S为告警限，X3S为失控限，将所得质控结果标在一张质控图上，简单明了。但如果以X2S为失控限，假失控概率太高，通常不能接受；以X3S为失控限假失控概率低，但误差检出能力不强。,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,由12S ，13S ，22S ，R4S ，41S ，10X 等规则组成，其中既有对随机误差检出敏感的，也有对系统误差敏感的。结合在一起，假失控和假告警概率低，误差检出能力增强，大大提高了失控的检出率。在实践中13s 、R4s规则常检出随机误差，而22s 、41s和10x质控规则检出系统误差。,Westgard多规则控制方法,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,1) 12S 为警告规则，不是失控规则。若本批检验没有出现控制结果超出控制线，表示本批结果没有问题，在控，可以发出报告。若本批检验有1个控制结果超出（不包括正好在限值线上的结果）2S控制线，表示本批结果可能有问题，符合12S规则。是一个警告，但不是失控。,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,12S,12S规则示意图,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,失控的表现如下： 2）13S 即这个控制值不仅超出2S控制线（符合12S规则），而且还超出了3S限值（符合13S规则）。这是在检验中很少发生的（概率约为0.3%），是一个检出随机误差的失控规则。,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,13S失控规则,13S失控规则示意图,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,3） 22S 有两种表现：l同批两个控制品结果同方向超出2S限值。或同一控制品连续两批控制结果同方向超出2S限值。属系统误差失控。,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,22S失控规则,22S失控规则示意图,22S失控规则,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,4） R4S 在同一批中两个控制结果差超出4S范围，其中有一个超出了+2S限值，另一个超出了2S限值。或其中一个超出了1.5S，另一个超出了2.5S限值属随机误差过大，为失控。,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,R4S失控规则,R4S失控规则示意图,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,5） 41S 有两种表现：包括出现警告在内的这个超出2S的控制结果，这个控制品前3次结果均和这个控制结果在同方向超出+1S或 1S范围。l 包括出现警告在内的这个超出2S的控制结果，这个控制品前1次结果，均同方向超出+1S或1S范围；另一个控制品的这两次结果也是同方向超出+1S或1S范围。 属系统误差失控。,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,41S失控规则,41S失控规则,41S失控规则示意图,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,6） 10 连同出现12S警告的这个结果，另外还有两个控制品的结果，在前几批及本批结果中，有连续10次在的一侧。属系统误差失控。,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,失控规则示意图,失控规则,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,“即刻法”质控方法,只要有3个以上的数据即可决定是否有异常值的存在。将连续的质控测定值按从小到大排列，即x1、x2、x3、x4、x5、x6、xn（x1为最小值，xn为最大值）； 计算均值和标准差(s);按下述公式计算SI上限和SI下限值； SI上限=（x最大值 均值）/s SI下限=（均值 x最小值 ）/s将SI上限和SI下限值与SI值表中的数值比较。,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,SI值表,n n3s n2s n n3s n2s 3 1.15 1.15 12 2.55 2.29 4 1.49 1.46 13 2.61 2.3 5 1.75 1.67 14 2.66 2.37 6 1.94 1.82 15 2.71 2.41 7 2.10 1.94 16 2.75 2.4 8 2.22 2.03 17 2.79 2.47 9 2.32 2.11 18 2.82 2.50 10 2.41 2.18 19 2.85 2.53 11 2.48 2.23 20 2.88 2.56,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,质控结果的判断,SI上限和SI下限值均 n3s对应的值时，说明该质控测定值的变化已超出3s，属“失控”。