cdc20基因突变与小鼠结肠癌的发展（可编辑）

CDC20基因突变与小鼠结肠癌的发展暨南大学硕士学位论文CDC20基因突变与小鼠结肠癌的发展摘要目的探索CDC20基因突变对结肠癌发展的影响,并初步阐明其分子机制。方法应用同源重组技术进行载体打靶,构建了CDC20条件性敲除及点突变相结合的载体,LOXP/LOXP/并将构建好的载体,经囊胚注射构建CDC20基因敲除小鼠。将CDC20基因突变小鼠MIN/LOXP/MIN/与APC基因突变小鼠交配,运用PCR进行基因鉴定,得到CDC20APC基因型小鼠作为实验组,余基因型小鼠作为对照组。通过表型分析及组织学分析,比较实验组及对LOXP/MIN/LOXP/MIN/照组的差异并探求其分子机制。制作CDC20APC基因型、CDC20基因型、APC基因型和WT基因型的小鼠胚胎成纤维细胞MEFS,绘制生长曲线比较各种基因型MEFS生长情况。各种基因型MEFS细胞滴片计数染色体个数,并检测有丝分裂姐妹染色单体分离情况及是否存在非整倍体ANEUPLOID。构建PMXSE1ARAS病毒载体,将其转染入各种基因型MEFS细胞,进行克隆形成实验,阐明CDC20基因是否具有加快细胞转化的能力。通过上述体外细胞实验进一步证实并揭示CDC20对结肠癌发展的影响及其分子机制。LOXP/MIN/结果表型分析显示CDC20APC基因突变小鼠肿瘤个数与对照组无明显差异,肿瘤LOXP/MIN/的最大直径实验组和对照组之间无明显差异。病理切片显示,CDC20APC基因突变小鼠肿瘤恶性程度高,病理类型为腺癌,而对照组为腺瘤。各种基因型MEFS生长曲线显示MIN/LOXP/APCCDC20MEFS增殖速度要快于其他基因型的MEFS。克隆形成实验显示,转染MIN/LOXP/了PMXSE1ARAS质粒的4种基因型MEFS中,APCCDC20MEFS发生转化的速度MIN/LOXP/要快于其他组。MEFS细胞滴片计数染色体显示APCCDC20小鼠MEFS中可见姐妹MIN/染色单体的提前分离,且染色体数目异常要多于APCMEFS,大多数为38对。MIN/LOXP/结论1CDC20基因一条同源臂的敲除可促进小鼠结肠癌的发展。2APCCDC20MIN/LOXP/基因型小鼠MEFS中存在姐妹染色单体的提早分离及大量ANEUPLOIDY。3APCCDC20基因型小鼠MEFS可发生细胞转化,CDC20基因突变有致癌作用。4CDC20是通过基因不稳定来影响结肠癌的发展的。关键词CDC20结肠癌基因不稳定I暨南大学硕士学位论文CDC20基因突变与小鼠结肠癌的发展ABSTRACTOBJECTSDEMONSTRATETHERELATIONSHIPBETWEENCDC20MUTATIONANDTHEPROMOTIONOFCOLONCANCER,FURTHERMOREINDICATETHEMOLECULARMECHANISMMETHODSAPPLYHOMOLOGOUSRECOMBINATIONTECHNOLOGYANDBLASTOCYSTINJECTION,TOGENERATEMICECARRYINGCDC20ANULLALLELECAUSEDBYTHEPRESENCEOFTHELOXPCASSETTEGENOTYPINGTHEMICEBYPCR,TOYIELDEXPERIMENTALANDCONTROLMICECOMPARETHEEXPERIMENTALANDCONTROLMICEBYPHENOTYPICANALYSISANDHISTOLOGYANALYSIS,TODISCOVERTHEDIFFERENCESANDTHELOXP/MIN/MOLECULARMECHANISMDERIVEMOUSEEMBRYONICFIBROBLASTSMEFSOFCDC20APC,LOXP