【毕业学位论文】生物质谱技术在真菌源激活蛋白研究中的应用硕士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 生物质谱技术在真菌源激活蛋白 研究中的应用 士研究生 ： 龙承祖 指导教师 ： 邱德文 申请学位类别 ： 理学硕士 专业： 微生物 研究方向 ： 药物工程 培养单位 ： 中国农业科学院研究生院 植物保护研究所 提交日期 2006 年 06 月 F 006 基金来源声明 本学位论文是国家“863” 计划（项目编号： 2003国家 “973”计划（项目编号： 2003部分内容。 论文评阅人、答辩委员名单 论文题目 生物质谱技术在真菌源激活蛋白研究中的应用 论文作者 龙承祖 指导教师 邱德文 培养单位 植物保护研究所 姓名 职称职务 导师类别 单位 专业 硕导 博导 硕导 博导 评 阅 人 硕导 博导 答辩 主席 硕导 博导 硕导 博导 硕导 博导 硕导 博导 硕导 博导 答 辩 委 员 硕导 博导 答辩时间、地点 记 录 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议 ) 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 摘 要 本研究运用生物质谱技术对真菌源的蛋白激发子进行了鉴定与分析。该类蛋白激发子在交链孢菌（、纹枯病菌（、黄曲霉菌（、葡萄孢菌（、稻瘟菌 （ 青霉菌（、木霉菌（ 、镰刀菌（ 等多种真菌都有发现，我们将其命名为激活蛋白。该类蛋白的分离、纯化和生物质谱分析国内外未见报道。本研究采用了 源激活蛋白进行了分离，纯化，肽段序列测定和翻译后修饰鉴定。 肽指纹图谱（分析结果表明 源激活蛋白是一类新的蛋白激发子。运用从头测序（ de 串连质谱（ S ）等方法建立了一套测定激活蛋白的序列的生物质谱技术。测定了三种真菌来源激活蛋白部分肽段序列。 源的激活蛋白实现了微量蛋白的精确分子量测定, 确定了均一化程度。在对来源于葡萄孢菌 ( 激活蛋白的翻译后修饰分析中发现其存在泛素化。泛素化是一类重要的蛋白翻译后修饰，与蛋白转运和降解调节有关。 序列分析发现来源于 激活蛋白部分序列与 白中保守序列同源。白在新生多肽合成中起重要作用，还是重要的转录调控因子。保守序列三维结构上是 对模式真菌 蛋白组学研究鉴定了与结构，代谢调控，信号传导相关蛋白1467 个。通过该研究，建立了蛋白组研究 S 研究体系，为下一步在蛋白组学层面研究激活蛋白及其与植物的相互作用打下了基础。 关键词：生物质谱，激活蛋白，蛋白鉴定，肽序列测定，翻译后修饰 to a of of et be by S de S/MS to by a of t be of its to in an in to is as a of is as of be We S 467 be to at 录 第一章 引言 .究概述.白类激发子研究进展.于生物质谱的蛋白研究.物质谱在激发子与植物互作研究中的应用.究目的与意义.二章 激活蛋白纯化与精确分子量测定. .于生物质谱分析的真菌蛋白纯化. 16 准蛋白混合物的分离和精确分子量测定.源激活蛋白精确分子量测定.三章 激活蛋白 究 .液内酶切与衍生化.内酶切、 .活蛋白的肽指纹图谱.活蛋白 究.四章 电喷雾质谱研究蛋白质组技术体系的建立 .肽液质联用分析.式蛋白液质联用分析.式真菌蛋白组学研究.五章 激活蛋白鉴定与序列分析. .源激活蛋白鉴定与序列测定.源激活蛋白鉴定与序列测定.源表达激活蛋白鉴定与序列测定.活蛋白序列分析.白结构与功能初探.六章 结论. .录 B考文献.80 致谢.