封闭抗体A

北京爱普益医学检验中心 封闭抗体的检测及意义,郭磊,复发性流产的定义及分类,自然流产：是指妊娠过程失败、胚胎死亡和胚胎及附属物排出，排出物或胚胎及附属物不足1000g，孕周不足28周。复发性流产（RSA）：俗称习惯性流产，是指连续发生2次或2次以上自然流产。原发性复发流产：从未有活婴出生的复发性流产。继发性复发流产：曾有正常分娩的复发性流产。复发性流产的分类：根据病因和发病机制，复发性流产可分为非免疫型和免疫型。,非免疫类复发性流产,染色体异常型：指夫妻双方或一方或胚胎染色体异常所致流产。生殖道解剖异常型：指先天性发育异常或后天性子宫疾病所致解剖异常所致流产。内分泌异常型：指由于内分泌功能失调所致流产。生殖道感染型：指弓形虫、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒等感染所致的流产。,免疫类复发性流产,自身免疫型：患者体内出现各种自身抗体，如抗心磷脂抗体（ACA）、抗核抗体（ANA）、抗甲状腺抗体（ATA）等。同种免疫型：由于夫妇之间主要组织相容复合物（MHC），在人类又称白细胞抗原（HLA）的相容性过大所致，患者与正常生育妇女的免疫状态不同，表现在体液免疫的异常及血清中缺乏封闭抗体等方面。免疫性因素造成的流产是复发性流产最重要的原因，过去所谓的不明原因流产80%与免疫因素有关。免疫型流产中又以封闭抗体（APLA）缺乏造成的同种免疫型复发性流产发生率最高。,如何确诊复发性流产的病因,复发性流产的诊断实际上为排除性诊断，因此，至少要对复发性流产的两大病因进行系统筛查。,非免疫因素检查：,双方染色体检查：所有的RSA患者夫妇双方都要进行外周血染色体核型检查，排除染色体数量和结构的异常。生殖道解剖结构检查：B超、输卵管造影、宫腔镜、腹腔镜、磁共振；生殖内分泌检查：性激素6项、子宫内膜活检、甲状腺功能、空腹血糖、葡萄糖耐量试验（OGTT）、胰岛素拮抗（IR）测定；生殖道感染检查：衣原体；支原体；淋菌及-溶血性链球菌培养；梅毒血清实验（RPR）；艾滋病抗体（HIV）；优生5项（TORCH）：巨细胞病毒(CMV-IgM或IgG)、弓形虫(TOX-IgM或IgG)、风疹病毒(RV-IgM或IgG)、单纯疱疹病毒I型(HSV-I-IgM或IgG)、单纯疱疹病毒II型(HSV-II-IgM或IgG)。,免疫因素检查：,自身免疫型复发性流产：抗心磷脂抗体（ACA）：ACA以IgG类最具临床意义，ACA IgM、IgG检查2次，每次间隔6周。抗核抗体（ANA）、狼疮抗凝因子（LAC）、2糖蛋白（2GP-）、D-二聚体、凝血4项、补体3、补体4。同种免疫型复发性流产： 封闭抗体（APLA）：阴性结果表示女方血清中缺乏此APLA ，易发生复发性流产。细胞免疫型检查：CD19（B淋巴细胞表面标志）、CD16、CD56（NK细胞表面标志）、CD3、CD4、CD8（T淋巴细胞分群）。免疫型不孕：抗精子抗体、抗子宫内膜抗体、抗卵巢抗体、抗HCG抗体、抗甲状腺抗体、PCT、体外交叉精子宫颈粘液接触试验（SCMCT）。母儿血型不合溶血病：夫妻检查ABO血型、Rh血型。,2次或2次以上自然流产；2次或2次以上试管婴儿（VF-ET）失败；控制性超排卵周期，卵泡发育不良，6个卵泡；枯萎卵；内膜生长不良、菲薄、三线征不典型；原因不明性不孕；免疫紊乱史，如ANA阳性、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等；不明原因胎儿生长受限（FGR）妊娠、羊水过少妊娠史。,哪些人需要做免疫因素检查,什么是封闭抗体,在正常孕妇的血清中，存在一种抗配偶淋巴细胞的特异性IgG抗体(Antipaternal lymphocyte antibody, APLA)，它可抑制淋巴细胞反应（MLR），封闭母体淋巴细胞对培养的滋养层的细胞毒作用，防止辅助T细胞识别胎儿抗原的抑制物，并可阻止母亲免疫系统对胚胎的攻击。封闭同种抗原刺激的淋巴细胞产生巨噬细胞移动抑制因子（MIF），故称其为封闭抗体（blocking antibodies,BA）。,封闭抗体缺乏为什么会发生复发性流产,现代生殖免疫学认为，妊娠是一个极其复杂的生理过程。胚胎所携带的基因有一半来自母体，另一半来自父体。来自父体的抗原对于母体来说是外来抗原，母亲体内的免疫系统就会自动去清除它。但是，绝大多数妇女却能继续正常妊娠至足月，其原因就是因为妊娠以后有免疫耐受机制的存在，其中封闭抗体的产生起了重要的作用。