/MIN/CDC20,APCANDWTGENOTYPEFROMEMBRYOSFORGROWTHCURVEANALYSISANDKARYOTYPEANALYSISCOMPARETHEDIFFERENCEOFGROWTHWITHGROWTHCURVEANALYSISDETECTTHESEPARATIONOFSISTERCHROMATIDANDTHEPRESENCEOFANEUPLOIDBYKARYOTYPEANALYSISCONSTRUCTTHEPMXSE1ARASVIRUSVECTORANDTRANSFECTITINTOFOURGENOTYPEMEFSFORFOCIFORMATIONASSAYTODETECTTHEABILITYOFCDC20INCELLTRANSFORMATIONTHESTUDYAIMTOCERTIFYTHERELATIONSHIPOFCDC20MUTATIONINTHEPROMOTIONOFCOLONCANCERANDTHEMOLECULARMECHANISMINVITRORESULTSPHENOTYPICANALYSISSHOWTHATTHENUMBERANDTHEIMUMDIAMETEROFTUMORARENOLOXP/MIN/DIFFERENCEBETWEENCDC20APCCOMPOUNDMUTANTMICEANDCONTROLMICEPATHOLOGICALLOXP/MIN/SECTIONDISPLAYCOLONICTUMORSFROMCDC20APCCOMPOUNDMUTANTMICEHADPROGRESSEDTOMUCHHIGHERGRADETHANTHOSEFROMCONTROLMICE,PATHOLOGICTYPEISADENOCARCINMAANDLOXP/MIN/CONTROLMICEISADENOMACELLPROLIFERATIONASSAYSSHOWEDTHATCDC20APCCELLSGREWATANACCELERATEDRATECOMPAREDWITHWTMEFSORMEFSWITHASINGLEGENEMUTATIONFOCILOXP/MIN/FORMATIONASSAYSHOWTHATTHETRANSFORMATIONABILITYOFCDC20APCMEFSTRANSFECTWITHPMXSE1ARASVIRUSVECTORISMUCHSTRONGERTHATOTHERMEFSTRANSFECTWITHPMXSE1ARASLOXP/MIN/VIRUSVECTORCDC20APCMEFSSHOWEDASIGNIFICANTINCREASEINTHEFREQUENCYOFANEUPLOIDMETAPHASECOMPAREDWITHWTMEFS,WHICHHAVEAKARYOTYPEOF38OURFURTHERLOXP/MIN/ANALYSISREVEALEDTHATCDC20APCMEFSCONTAINEDPREMATURELYSEPARATEDSISTERCHROMATIDSLOXP/CONCLUSIONS1CDC20CARRYINGANULLALLELECDC20CANACCELERATETHEPROMOTIONOFLOXP/MIN/COLONCANCERINMICE2THECDC20APCCOMPOUNDMUTANTINMEFSCELLSISSUFFICIENTII暨南大学硕士学位论文CDC20基因突变与小鼠结肠癌的发展LOXP/MIN/FORTRANSFORMATION,CDC20ISANONCOGENE3THECDC20APCMEFSCONTAINEDPREMATURELYSEPARATEDSISTERCHROMATIDSANDASIGNIFICANTINCREASEINTHEFREQUENCYOFANEUPLOIDMETAPHASE4THECDC20INFLUENCESTHEPROMOTIONOFCOLONCANCERINMICETHROUGHCHROMOSOMEINSTABILITYKEYWORDSCDC20COLONCANCERCHROMOSOMEINSTABILITYIII暨南大学硕士学位论文CDC20基因突变与小鼠结肠癌的发展目录中文摘要英文摘要目录1前言12材料和方法721实验材料722实验方法103实验结果2131动物实验结果2132MEFS细胞实验结果244讨论285结论30参考文献31附录37英文缩略词表39在学期间发表论文清单40致谢41IV暨南大学硕士学位论文CDC20基因突变与小鼠结肠癌的发展1前言结肠癌是一种发病率高的消化道恶性肿瘤,在很多发达国家,结肠癌的致死率在肿瘤致死中排第二位,其发生发展是多阶段、多基因参与的分子病理过程。近年来分子生物学的研究结果表明,大肠癌发生、发展与多个癌基因的激活及抑癌基因的失活有关。研究证实,ADENOMATOUSPOLYPOSISCOLIAPC基因是大/结肠癌发生过程中一个重要【】1的“GATEKEEPERGENE”,APC的突变是大/结肠癌发生的早期事件。APC基因被认为是一种肿瘤抑制基因,位于5号染色体长臂,从112,118,468BP到112,209,532BP,共91KBP。APC的CDNA克隆系列分析显示为一8535BP生成的开放阅读框,共有21个外显子,第【】215外显子最大,编码整个蛋白75的氨基酸。APC编码一个2843个氨基酸组成的蛋白质,即APC蛋白,分子量为300KD,定位于细胞浆,是一胞浆蛋白,亲水性,主要位于结直肠上皮细胞基底膜侧,当细胞迁移到隐窝柱表面时APC的表达更为显著。APC蛋白有多个功能区,其前十七个氨基酸可形成同源二聚体,截短APC蛋白可通过该区域与野生【3】型APC蛋白联系C末端包含可降解CATENIN的部位和结合细胞骨架微管的部位。其与癌症产生有关的为能与CATENIN结合并调节其在细胞质中浓缩的功能域,CATENIN是粘附连接复合体的成员,粘附连接复合体在细胞外基质与细胞内信号传导中起着重要作用,CATENIN亦是WNT信号通路中的一份子。APC蛋白与CONDUCTIN和AXIN等蛋白合作,结合CATENIN并使它进入蛋白降解信号通路以调节胞外和胞内形式的CATENIN。很多研究表明APC基因功能丧失及随后WNT/CATENIN信号通路的失活参与了结肠腺瘤的形成,从而起始了结肠癌的形成。APC的突变或者“沉默”将从多个方面引起细胞生理、行为和形态的改变。首先,也是最重要的,APC的突变将引起WNT下游通路中CATENIN水平的大幅提高,CATENIN和TCF4等协同调控下游基因的表达,例如CMYC,从而引起细胞增殖或者【4】增殖加快等行为。APC突变引起的细胞增殖加快将引发肠道息肉的产生,随后其它的一些突变将促使增生的息肉转化为良性肿瘤,良性肿瘤将最终发展为恶性肿瘤,即大/结【】5肠癌。FAP是一种遗传性多发性息肉病,发病起始息肉多为良性的,但如不治疗可转化为恶性腺瘤。有研究表明,APC基因突变在人FAP或GARDNER综合症发生和发展中起重要【,】【,】6789作用。APC基因在人散发性结肠癌中也常发生突变。不同的FAP家族都发生APC【10】基因突变但是发病的严重程度却不一样。且APC基因不同的突变点有不同的表型。统计分析显示,发病的严重程度往往与APC上突变位点的位置有关系。一般,157位密码子以前,1595位密码子以后,以及第9个外显子的可变剪接会引起轻度的FAP息肉数目少于100个密码子12501464之间又突变的病人一般表现出严重的FAP息肉数目大于1暨南大学硕士学位论文CDC20基因突变与小鼠结肠癌的发展【】111000APC其它部位的突变可以引起中度的FAP息肉数目介于100到1000之间。