者简历.英文缩写 英文全称 中文 1DE 维电泳 2DE 向电泳 2二维色谱 基酸 腈 牛血清白蛋白 细管液相色谱 CE 细管电泳 撞诱导解离 蒸水 de de 头测序 喷雾 D by S 维凝胶电泳分离- 液相效液相色谱 点聚焦 子阱 道尔顿 基质辅助激光解析电离 of 质辅助激光解析电离- 飞行时间质谱 of of 质辅助激光解析电离- 飞行时间串联质谱 升级色谱 MS 谱 S 联质谱 升级色谱 合酶链式反应 指纹图谱 后衰减 二烷基硫酸钠 羟甲基氨基甲烷 氨基酸精确分子量及结构 A A S V 7 S 1 O C H 2 4O 1 8406 2 O 11 10 2引用自 C H N O 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 第一章 引言 究概述 植物与微生物的相互作用一直是农业研究中的重要课题。微生物既可能是一类重要的植物病原菌，如每年造成大量水稻减产的稻瘟病（，也可以被利用于农业生产，比如一些卵菌和细菌的产物可以诱导寄主和非寄主的防卫反应，增强植物抗病能力（王金生，2001 ）。 植物发病是“ 植物- 微生物” 体系相互作用的结果，发病的表型取决于寄主、病原物和环境条件三者的相互关系。对该体系的研究提出了很多重要的理论和假设。 历十余年对亚麻亚麻锈病( 体系的研究，在 1956 年提出基因对基因假说 (, 1996) 。其它重要理论还有：植物对微生物的侵染产生的抗病性可以分为垂直抗性和水平抗性；植物的防卫机制有组成型和诱导型；植物和病原菌的相互作用也分为非亲和互作以及亲和互作等。虽然有众多的理论和假说的提出，但面对纷繁复杂的植物- 微生物体系，人们意识到要更好地理解和研究该问题需要更多地在系统层面上进行分析，仅对其中一两个物质做简单的测定和研究很难合理解释目前的现象，这就对研究思路和分析仪器提出了挑战。 白类激发子研究进展 激发子是一类可以诱导寄主产生防卫反应的特殊物质（王金生， 2001） 。当病原物和寄主植物接触后，由于激发子的作用引起寄主植物发生变化，比如抗病基因的诱导表达，抗病物质的产生，细胞调亡，过敏反应（等等。这些反应阻止或限制了病害的发展，减小其危害。由于该物质的作用在“ 植物- 微生物 ”互作事件中处于上游，是其他反应（如与受体结合，信号传导，抗病基因诱导表达等）的源头，因此对其研究就显得尤为重要。 激发子从来源上可分为：生物源和非生物源。生物源的激发子是由病原微生物，其他微生物和寄主植物或由寄主植物与病原微生物互作后产生。由病原微生物，其他微生物产生的称为外源激发子，由寄主植物自身产生的是内源激发子。从产生先后来看，生物源的激发子又可分为原发激发子和次生激发子。由病原微生物或寄主植物直接产生的叫原发激发子；寄主植物与病原微生物互作后产生的叫次生激发子。非生物源的激发子则是一些理化因子，比如重金属离子、表面活性剂、抗代谢物质和机械损伤等。 白类激发子 生物源激发子主要有蛋白、寡糖和糖蛋白等。蛋白激发子中根据来源又分为下面几类： 第一类，卵菌糖蛋白，如大雄疫霉中的 42蛋白；卵菌蛋白，如隐地疫霉（P. 中的 10白（隐地蛋白， 其他疫霉（P. P. P. P. P. P. P. et 也可产生 10外蛋白，对烟草都有激发子活性，这类蛋白被归为激发子中的激发素（类型； 1中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 第二类，细菌蛋白，如 1992 年首次报道从梨火疫病菌 ( 分离到约 44 激发激发子 常用，后来人们又从丁香假单胞丁香致病变种（发现编码使烟草产生过敏反应的蛋白激发子第三类，病毒外壳蛋白，比如 壳蛋白在 N抗病基因的烟草可表现特异的过敏反应。 