研究认为，孕妇血中的APLA可以表现以下作用： APLA中和同种异体抗原，而不使胎儿受到排斥； 抗体直接作用于具有免疫能力的细胞如：CTL细胞、NK细胞等； 直接结合到靶细胞的抗原上，从而降低它们对受体细胞参与的免疫反应的敏感性。如果母体缺乏封闭抗体，则导致同种免疫识别保护功能低下，将来自父体的一半当作异物排斥，就会导致流产。流产次数越多的患者，其体内封闭抗体缺乏的可能性越大。封闭抗体的产生不足，使得免疫系统容易对胚胎产生免疫攻击，母体对胎儿产生强烈的排斥现象，妊娠早期可出现复发性流产，妊娠晚期则可出现妊娠高血压疾病、胎儿宫内生长受限，甚至出现胎死宫内，最终导致流产。,封闭抗体缺乏如何治疗,封闭抗体阴性表示女方体内缺乏封闭抗体，容易发生复发性流产，需要使用丈夫或第三方血液中的淋巴细胞给患者皮内注射，使之体内产生封闭抗体，以保护胚胎不被母体当做异物排斥。这种治疗称为淋巴细胞主动免疫治疗，简称主动免疫治疗(LIT)。,主动免疫疗法的作用机制,诱导封闭抗体产生；促使Th1/Th2细胞因子平衡向Th2偏移，包括外周血和蜕膜局部；调节T淋巴细胞亚群比例，包括CD4/CD8比例、T/T等；下调NK细胞活性；纠正共刺激分子CD80、CD86表达异常。,哪些人需要做淋巴细胞主动免疫治疗,流产次数达2次或2次以上，封闭抗体检测为阴性；夫妇双方染色体正常；妻子无生殖道解剖异常及其他妇科检查正常；内分泌检查正常，免疫球蛋白和甲状腺功能正常；无弓形虫、巨细胞病毒等感染；自身抗体检测阴性；夫妻双方肝、肾功能正常；夫妻双方同意接受主动免疫疗法，签署知情同意书。,封闭抗体如何进行检测,同种免疫型反复性自然流产患者主动免疫治疗前后需要进行封闭抗体检测，方法为抽取患者外周血2ml，分离血清（7日内检测2-8储存，超过15日后检测需要-20储存），用ELISA法进行测定，如果APLA阴性，则需要进行淋巴细胞主动免疫治疗。,如何选择供血者,供血者首选患者丈夫。由于使用丈夫的淋巴细胞简便、副作用少，故目前临床上倾向于使用丈夫的淋巴细胞作为免疫原。如果患者丈夫因患乙肝、丙肝等血液传染疾病不能供血，可采用无关第三个体的淋巴细胞进行治疗，效果无差异。最好选择与患者没有血缘关系的健康人，供血者与患者有血缘关系效果稍差。抽血者须空腹抽血；必须即抽即用，不可库存。,免疫治疗前要做哪些检查,双方检查血常规、ABO及Rh血型；甲肝IgM、丙肝IgM、乙肝二对半；梅毒血清实验（RPR）、艾滋病抗体（HIV）；供血者检查无异常方可做免疫治疗，检查结果3个月有效。,免疫治疗的时机及方法,一般主张从妊娠前开始免疫，抽取供血者外周血30ml，肝素抗凝，在无菌条件下淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，调至浓度为2410 7 /ml，细胞悬液量约3 ml，将分离出的淋巴细胞注射到女方的左右上臂皮内，共注射68个点。注射时间不受月经期影响。每隔23周一次，4次为1个疗程，治疗过程中避孕。多采用2疗程法，孕前孕后各免疫一疗程。第一疗程完成后2周复查封闭抗体，如果复查结果封闭抗体转阳或弱阳，鼓励患者在3个月内妊娠，妊娠后仍需维持治疗，怀孕56周继续再进行一个疗程主动免疫治疗，每2周1次，共4次，妊娠16周后一般不需要加强免疫。转阳性3个月后未妊娠，可每23个月巩固治疗一次，或重新治疗1个疗程。如果复查结果封闭抗体仍为阴性，重复免疫治疗一个疗程，直至封闭抗体转阳；如果三个疗程仍未能转阳，则需要另觅治疗方法。部分患者可能在未完成一个疗程的时候已经怀上，那仍然需要至少完成一个疗程的治疗。,主动免疫治疗效果预测和评价指标,免疫疗法主要使被治疗者产生同种免疫反应，因而检测治疗过程中的免疫反应效果，应根据是否产生封闭抗体来判断。检测方法通常有以下几种：封闭抗体ELISA法测定：封闭抗体阳性则认为效果良好，可以妊娠。封闭抗体仍然阴性，需要进行第二个疗程治疗。皮肤迟发型变态反应：皮内接种淋巴细胞的部位产生发红与硬结时，可认为已发生迟发型变态反应；如不能产生迟发型变态反应，提示接种的淋巴细胞数量少或活性低下。迟发型变态反应有缩小倾向者，下次妊娠预后良好。T细胞及NK细胞活性测定。,主动免疫治疗的安全性,主动免疫治疗在全球应用已有20余年，其主要的副作用为感染性疾病（如肝炎、HIV等），输血反应、过敏反应、移植抗宿主反应等。关于其对母体免疫功能的影响，到目前为止尚未见有易感染和恶性肿瘤的报道。关于对子代的影响，林其德、张建平、李大金等经过十多年的观察，未见主动免疫对母体及子代产生明显副作用。主动免疫的后代在出生体重、体格生长发育和智力，包括个人-社会、语言、精细动作-适应性、大运动4个能区方面与同龄儿童比较差异无显著性意义。