最常用于研究的APC基因突变小鼠是通过ENU突变筛选得到的,它具有多发的肠道肿瘤【】12,称为APCMIN小鼠。这种小鼠在APC基因850个碱基的相关区域有一个无意义的MIN/突变。这种突变导致产生了850个氨基酸组成的截断蛋白。APC杂合子小鼠出生时正MIN/常但其寿命平均只有150天。C57BL/6JB6背景的APC小鼠整个肠道中可产生超过【】1350个腺瘤且其寿命不超过120天。肿瘤的发生和癌症的形成都经过一个漫长的过程,在这个过程当中涉及到多个基因的【】14突变。以前大多数人都引用“克隆进化”的模型来说明肿瘤的发生和发展。具体的来讲,这个模型认为,肿瘤的发生是一个多基因突变的过程,但是,这些突变并不是同时发生的,而是相继发生的每发生一次突变,就使得突变细胞获得一种新的能力,随之,其也向肿瘤细胞更进了一步获得突变的这种细胞相对于其他细胞拥有比较优势,所以,它很快就取代了原有克隆并一直增殖,直到下一个突变产生这个过程循环往复,直到一【】15个真正的肿瘤细胞产生。按照“克隆进化”的观点,肿瘤中所有的细胞都应该具有无限的增殖能力,都能够引起新的肿瘤的生成。但是,实际上,有研究表明,在肿瘤细胞移【16】植实验中,只有一小部分1细胞能够引发新的肿瘤。这表明,并不是所有的肿瘤细胞都是一致的,它们具有异质性。逐渐的,人们发现,在肿瘤组织中,只有少数的肿【15】瘤细胞才具有无限增殖和引发新肿瘤的能力,并把它们称为“肿瘤干细胞”。作为一个新的概念,尽管还存在很多的争议,但是越来越多的肿瘤被证明存在肿瘤干细胞。最近,大/结肠癌中也被证明存在肿瘤干细胞,这势必进一步加深人们对大/结肠癌的认识。事实上,大量研究表明,人类大肠癌的产生是APC和其他基因突变的结果,和“克隆进化”的模型一致。其他基因包括MCC、KIRAS、NRAS、DCC,此外TGF信号通路成【17】员SMAD2、SMAD4和TP53基因也参与了结肠癌的发生FIGURE1。2暨南大学硕士学位论文CDC20基因突变与小鼠结肠癌的发展FIGURE1GENETICMODELOFCOLORECTALCARCINOGENESISADAPTEDFROMFEARONANDVOGELSTEIN1990早在1990年,FEARON等就提出了基因不稳定CHROMOSOMALINSTABILITY,CIN在促【】18进结肠癌发生中的作用。CAHILL等研究证实,在大肠癌细胞系中发现了大量的CIN及【19】SPINDLECHECKPOINT的功能缺失,进一步证实了CIN在促进结肠癌中的作用。CIN可导【】20致染色体数目的异常ANEUPLOIDY,是肿瘤产生的标志。CIN产生的分子机制还不是很清楚。但是,很多研究表明,作为一种在细胞分裂时染色体分离重要的监视机制,SPINDLE【】21CHECKPOINT的缺陷可促进ANEUPLOIDY和肿瘤的产生。某些SPINDLECHECKPOINT基因突变已被证明可引起人类多种肿瘤的产生。有丝分裂中,染色体排列在细胞赤道板是随机的过程,在这个过程中染色体的着丝粒被从细胞纺锤丝两极伸出的可随机延长和收缩的微管所附【】22着。因细胞内这个过程是随机的,所以染色体的分离只会发生在当所有染色体都集中在中期赤道板时,以确保遗传物质均等的分配到两个分裂的核内。这个过程顺利进行依赖一种被称为SPINDLECHECKPOINT的监视机制,SPINDLECHECKPOINT可监视到着丝粒未被附着或【23】张力不足,从而阻止染色体的分离。随着对SPINDLECHECKPOINT认识的加深,人们逐渐认识到CDC20在SPINDLECHECKPOINT发挥作用时不可或缺的桥梁作用。