第四类，真菌激活蛋白，近年来，来源于交链孢菌（ 、葡萄孢菌（ 、稻瘟菌 （ 真菌的蛋白激发子也见报道（邱德文，2002 ，2004 ）。 活蛋白（ 该蛋白是从不同种属的植物病原真菌中提取的一类原发、外源性的蛋白激发子（邱德文，2002） 。该类蛋白有较强的诱导植物抗病，促进植物生长的生物活性，理化特性上该类蛋白都有很好的热稳定性。 该类蛋白激发子在交链孢菌（ 、纹枯病菌（、黄曲霉菌 （ 、 葡萄孢菌 （ 、 稻瘟菌 （ 青霉菌（ 、木霉菌（ 、镰刀菌（ 等多种真菌都有发现，不同来源的蛋白激发子在理化性质上略有差异，但生物活性相似或接近。来源于稻瘟菌的激活蛋白其基因和蛋白序列不同于过敏蛋白和隐地蛋白。该蛋白不激发烟草植株的过敏反应，这与 生物活性均基于植物的过敏反应有所区别。三种 蛋白激发子的特征对比见表 类蛋白激发子对比情况 敏反应 蛋白激发子 类型 主要生物来源 专利情况 热稳定性 分子量（烟草寄主） 卵菌（ P. 地蛋白（ 法国专利 1985 年 1015有或无 无报道 细菌（ E. 敏蛋白（ 美国专利 1992 年 3040 高 真菌（A. 激活蛋白（ 中国专利 2000 年 3070 很高 目前研究结果显示，该类激活蛋白主要通过激活植物体内分子免疫系统，提高植物自身免疫力；通过激发植物体内的一系列代谢调控，促进植物根茎叶生长和叶绿素含量提高，从而达到提高作物产量的目的（赵利辉， 2005） 。基因芯片分析结果表明，激活蛋白处理后的水稻一系列与防御和生长相关基因上调表达（黄丽俊，2005 ）。 激活蛋白可湿性粉剂已经商业化生产，大田推广中取得了良好的效果，具有广泛的应用前景。2中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 激活蛋白诱导处理种子能加快黄瓜种子的萌发，促进幼根的生长；提高多种瓜果蔬菜的座果率，如处理西瓜和番茄可使瓜果数和果重显著提高，分别达到 ，对白菜有显著的抗病增产作用，同时能大幅度提高白菜的品质（邱德文等， 2005），同时，研究还发现该蛋白制剂能够成倍地提高 鳞翅目害虫的防治效果，增效达 ( 邱德文，曾凡荣等，2005) 。 除了上述生物活性外，在蛋白自身结构上，该类真菌源激活蛋白有很好的热稳定性，在 100沸水中处理半小时仍然具有生物活性，但耐热机制尚不清楚。其耐热机理研究在大分子结构生物学和酶工程上有重要的理论和实际应用价值。蛋白一般是一种热不稳定的大分子，过高的温度会导致其变性和降解。现在发现自然界中存在少量热稳定的蛋白分子，比如 可以在较高的温度发挥酶活性。对该类热稳定的蛋白分子结构研究不论是在结构生物学还是酶工程上都有重要的理论研究和实际应用价值。推动分子生物学重大发展的 术就是有赖于从嗜热古菌中提取的热稳定性较高的 的运用。在较高温度下酶活性的降低是困扰发酵工程的一大难题，对热稳定蛋白的研究可以从结构上提供一些线索和帮助。 于生物质谱的蛋白研究 白及其序列研究概述 随着后基因组学时代（的到来，人们更加关注在基因组表达产物蛋白组学的层面上来研究复杂的生命现象（2005 ）。鉴定蛋白和确定其共价结构已经成为生命科学中的中心课题之一(006) 。蛋白的氨基酸序列是蛋白和其基因编码序列之间的桥梁，也是细胞生物学和遗传学之间的纽带，填补了基因序列和生命现象之间的鸿沟（2003）。蛋白的鉴定也为纷繁复杂的细胞调控网络的研究打开了一扇广阔的窗口(2006) 。 在基因组学革命之前，化学和酶解的方法被用于研究单独和高纯度的蛋白共价结构。 