,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,即刻法优缺点,优点：对于检测项目开展次数少的实验室可进行质控缺点：繁琐 初始阶段的质控数据，前3个质控值的CV对随后的结果影响大。,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,临床基因扩增检验室内质量控制操作,前20个数据使用即刻法，可对第320个数据进行质控判断第21个数据开始使用常规质控方法进行质控判断,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,失控处理,及时查找原因，采取纠正措施填写失控原因分析报告相关负责人决定报告是否可发放,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,失控原因分析阳性质控样本常见的失控原因,核酸提取中的随机误差。如核酸提取中的丢失、有机溶剂的去除不彻底、标本中扩增抑制物的残留等。 仪器的问题。如扩增仪孔间温度的不均一性、孔内温度与所示温度的不一致性等。试剂的问题。如Taq酶和/或逆转录酶的失活、探针的纯度及标记效率和核酸提取试剂的效率等。,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,失控原因分析阴性质控样本的失控原因,扩增产物的“污染” 临床标本的核酸提取过程中发生的标本间的交叉 “污染”.,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,避免基因扩增检验假阳性结果的措施,严格的实验室分区使用带“滤芯”的吸头设立“阴性”质控（与标本同时处理）使用防“污染”（含UNG）的PCR试剂临床“假阳性”问题：病原微生物如结核杆菌经药物治疗后已死亡，但PCR仍可为阳性，故治疗结束后至少两周内不宜做PCR检测。,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,避免基因扩增检验假阴性结果的措施,避免由于来自于标本的血红蛋白、肝素、某些激素或来自标本处理中的去垢剂、有机溶剂的抑制作用的措施：纯化核酸；标本重复双份测定；稀释标本定期对扩增仪的温度控制和加热模块中热传导的一致性进行检查和校准,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,注意事项,在PCR试剂准备区配置反应混合液，先将dNTP、引物、酶和缓冲液混合后，再分装；配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，反应体系配制完毕后低速离心数秒，避免产生气泡分装的试剂注意冷藏，防止酶试剂失活及有机大分子降解优先选择含UNG的试剂盒试剂经充分溶解后混匀，离心后再开盖，保持试剂均匀性扩增管、样品处理管及吸头等实验用品，均需高压灭菌标本处理应在标本制备区指定的生物安全柜内进行，实验前应打开风机5-10min，待柜内空气净化并气流稳定后再进行实验操作为防止标本间交叉污染，在打开离心管前宜短暂离心,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,注意事项,如遇吸弃上清步骤的提取方法，离心时应注意离心管的方向，吸弃上清时不要碰到沉淀部分，以免造成提取效率降低。标本处理严格按照试剂说明书进行操作，应做到处理时间充分，保证标本中的DNA或RNA完全释放；将提取的核酸加到反应体系中后，应将纯化好的剩余核酸样本冻存，以免在扩增检测时出现意外需要重新检测。在结果确定后再将这些样本按生物污染废弃物进行处理。扩增条件一致的不同检测项目同时扩增时不得使用同一套标准品。扩增后的扩增管不能在扩增及产物分析区打开处理，应用一次性手套包好远离PCR实验室的洗涤间消毒处理；工作结束后，必须立即对各工作区进行清洁,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,结果判断,在判断结果时，应先对扩增的荧光信号作出定性判断，然后再进行定量分析，避免一些非特异荧光信号对结果分析的干扰。基线值（阈值）设定：遵从厂商规定,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,实验结果有效性判断标准,标准曲线平滑均匀，斜率、截距和相关系数等参数的数值允许变化范围均应在试剂制造商推荐的范围内。阴、阳室内质控检测结果均处于在控状态。 以上几项标准均达到要求后，当日实验有效，可以发放报告。否则，本次实验无效，全部标本应重新检测。,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,实验灰区标本的处理,定性测定中处于实验灰区的标本应重复检测一次，灰区范围的确定及结果报告应遵从各试剂制造商推荐的要求。复星CT：38Ct值40为检测灰区，建议重复检测2次。如果检测结果至少1次为Ct40判断为阳性，否则判为阴性。达安CT:ABI7000：27Ct值30为检测灰区，重复检测1次。如重复试验Ct值30判为阳性，否则判为阴性。Roche LightCycler：37Ct40为检测灰区，重复检测1次。如重复试验Ct值40判为阳性，否则判为阴性,上 海 市 临 床 检 验 中 心Shanghai Centre for Clinical Laboratory,结果报告,定性检测