CDC20是一种细胞周期调节因子,在从酵母到人类等有机体中,它同样也是细胞完成有丝分裂不可或缺的。人的CDC20基因主要结构域包括7个WD40的重复序列、CBOX、KENBOX、MAD2结合位点MIM、CRYBOX、IR位点和磷酸化位点。WD40的重复序列介导与底物结合,CBOX和IRMOTIF是与APC/C结合的区域。CDC20基因编码一种与G蛋白有关的三聚体蛋白,其包含了7个WD40重复序列,这种重复序列形成了由7个折叠组成的螺旋桨结构,主要介导蛋白与蛋白之间的作用FIGURE2。FIGURE2DOMAINSANDMOTIFSOFCDC20ADAPTEDFROMHONGTAOYU20073暨南大学硕士学位论文CDC20基因突变与小鼠结肠癌的发展人类细胞分裂需要约24个小时,其中有丝分裂约需2个小时,但在这2个小时发生了一系列复杂的相互依赖的分子事件,包括核膜破裂,胞内细胞器的分裂,如内质网和高尔基体,染色体浓缩,有丝分裂纺锤体形成,染色体中板集合和分裂,胞浆分离。所有这些细胞骨架和膜的整体变化都在几分钟内完成。因其相对的快速运动和不可逆性,依赖泛素的蛋白水解途径能够很好的调节这种快速而有序的反应。CDC20最具代表性的生化特性是在有丝分裂过程中结合并激活ANAPHASEPROMOTINGCOMPLEX/CYCLOSOMEAPC/C复合物。因此,CDC20主要的功能是在有丝分裂过程中使APC/C底物有序降解以协调有丝分裂的进程。APC/C,也称为细胞周期酶,是一种E3泛素连接酶,可降解细胞周期蛋白。APC【24,25】蛋白包含了1113个亚单位,包括CULLINAPC2和RINGAPC11等亚单位。研究表CDC20【26】CDC20明,APC/C在有丝分裂中主要是使SECURIN和CYCLINS降解。APC/C通过在正确时间降解各种有丝分裂调节因子以使有丝分裂顺利进行。在有丝分裂早期,APC/C中心亚基被CDK1和另外的有丝分裂激酶磷酸化,CDC20就可以有效地结合到APC/C。在有丝分裂时,CDH1被CDKS磷酸化及核蛋白结合从而使CDH1不能与APC/C结合,与此同时CDC20【27】CDC20结合并激活APC/C。而在有丝分裂早期,APC/C又可被EMI1和SPINDLECHECKPOINTCDC20【28,29】抑制。APC/C可在有丝分裂中期后期转换之前将CYCLINA和NEK2A降解。在中CDC20CDC20期后期转换时,APC/C使SECURIN降解从而解除了对SEPARASE的抑制。而且APC/C【30】降解CYCLINB,降低CDK1的活性,从而解除磷酸化对SEPARASE的抑制。激活的SEPARASE使COHESIN的SCC1亚单位分离,从而使姐妹染色单体分离。不受SECURIN抑制的SEPARASE可【31】CDC20直接与CYCLINB结合,而且可抑制CDK1的活性。在有丝分裂晚期,APC/C降解与有丝分裂相关的CYCLINS,通过SEPARASE抑制CDK1,使CDKS的活性降低到不能阻止CDH1CDH1CDH1与APC/C的结合,从而激活APC/C。激活的APC/C使APC/C一系列的底物降解,【32,33】CDC20包括CDC20,细胞就完成了有丝分裂的过程。在G1期,APC/C是失活的,因为CDH1CDH1APC/C中心亚基的去磷酸化及CDC20被APC/C降解。相反,在G1期,APC/C处【34】于激活状态并阻止有丝分裂调解因子过早积聚FIGURE3。有研究表明,在芽殖酵母中CDC20具有独立于APC/C复合体的功能。例如,MEC1或RAD53基因突变时,因DNA损伤CHECKPOINT的缺陷及复制的压力,CDC20可促进纺锤丝的【35】延长和染色体的提前分离。CDC20独立于APC/C复合体功能的具体分子机制尚未阐明。