1953 年通过酸水解牛胰岛素得到短的二肽、三肽和四肽，这些短肽在 N 末端标记上 剂（ 2， 4成二硝基苯（肽，再用双向纸层析分离确定残基。通过比较拼接测定的肽序列， 功地排列了牛胰岛素两条多肽链中的全部 51 个氨基酸，本人也因其杰出工作获得 1958 年诺贝尔化学奖。 1950 年，入了 解技术，使蛋白序列分析有了突飞猛进的发展。多肽从 N 末端或 C 末端通过化学方法逐个降解下来后被分析鉴定，通过该方法鉴定了部分短肽序列。氨基酸分析仪（et 出现使高精度和定量分析氨基酸成分成为可能，该技术被应用于大分子量蛋白的序列研究，但也是局限在克量级和易于纯化的蛋白。 1967 年 表了 解程序，样品需要量已经减小到了毫克级。入的方法至今还在广为应用，虽然测序仪的自动化程度在不断改进，样品的需求量也到了 （微克级），但该方法引入 硫氰酸苯酯) 作为偶联剂的化学过程至今也没实质性变化。但如果多肽 N 末端被化学修饰而封闭，分析处理过程将更加烦琐。 1906 年， J. J. 明了质谱，但直到上世纪八十年代，质谱技术才被应用到蛋白研究上。传统的质谱技术电离样品方式不适用于多肽和大蛋白分子的研究，两项“ 软电离” 技术 B,1987 ）和 1989 ）的出现才使质谱用于多肽和大蛋白分子的研究成为3中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 可能，生物质谱技术也蓬勃发展起来。两项技术的主要开拓者 . 田中耕一为此获得2002 年度诺贝尔化学奖。 1994 年“ 蛋白组（ ”概念的提出，更是催生了一大批生物质谱新技术。 1995 年起生物大分子质谱技术就越过了分析仪器的界限溶入生物化学和生命科学的研究领域，并成为了目前蛋白组学研究的核心技术之一。随着各种新型仪器不断涌现，在新的蛋白研究策略中已经占据核心地位。从上世纪 90 年代中期起，基于质谱的技术路线策略已经取代 解技术成为了主要的多肽氨基酸序列分析方法。 基因组计划推动和促进了质谱技术成为蛋白鉴定和序列分析的核心技术。基因组学在高通量的复杂生物体系分析中显示了巨大的威力，基因组学提供的全基因组序列使质谱检测多肽的序列数据库快速准确比对提供了依托。 由于细胞或器官内表达所有蛋白质（即蛋白组）数量庞大，丰度差异巨大，异常复杂，使得目前对全蛋白组的分析仍是一个巨大的挑战。目前已知的是，蛋白组中蛋白的种类远远大于其对应的基因组编码基因数量。产生差异的原因是一个特定的基因可以通过下面的方式产生多种不同的蛋白质：初级转录产物的选择性拼接；基因序列的多态性（ ；蛋白翻译后修饰（和其他蛋白加工机制。另外蛋白丰度的巨大差异超过了所有分析方法和仪器单独使用的动态检测范围，比如血液中蛋白的丰度有 10 个数量级的差异（002）。在这重重困难下，蛋白和蛋白组学的技术也取得了一些突破性进展。 器原理和类型 质谱（ 测气相中离子化的分析物。从定义上讲，质谱由将分析物气化的离子源(，检测离子化样品荷质比（m/z）的质量分析器(记录每个离子荷质比数量的检测器(三部分组成。 生物质谱（是将质谱应用于分析高极性、难挥发和热不稳定性的生物大分子样品的质谱技术，如分析多肽、蛋白质、核酸和糖类等。生物大分子区别于普通化合物的特点就是其高的相对分子质量，普通质谱测定几十到 2000 相对分子质量，而生物质谱需要对上万和百万相对分子质量物质进行测定分析。 1 离子源 电喷雾离子源（和基质附助激光解吸电离离子源（是蛋白和肽质谱分析中的两种主要离子化技术。电喷雾离子源从溶液中将分析物离子化，因此它易于和液相分离技术（比如说色谱，电泳）联用（图 基质附助激光解吸电离离子源将分析物从固态，结晶基质中通过激光激发升华，离子化。