微生物活菌计数方法-演示文稿（修改）2011.4.15

微生物活菌平板计数方法和技术微生物肥料和食用菌菌种质检中心曹凤明微生物计数方法种类直接计数法核酸计数法活菌计数法（培养法）NMPN（MOSTPROBABLENUMBER）最大可能数法N混菌法N平板技术法直接计数法1显微镜直接计数比浊法3电子计数器计数法1显微镜直接计数显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液血球计数板菌体较大的酵母菌或霉菌孢子细菌计数板一般细菌用途快速了解发酵液的菌数。常用于生产线上生产过程控制。缺点不易区分基质颗粒、死菌体和杂菌，计数与真实菌数有很大差异。不能作为规范的计数方法。2比浊法比浊法根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度OD值值表示表示样品菌液浓度。根据浊度计算出细菌的数量。该方法一般样品菌液浓度。根据浊度计算出细菌的数量。该方法一般可以估计出细菌的数量级。可以估计出细菌的数量级。常用于一些特殊的微生物的快速计数，如光合细菌和藻常用于一些特殊的微生物的快速计数，如光合细菌和藻类的测数。但是由于该方法仅能估测菌数，不能准确定量类的测数。但是由于该方法仅能估测菌数，不能准确定量，而且由于一些颗粒和添加剂的作用，不能正确反映样品，而且由于一些颗粒和添加剂的作用，不能正确反映样品的质量，所以在质检过程中不予采用。的质量，所以在质检过程中不予采用。3电子计数器计数法电子计数器计数法工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。电子记录装置上。该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。不适于微生物肥料产品的检测。不含任何碎片。不适于微生物肥料产品的检测。生产性建设投资指直接用于物质生产或直接为物质生产服务的建设投资，包括农、林、运输、邮电、商业、仓储及建筑业建设等投资。非生产性建设投资指用于非物质生产部门及用于满足人民物质文化生活需要的投资，包括卫生、体育、文化、教育、房地产、公用事业、金融、保险业等的投资。积极投资指用于购买机器设备等直接生产产品的生产资料的投资。（旨在获得最大的经济效益，投资风险较大）消极投资指用于建设道路、厂房等非直接生产产品的生产资料的投资。（分散投资风险，不以收益最大为目标）核酸计数法L每一种生物都有一套自己独有的遗传物质，脱氧核糖核酸和核糖核酸，即DNA和RNA。随着核酸分析技术的发展，已经能够利用遗传物质对生物进行定性和定量的测定，而且更为灵敏、迅速、专一性强。L实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光集团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。L此法操作精细繁琐，仪器和试剂昂贵，而且经常受到死菌体的干扰。暂时不能成为微生物肥料活菌计数的方法。活菌计数法（培养法）MPN（MOSTPROBABLENUMBER）最大可能数法（主要用于光合细菌和（粪）大肠菌群的测定）混菌法（适用于兼性厌氧微生物的测定）取10ML不同稀释度菌悬液于灭菌平皿内，将冷却至50左右的1520ML培养基倒入培养皿内轻轻混匀，培养计数。（食品中乳酸菌总菌数的测定）平板计数法（最常用的方法）平板计数法使不可见的微生物在人工培养基平板上生长成为可见的菌落（CFU），从而可用肉眼进行观察、计数。较其他方法直观准确，是一种经典的检测活菌数的方法，也是目前国际上通用的方法。制备一定体积的菌悬液，作一系列的倍数稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，计算出样品中的活菌数。平板计数法示意图平板计数的优缺点优点直观、准确、可靠该方法不仅可以检测到样品中的有效活菌数，而且可以检测到产品的微生物污染情况，即杂菌数。缺点由于培养基和培养条件的局限性，所得的结果一般低于实际值。平板计数法（一）检测前的准备（二）操作过程（母液制备、系列稀释、加样、涂布、培养、菌落识别、计数）（三）计算方法（一）检测前的准备天平，摇床，酒精灯，培养箱，染色液，显微镜，灭菌锅，烘箱等无菌间或洁净工作台消毒吸管、刮刀、培养皿的洗涤、包扎、灭菌稀释用三角瓶水制备、灭菌培养基制备和平板制备培养基制备培养基指人工方法配合而成的，专供微生物培养、分离、鉴别、研究和保存用的混合营养物制品。培养基的选择需要了解目的微生物的基本特性，选择正确的培养基培养基的制备流程按微生物肥料实验用培养基技术条件规定执行，NY/T11142006培养基标识清晰，培养基名称，配制日期等。检测前的准备检测前的准备平板制备灭好菌的培养基冷却至50左右（以不烫手为宜），在无菌状态下倾注培养基。倾倒平板前应将培养基摇匀，防止在瓶底有沉淀。但是摇动时要防止产生大量气泡。通常条件下平板制备好后室温放置或温箱放置23天使用，目的一可以检查培养基是否灭菌彻底，是否在倾倒过程被微生物污染；二为了使平板表面干湿适宜，防止菌落由于平板上的水滴运动而连片以致无法计数。