【】34除了SECURIN和CYCLINS,APC/C还可介导一系列其他的底物降解。大部分底物具有两个CIS结构,称为DBOX或者KENBOX,可被APC/C泛素化。CDC20蛋白水平在S期开始积聚,在有丝分裂期达到高峰,在细胞完成有丝分裂时急剧下降。在哺乳动物卵细胞和胚4暨南大学硕士学位论文CDC20基因突变与小鼠结肠癌的发展【】CDH136胎中,APC/C通过CRYBOX结构域来降解CDC20。CDC20CDH1FIGURE3FUNCTIONANDREGULATIONOFAPC/CANDAPC/CDURINGTHESOMATICCELLCYCLEADAPTEDFROMHONGTAOYU2007在有丝分裂过程中,姐妹染色单体被纺锤丝随机的牵引。为了确保染色体分离只发生在姐妹染色单体与纺锤体正确附着之后,细胞采用了一种被称为SPINDLECHECKPOINT的监视机制以检测非配对姐妹染色单体的存在,并且阻止姐妹染色单体的提前分离。在染色体分CDC20离过程中,APC/C是SPINDLECHECKPOINT的主要靶点。遗传学研究表明,在芽殖酵母中,MITOTICARRESTDEFICIENTMAD13和BUDDINGUNINHIBITEDBYBENOMYLBUB13是SPINDLE【】37CHECKPOINT的核心部分。在生物体内,MAD2、MAD3/BUBR1、BUB3和CDC20组成了MITOTICCHECKPOINTCOMPLEXMCC。一系列研究提供了一个有趣的模型。在这个模型里,未附着的KINETOCHORES通过增加BUBR1、BUB3、MAD2和CDC20局部蛋白浓度,MAD2构象的改变及CDC20的翻译后修饰可形成包含这些蛋白的APC/C抑制复合体,以抑制APC/C的活性,引起有丝分裂中姐妹染色单体的异常分离。研究表明,MAD2结合到CDC20可抑制泛素化【】CDC2038底物的释放,从而抑制APC/C的活性。但是BUBR1结合CDC20或者BUB1磷酸CDC20化CDC20怎样抑制APC/C目前还不清楚。因此,MAD2、BUBR1和BUB1可通过干扰CDC20CDC20结合到APC/C上来抑制APC/C的活性。已有大量报道证实,SPINDLECHECKPOINT功能失活引起CIN,可促进肿瘤的发生。早在【39】1998年,人们就发现在结肠癌细胞系中存在BUBR1和BUB1基因突变。MAD2过表达5暨南大学硕士学位论文CDC20基因突变与小鼠结肠癌的发展【】40小鼠中存在大量的ANEUPLOIDY,可加速产生淋巴瘤。MINLI等研究报道,CDC20基因一/AAA条同源臂上与MAD2结合位点的突变CDC20,可抑制MAD2与CDC20的结合,从而使SPINDLECHECKPOINT失活。体外细胞实验进一步证明,CDC20突变的细胞中可产生大量的【】41ANEUPLOIDY,可使有丝分裂中期染色体排列产生错位,且使后期染色体产生交联。但CDC20突变在肿瘤发生中的作用及其机制尚未阐明,为进一步探索,本实验组试图在小鼠肠道肿瘤模型的基础上研究CCD20突变在肿瘤的发生及发展的影响及分子机制。之前研究表明,【42】CHECKPOINT蛋白的突变如BUBR1主要影响结肠癌的发展,而对小肠病变影响不大,因此,本实验组主要关注CCD20对结肠癌的影响。本实验中为了实现CCD20在肠道中被敲除,运用了LOXPCRE重组酶系统。LOXPCRE重组酶是一种有效的条件性敲除系统,CRE蛋白是一【43】种点特异的DNA重组酶,可以识别34BP的LOXP序列并将其中间的DNA序列敲除。2004【】44年,FATIMAELMARJOU等制作了VILLINCRE转基因小鼠,在CRE基因前加入了在肠道中特异表达的VILLIN基因的启动子。