综合国内外文献，多数学者认为主动免疫疗法是较为安全的。,主动免疫治疗的疗效,主动免疫疗法在全球应用已多年，疗效肯定，但各家报道的疗效差异显著：71100。由于同种免疫型RSA的诊断是建立在排除其他病因基础上的，因此，对于治疗失败的患者应重新进行详细的病因筛查，尤其要排除胚胎染色体核型异常。,反复自然流产患者免疫治疗前后封闭抗体的变化及其意义（中国卫生检验杂志2007年10月第17卷第10期）中山大学附属第二医院,习惯性流产患者免疫治疗前后封闭抗体的变化及其意义（广西医学2009年1月第31卷第1期）广西妇幼保健院,封闭抗体检测方法,一、 CDC方法：微量淋巴细胞毒二、 FCM方法：流式细胞仪三、 ELISA方法：酶联免疫法,CDC方法,阴性,阳性,原理：HLA抗体与淋巴细胞表面的相应抗原结合后激活补体，导致细胞膜损伤，通透性增强，染料进入细胞，细胞死亡。在倒置相差显微镜下观察，着色的细胞为死亡细胞，视野下有较多细胞死亡为阳性 。,特点： 操作繁琐，检测活细胞，要求标本新鲜； 假阳性，假阴性率高。 此方法目前已基本淘汰。,FCM方法,CD3阳性,CD8阳性,检测CD分子如CD 3 、CD 4 、CD 8等,特点： 仪器昂贵； 检测多个CD, 准确性高 。,ELISA方法,直接检测HLA抗体等，操作简便；结果方便易读，尤其适用于大样本的检测；无须使用荧光显微镜，流式细胞仪等，成本低；结果不是很准确，假阳性，假阴性率高。,HLA基因组成,一、 HLA类基因经典类基因（HLA-a）:分为A、B、C，高度的多态性。非经典类基因（HLA-b）:分为E、F和G等基因。二、 HLA类基因分为DR、DQ、DP、DNA、DOB和DM六个亚区。长约 1000Kb.三、 HLA 类基因人类基因组中密度最大的区域。位于类和类区之间，长1000kb.编码补体有关的基因：C2、C4A、C4B、Bf、TNFA和TNFB、Hsp70-1、Hsp70-2和Hsp-Hom、CYP21A和CYP21B。,全国已有三百多家医院及检测机构开展封闭抗体检测,2009年第一届封闭抗体培训会议在粤召开,免疫治疗知情同意书,参考文献,1 习惯性流产患者免疫治疗前后封闭抗体的变化及其意义. 李东明,甘腾华,穆小坚,欧珊,许涓涓,辛瑞宁. 广西医学, 2009,31(1).2 反复自然流产患者免疫治疗前后封闭抗体的变化及其意义. 罗晓红,张金华,李晓园,王英,侯玲玉,段朝晖. 中国卫生检验杂志, 2007(10).3 淋巴细胞主动免疫治疗复发性流产的临床研究. 梁宝珠,谭忠伟,黎彩鹏,李玉萍. 中国妇幼保健, 2007(25).4 联合主动免疫治疗原因不明习惯性流产疗效分析. 郝桂琴,李蓉,刘晓平,笪坚,侯震晖,郑琛琛. 生殖医学杂志, 2006( 6).5 原因不明习惯性流产者免疫治疗前后APCA的比较. 施选性,孙悦玲,纪树芳. 中国优生与遗传杂志, 2005(10).6 反复自然流产不孕患者的封闭抗体检测与治疗. 吴日然，谭志伟，廖月婵等. 医药论坛杂志，2005, 26(9) : 7-9.7 用丈夫淋巴细胞治疗原因不明性习惯性流产59例分析. 杨玉发，张国清，黄玲惠等。宁夏医学杂志，2005, 27 (8) : 557-558.8原因不明性反复自然流产患者免疫治疗结局的探讨. 李尚为，黄仲英，马黔红等。实用妇产科杂志， 2001, 17 (2) : 105-106.9 SzpakowskiA, MalinowskiA, Glowacka E。The influence of Paternal lymphocyte immunization on the balance of Th1/Th2 type reactivity inwomen with unexp lained recurrent spontaneous abortionJ. Ginekol Pol, 2000, 71 (6) : 586-592.10 Pandey MK, Agreawal S. Induction of MLR-Bf and p rotection of fetalloss a current double blind randomized trial of patemal lymphocyte immunization for women with recurrent spontaneons abortion J. Int Immunopharmacol, 2004, 4 (2): 289-298.