基质附助激光解吸电离质谱一般用于分析相对简单多肽蛋白混合物，而液相色谱联用电喷雾质谱系统（则是复杂样品分析的首选方法。 4中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 图 喷雾离子源和基质附助激光解吸电离离子源 （ 2. 质量分析器 质量分析器是技术的中心。在蛋白组学中，关键的参数是灵敏度，分辨率，质量精确度和从多肽碎片中得到富含信息谱图的能力（串联质谱或二级质谱）。 在目前蛋白组学研究中有四种基本的质量分析器：离子阱，飞行时间，四级杆和傅立叶变换离子回旋共振质谱分析器。它们在设计和工作中差别很大，各有优缺点。这些分析器可以单独使用，在有的情况下也可以在一起串联使用以结合利用各自的长处，见下页表 各类型生物质谱结构见图 在常用的离子阱中，离子先被捕获或“ 保留” （）一段时间，然后进行质谱或二级质谱分析。离子阱分析器耐用、灵敏、相对廉价，所以目前文献中的大部分数据由它得到。离子阱一个缺点是它的相对低的质量精确度，原因之一是阱中储存离子总数有限。 傅立叶变换离子回旋共振质谱也是保留型质谱，它将离子在高真空和高磁场中捕获。它具有很高的灵敏度、精度、分辨率和动态检测范围。但它造价相对昂贵，操作复杂，多肽碎裂效率不高等缺点制约了其在蛋白组学研究中的广泛应用。 飞行时间质量分析器一般和 用，进行完整肽段质量的测定，而离子阱和三重四级杆质量分析器一般和 用，通过碰撞诱导解离方式从选择的母离子产生碎片离子。现在蛋白研究中还广泛应用各种质量分析器“杂交（技术，将三重四级杆与飞行时间质量分析器串联使用（见图 从而达到取长补短的效果。其他几种联用技术还有 子阱- 线性离子阱) ，四级杆- 四级杆- 线性离子阱) 等。 5中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 表 类型质谱性能比较 S 图 类型生物质谱结构（引用自 2003） in 6中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 关联用技术 虽然生物质谱有强大的分析测定功能，但对样品没有分离纯化的功能，大部分类型的仪器都有信号饱和上限和动态检测范围，太多的物质进入检测器还会有相互的抑制信号。在生物样品日趋复杂，有时甚至是细胞和器官的全部蛋白的情况下，质谱也需要和其他分离的方法联用，以期达到比较好的效果。 与质谱匹配的联用技术主要有，高效液相色谱（电泳技术等。其中反向高效液相色谱(毛细管电泳(可以实现与 在线连接（，近来也发展了高通量的高效液相色谱与 用的技术 S (M, 2003; , 2003; , 2005; , 2006)。电泳技术除了毛细管电泳还有 2凝胶电泳系统，凝胶电泳系统虽然不能实现样品的在线分离但其强大的分离和定量能力还是受到广大研究者的青睐，其中 2 配已经成了蛋白组学的经典策略。 目前在蛋白和蛋白组研究中广泛被采用的联用技术有： 2SI C+用技术的关键是通过分离降低样品的复杂程度，以上各种方法各有优缺点，需要根据实际样品特点和实验要求进行选择和搭配。 虽然目前有多种研究策略对复杂样品分析，但蛋白复杂样品中低丰度样品的检测仍然是个巨大的挑战。该问题可以通过在样品前处理中去除一些高丰度的蛋白，比如血清中的白蛋白等，但对未知样品该方法难以奏效。问题的关键在于目前的蛋白分离方法都是基于蛋白的理化特性分离蛋白，而高丰度蛋白很有可能在这些理化性质上与低丰度蛋白相同而无法分离。目前尚无一种有效的可以根据蛋白自身丰度分离其混合物的技术。与核酸不同，蛋白不存在自我扩增体系，无法采用类似核酸中的 术实现蛋白混合体系中微量蛋白组分的扩增和表达。