检测前的准备检测前的准备系列稀释水的准备L水蒸馏水或生理盐水L三角瓶150ML,500MLL装量45ML,100ML或90MLL灭菌高压蒸汽灭菌，12130MIN检测前的准备检测前的准备（二）操作过程L21母液制备L22系列稀释、加样和涂布L23培养L24识别和计数21母液（基础液）的制备样品混合均匀很重要固体样品称取10G左右样品加入到100ML无菌水（500ML三角瓶）中，静置20MIN。液体样品量取100ML样品加入到90ML无菌水（500ML三角瓶）中，静置20MIN。分散菌体将三角瓶置于摇床上200R/MIN振荡30MIN，即成母液菌悬液。22样品稀释、加样和涂布准备工作应将平板上做好标记，包括培养基种类，样品编号，稀释度/稀释倍数；将小瓶无菌水写好样品编号、稀释度/稀释倍数。具体过程见GB202872006农用微生物菌剂221系列稀释用无菌吸管分别吸取50ML上述母液菌悬液加至45ML无菌水（150ML三角瓶）中，按11010倍进行依次稀释，分别得到101，102，103，104等浓度的菌悬液（每个稀释度应更换无菌吸管）注稀释度101，102，103，104，105相当于稀释倍数101，102，103，104，105222加样和涂布每个样品取3个连续适宜稀释度，用05ML无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液01ML，加至预先制好的培养基平板上，分别用无菌玻璃刮刀菌悬液均匀地涂于平板表面。每一稀释度每种培养基做3个重复，同时以无菌水作空白对照。稀释、加样和涂布注意事项整个程序应在无菌间或超净台内进行，操作人员时刻有无菌概念适宜稀释度根据标准或企业提供的信息选择稀释度。系列稀释时不同的稀释度应更换吸管（移液管），加样和涂布不同稀释度时也要更换吸管和刮刀。每个培养皿均要标明培养基种类、样品编号、稀释度稀释和加样要准确，涂布均匀及时，使用的吸管量程要适宜。无菌水对照，以检查吸管、刮刀以及稀释用水灭菌是否彻底、操作过程是否合乎无菌要求。23平板的培养将涂布好平板放在适宜的条件下培养如温度条件气体条件培养时间平板倒置培养24菌落识别和计数通过菌落识别、涂片染色、镜检观察，确定有效菌。（必要时做生化实验）选择性培养基上长出的菌落并非都是有效菌，培养基的选择性是相对的。一种有效菌只在一种特定培养基上计数，不同培养基上同一种有效菌不能累加。细菌杂菌（包括放线菌）在培养细菌的培养基上计数；霉菌和真菌杂菌在真菌培养基上计数。但也不能重复计数。（三）计算L31有效稀释度的选择L32标准差L33计算公式及示例31有效稀释度的选择参见标准GB202872006的6324示例（表格）计数原则以出现20300个细菌菌落数的稀释度的平板为计数标准，丝状真菌为10150个菌落数。当只有一个稀释度，其平均菌落数在20300之间时，则以平均菌落数计算。若有两个稀释度，其平均菌落数均在20300之间时，应按两者菌落总数之比值决定若其比值小于等于2应计算两者的平均数；若大于2则以稀释倍数小的菌落平均数计算。例次不同稀释倍数的菌落平均数两个稀释倍数度菌落数之比菌数亿/G,ML1031041051无法数无法数253/25302无法数31532/3203313383/0384289322110305无法数1363425/63250/003271530/001532标准差标准差STANDARDDEVIATION各数据偏离平均数的距离（离均差）的平均数，它是离差平方和平均后的方根。用表示。标准差体现随机变量取值与其期望值的偏差。标准NY4112000固氮菌肥料的7262。平板上菌落数对应的标准差要求平板上菌落平均数，个/皿20505199100300标准差100200500标准差分析（例子）重复I重复II重复III平均数标准差35482191007102733有效活菌数和杂菌的计算示例L样品编号AL样品状态颗粒L执行标准GB202872006L菌种名称巨大芽孢杆菌L称样量1010G重复稀释倍数（巨大芽孢杆菌在营养肉汤培养基上）/1031041051无法数11515有效菌数亿/G2无法数126193无法数12417菌落平均数/1217170120标准差/59/重复稀释倍数（细菌杂菌在营养肉汤培养基上）/1031041051无法数152杂菌数亿/G2无法数2543无法数183菌落平均数/193/019重复稀释倍数（霉菌在马丁培养基上）/10310410516/霉菌数个/G27/38/菌落平均数70/069106重复稀释倍数（真菌杂菌在马丁培养基上，不包括霉菌）/10310410513/真菌杂菌亿/G22/34/菌落平均数30/00030样品编号检测日期年月日室温，相对湿度，仪器名称、编号1培养箱2洁净室菌种名称依据标准培养温度，培养基培养时间，H基础液体积V1，ML样品量M0V0，GML加样量V2，ML稀释倍数K菌落数CFU/皿重复重复重复平均标准差N1无菌水对照计算公式NM108KV1/M0V2其中NM为质量有效活菌数或NV108KV1/V0V2其中NV为体积有效活菌数计算结果亿/GML备注检测人校核人审核人有效活菌数测定原始记录表样品编号检测日期年月日室温，相对湿度，仪器名称、编号1培养箱2洁净室依据标准基础液体积V1，ML样品量M0V0，GML加样量V2，ML培养基1培养温度，1培养时间，H1222真菌杂菌细菌杂菌类别稀释倍数K1，K2菌落数（CFU/皿）稀释倍数K3菌落数（CFU/皿）重复I重复II重复III平均重复I重复II重复III平均霉菌其他真菌无菌水对照无菌水对照真菌杂菌数霉菌杂菌数N1/GML细菌杂菌数N3亿/GML其他真菌数N2/