VILLIN基因的启动子大小为9KB,可使CRE基因在整个肠道隐【,】454647窝、绒毛、分化的肠细胞、未成熟分化的隐窝细胞中表达。基因重组起始于胚胎期9天的内胚层,但125天后只特异的发生于整个肠道。实验前期,利用同源重组技术进行载体打靶,构建了CDC20条件性敲除及点突变相结合的载体。在CDC20基因前端插入LOXPLOXP,中间加入了一个STOP密码子,并在CDC20基因与MAD2结合位点进行了AAA的突变。当LOXP没有与CRE相作用时,CDC20被敲除,一旦AAA/LOXP/与CRE相作用,转变为CDC20。并将构建好的载体,经囊胚注射构建CDC20基因敲除LOXP/小鼠,得到F1代129P3/J和C57BL/6J杂交背景的CDC20小鼠,与C57BL/6J回交5LOXP/MIN/代以上,得到C57BL/6J纯背景的CDC20小鼠,分别与APC及VILLINCRE小鼠交配,AAA/MIN/LOXP/MIN/MIN/可得到肠道中为CDC20APCCDC20APCAPC基因型实验小鼠。经表LOXP/型分析其差异,HE染色和免疫组化进一步分析差异并寻找其分子机制。取CDC20MIN/LOXP/MIN/APCCDC20APC基因型实验小鼠胚胎成纤维母细胞MEFS,通过体外实验验证CDC20在结肠癌中的作用。6暨南大学硕士学位论文CDC20基因突变与小鼠结肠癌的发展2材料和方法21实验材料211实验动物LOXP/MIN/CDC20小鼠,由黄行许老师构建。APCB6背景小鼠,购于南京大学模式动物研究所。VILLINCRE转基因小鼠由南京大学模式动物研究所朱敏生教授馈赠。212细胞LOXP/MIN/LOXP/MIN/CDC20APC,CDC20,APC,WT四种基因型的小鼠MEFS,取自125天的胚胎。感受态细胞购自于南京全式基因有限公司。213质粒PMXSPURO病毒质粒载体购自于美国CELLBIOLABS公司,PMXSE1ARAS质粒由南京大学模式动物研究所徐璎实验室馈赠。214主要试剂1DNTPMIXTURE,TAQDNAPOLYMERASE,MGCL,10BUFFER,DNAMARKER购自上海TAKARA公司。LOXP/MIN/2CDC20,APC,VILLINCRE基因PCR引物由上海INVITROGEN公司合成。3RNA酶、NOTI及KPNI限制性内切酶购自于上海TAKARA公司。4DMSO购于上海INVITROGEN公司。5PFA,POLYBRENE,NOCODAZOLE购自于SIGMA公司。6PUROMYCIN、GIEMSA购自于SIGMA公司。7转染试剂PEI购自于南京慧基生物科技有限公司。8结晶紫、冰乙酸购于南京大志生物有限公司。9伊红,苏木精购自于南京正然科技有限公司。10胰蛋白酶购自德国默克中国有限责任公司。11质粒提取试剂盒购自于QIAGEN公司。12异丙醇、氯仿、平衡酚、甲醇、TRITONX100等购自南京基天生物有限公司。13琼脂糖购自于上海INVITROGEN公司。14乙醇、二甲苯、中性树脂、丙酮购自于上海生兴生物有限公司。15其它常规试剂均为国产分析纯。215培养基7暨南大学硕士学位论文CDC20基因突变与小鼠结肠癌的发展1LB液体培养基胰蛋白胨TRYPTONE10G/L,酵母提取物YEASTEXTRACT5G/L,氯化钠NACL5G/L,121,20分钟高压灭菌。2LB固体培养基每升LB液体培养基中加琼脂糖15G,121,20分钟高压灭菌。3DMEM高糖培养基,无菌PBS,胎牛血清购自于GIBCO公司。胰酶购自于BIOSHARP生物有限公司。4细胞培养液配置DMEM10FBS1双抗。5PENICILLINSTREPTOMYCIN抗生素购于INVITROGEN公司。6抗生素浓度用于质粒扩增使用浓度为5MG/ML,加入LB中以1200比例。