现在的分子生物学要拿到大量某种未知蛋白还是需要先拿到该蛋白的氨基酸或核酸序列，体外扩增核酸，再通过载体转入合适的表达体系进行该蛋白的表达。 白结构的生物质谱分析 蛋白结构除了序列结构还存在各种高级结构，生物质谱在蛋白各个层面研究都有重要应用，见下表 004） 7中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 表 物质谱蛋白研究中在各个层面的应用 of S in of 白结构 初级结构 二级结构 三级结构 四级结构 生物质谱应用 精确分子量 确定二硫键 构相 单体结构 氨基酸序列 折叠/ 非折叠 蛋白- 配体相互作用 翻译后修饰 蛋白- 蛋白相互作用 1. 一级结构 蛋白一级结构的研究是生物质谱最重要，也是最广泛的应用领域。举例来讲，可以通过肽指纹图谱或 S 测定未知蛋白氨基酸序列鉴定该蛋白，如果数据库中没有该蛋白序列信息，可以采用 de 术测定部分肽段序列，用该序列设计 物，扩增得到编码该蛋白的基因序列从而得到蛋白序列和表达蛋白。对表达蛋白可以测定其精确分子量与理论分子量对比，如果有差异可以考虑蛋白表达是否正确，是否有突变，或是否发生了翻译后修饰。如有突变和修饰可以通过肽指纹图谱或 S 测定其突变位点和修饰类型、位点等。 A. 测定分子量 分子量是蛋白的重要物理参数也是判断蛋白均一性的重要依据（沈同，1990 ）。测定蛋白精确分子量是生物质谱的重要应用领域。生物质谱在测定蛋白精确分子量有不可比拟的优势。 传统的蛋白分子量测定通过超离心分析、光散射法、 分子筛色谱（ 。超离心分析和光散射法需要较多的蛋白用量和高级的专门仪器，现在应用较少（夏其昌等，2004 ）。 能粗略测定蛋白分子量，误差在 10%左右，当蛋白存在磷酸化或糖基化等修饰时误差更大且蛋白条带弥散很难准确测定，同时也很难测定多肽的分子量。该方法较适用于10白。但该方法成本低廉，所需仪器和技术简单，仍然为各实验室广泛采用。 分子筛色谱（也存在同样的问题，该方法通过测定各种标准蛋白在分子筛色谱柱上的保留时间，作出标准曲线，与未知蛋白保留时间比较从而得到其分子量。该方法也存在误差大，因为保留时间与蛋白形状相关，同样分子量的球状蛋白和棍状蛋白保留时间差异较大，而且对样品需要量较大, 很难实现微量蛋白和多肽的测定，同时也存在检测范围有限的缺点。 软电离技术使完整蛋白分子和多肽的精确分子量测定成为可能。生物质谱是目前唯一可测定微量蛋白和多肽的精确分子量的方法。该方法灵敏，所受限制少，小到几百 多肽，大到几百 大蛋白，通过选用适当的生物质谱技术和参数都可以实现测定。 白在 般带一个电，两个点信号较弱，有时也有二聚体的信号。多肽一般都是带一个电，但带电原理至今也不是很清楚，对几百 大蛋白分子量实现测定。具体过程先用精确分子量已知的标准蛋白或多肽调谐（仪器 , 再对相应调谐范围内的未知样品测定。虽然该方法每次实验的动态检测范围也是有限的，但可以通过调整参数设置方便地实现对宽范围分子量的蛋白进行分子量的准确测定。 8中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 蛋白一般同时带上十到几十个电荷，且电荷连续分布，这样就形成了多电荷图，见下图： 图 论的多电荷图 S of 电荷图可以通过计算、重组（为蛋白的实际分子量 如图假设相邻两电荷峰的 m/Z 分为 m1, 其所带电荷数分别为 n, 蛋白实际分子量为则有： M+n)/n M+(解该二元一次方程组即可得到蛋白的实际分子量 M。注意，手工计算时，所带电荷数分别为 n 要取整数。 与 比，