216主要试剂的配制1质粒提取试剂的配置1溶液I50MMOL/LGLUCOSE,25MMOL/LTRISHCL,10MMOL/LEDTA。2溶液02MOL/LNAOH,1SDS十二烷基磺酸钠。3溶液5MOL/L乙酸钾60ML,冰乙酸115ML,三蒸水285ML。4TE缓冲液10MMOL/LTRISHCLPH80,1MMOL/LEDTAPH80。250TAE242GTRIS,571ML冰乙酸,100ML05MOL/LEDTAPH80,加蒸馏水至1000ML。3酚氯仿抽提液饱和酚与三氯甲烷11混匀后静置3小时分层后,4度避光保存。4组织裂解液1MTRISHCLPH8010ML1M氯化钠溶液400ML04M乙二胺四乙酸二钠5ML10十二烷基硫酸钠100ML双蒸水定容至1000ML5蛋白酶K溶液使用浓度20MG/ML,20度储存。蛋白酶K粉20MG双蒸水1ML64多聚甲醛4G多聚甲醛,蒸馏水80ML,80度加热完全溶解后,蒸馏水定容到100ML。4保存一月。71PBSPH调至74缓冲液8暨南大学硕士学位论文CDC20基因突变与小鼠结肠癌的发展氯化钠8G氯化钾02G磷酸氢二钠144G磷酸二氢钾024G双蒸水定容至1000ML801结晶紫染液将50MG结晶紫溶入50ML10乙醇中5ML无水乙醇溶入45ML蒸馏水中。9细胞冻存液现用现配,避光95FBS5DMSO10GIEMSA染液称取吉姆萨染料干粉GIEMSASTAIN76G用500ML甘油溶解,50保温一个小时以上。冷却至室温后,加入500ML甲醇混匀并过滤,放置12周等其稳定后即可使用,用该方法配置的吉姆萨染液GIEMSASOLUTIONMICROSCOPYGRADE可以保存数年。217苏木精伊红HE溶液的配制1苏木精配置1材料苏木精1G,蒸馏水1000ML,硫酸铝钾50G,蒸馏水750ML,碘酸钠02G,枸橼酸钠1G,水合氯醛50G。2方法将苏木精1G加入到1000ML蒸馏水,煮沸至充分溶解,再依次加入碘酸钠02G和硫酸铝钾50G。溶解完全并冷却后,加入1G枸橼酸钠与50G水合氯醛,煮沸5分钟,冷却过滤备用,可长期使用。3用途用作HE染色及免疫组化复染。2伊红的配置1材料曙红B10G,95乙醇。2方法1G曙红B溶于95酒精100ML中即可。3用途用作HE染色。218主要材料、仪器1低速离心机上海飞鸽医疗设备厂2高速冷冻离心机HITACHI公司3二氧化碳电热温孵箱THERMO4超净工作台苏州净化设备厂9暨南大学硕士学位论文CDC20基因突变与小鼠结肠癌的发展5光学显微镜日本NIKON6LEICATCSSP2AOBS激光共聚焦显微镜德国莱卡公司770低温冰箱海尔公司8电子分析天平湖南湘仪天平厂9稳压稳流电泳仪上海天能10EPSON扫描仪爱普生中国有限公司。11UVITEC凝胶成像系统英国UVITEC公司12恒温磁力搅拌器国产13OLYMPUSBX40光学显微镜日本OLYMPUS公司14鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司15三用恒温水浴箱上海精宏实验设备有限公司16酶标仪HITACHI公司17PCR仪东胜创新18721分光光度仪贝克曼公司19液氮罐上海精密仪器仪表公司20超净工作台苏州净化设备厂21解剖器械苏州市协和医疗器械厂22电动移液器GILSON23包埋机、切片机、展片槽德国莱卡公司24摇床上海精宏实验仪器有限公司25金属浴上海五相仪器仪表有限公司22实验方法221动物实验1小鼠模型的建立LOXP/将得到的B6纯背景的CDC20基因型小鼠与B6纯背景的VILLINCRE基因型小鼠LOXP/MIN/配笼,得到CDC20VILLINCRE基因型小鼠,经PCR鉴定。同时将APC基因型小/MIN/鼠与VILLINCRE基因型小鼠配笼,得到APCVILLINCRE