β-地中海贫血症病人特异ips细胞系建立、修复及其造血分化研究（可编辑）

地中海贫血症病人特异IPS细胞系建立、修复及其造血分化研究学校代码学号博士学位论文地中海贫血症病人特异细胞系的建立、修复及其造血分化研究所院北京生命科学研究所姓名王译萱指导老师高绍荣学科专业生物化学及分子生物学研究方向体细胞重编程完成日期年月目录摘要前言日吾干细胞及胚胎干细胞概述重编程及方法概述。疾病相关的细胞研究进展疾病细胞在应用研究中遇到的问题和改进一地中海贫血病概述实验方法及结论第一部分地中海贫血病人特异细胞系的建立及鉴定第二部分突变基因的修复及修正后的细胞系的鉴定第三部分细胞及细胞的造血诱导分化结论参考文献致谢附页肌摘要干细胞是具有自我更新能力和多向分化潜能的一种细胞群体。干细胞可通过细胞分裂维持自身群体的大小,又可在所处的周围微环境的影响下,分化形成多种不同的组织细胞,从而构成机体的组织器官。胚胎干细胞是来源于囊胚内细胞团的干细胞。胚胎干细胞最受关注的应用前景在于为细胞替代治疗,组织器官移植和药物筛选提供细胞来源。其自我更新能力可保证移植物的充足性,而其多向分化潜能可为组织或器官移植治疗提供多种功能细胞。但是胚胎干细胞来源极其有限,并由于其个体特异性易带来移植后的免疫排斥反应,因而在极大程度上限制了胚胎干细胞在组织替代和器官移植中的应用。为了克服这些障碍,人们努力通过各种重编程的手段希望使分化的成体细胞重新回到多能干细胞的状态,目前,重编程主要有三种方法核移植,细胞融合及诱导多能干细胞技术。诱导多能细胞技术是指在分化的体细胞中过表达特定的关键转录凶子,从而使体细胞重编程,产生多能干细胞的技术。诱导多能干细胞技术产生的多能干细胞被称为诱导型多能干细胞。而病人特异的诱导性多能干细胞的产生为遗传性和退行性疾病的治疗提供了稳定的细胞来源,而诱导多能干细胞技术与传统的基因打靶技术的结合为这些疾病的治疗提供了新的方向。一地中海贫血是珠蛋白链合成减少或缺乏导致血红蛋白四聚体链/二链之间失去平衡所引起的一种溶血性遗传病。在临床上,地中海贫血症可以分成重型、轻型、中间型和四种类型。重型地中海贫血症又称为氏贫血,通常由珠蛋白基因发生点突变或小片段缺失造成。地中海贫血症是国内长江以南各省发病率最高危害最大的遗传病之一。本课题致力于建立以干细胞和重编程技术为主导的遗传病治疗模型。以地中海贫血症为疾病模型,运用诱导多能干细胞技术建立了/纯合子贫血症成体病人特异的多能干细胞系,并对该细胞系进行了多能性鉴定。司时,根据该遗传病的基因突变,通过同源重组技术定点修复突变位点,得到了修复正常的多能干细胞系。最后将病人特异的干细胞系和基因修复的干细胞系分别进行体外定向造血分化,并建立了体内移植的小鼠模型。造血结果显示,虽然两种干细胞系在体外造血分化中并无明显差别,但体内实验中小鼠移植模型则显示出不同的表型。移植修复后细胞来源的造血祖细胞的小鼠放射性照射后,其血红蛋白及红细胞水平能较快恢复到止常值,并产生出常的人的珠蛋白。而病人特异细胞造血祖细胞移植纽小鼠其血红蛋白及红细胞水恢复速度很慢,并且不能产生出正常的人的珠蛋白。以上的研究对技术以及细胞在应用上提供了可行性的方法,在临床研究中具有很好的提示作用。关键词胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、一地中海贫血、基因打靶、造血分化,。,一,/,一,厶一日舌干细胞及胚胎干细胞概述千细胞是具有自我更新能力和多向分化潜能的一种细胞群体。干细胞可通过细胞分裂维持自身群体的大小,又可在所处的周围微环境的影响下,分化形成多种不同的组织细胞,从而构成机体的组织器官。干细胞按发育阶,和成体干细胞段可以分为胚胎干细胞,。,是来源于囊胚内细胞团胚胎干细胞,的干细胞。与成体干细胞不同,胚胎干细胞能在体外去分化的条件下可以无限分裂,并保持胚胎来源细胞的一个关键性特征即发育成成体中各种组织器官的能力。胚胎干细胞最受关注的应用前景在于为细胞替代治疗和组织器官移植提供细胞来源其自我更新能力可保证移植物的充足性,而其多向分化潜能可为组织或器官移植治疗提供多种功能细胞图。因此对胚胎干细胞的研究是当今生命科学和生物技术研究的热点。但是胚胎干细胞来源极其有限,并由于其个体特异性易带来移植后的免疫排斥反应,因而在极大程度上限制了胚胎干细胞在组织替代和器官移植中的应用。为了克服这些障碍,人们努力通过各种重编程的手段希望使分化的成体细胞重新网到多能干细胞的状态,并在近年取得了突破性的进展。图胚胎干细胞特征重编程及方法概述在脊椎动物的早期胚胎,全能型的细胞具有分化并形成在特定组织中行驶功能的各种细胞,最终形成整个生物个体胚胎,包括胚外组织如胎盘。这一细胞特化的过程是由内源及外源的因子间的相互作用所控制的。在早期胚胎发育的囊胚时期,内细胞团的细胞即胚胎干细胞的来源细胞具有多能性其可分化形成外、中、内三个胚层。最终,这些走向三个胚层中各胚层的细胞继续分化,形成成体的各个组织,如脑,小肠,心肌细胞等。这些分化的成体细胞通常不能交换彼此之间的命运,而只能沿着自己既定的命运在生物体中行驶特定的功能。但是,许多经典的研究证明了若将胚胎中这些“命运注定”的细胞体外扩增并在不同的微环境中处理,其分化命运会发生改变,因而具有可塑性。重编程,又称为体细胞重编程或细胞核重编程,是指将分化的体细胞的记忆抹去,使其回到胚胎来源细胞的状态,具有多向或定向的分化潜能。与胚胎干细胞相比,重编程的方法可从特定个体获得多能干细胞,其细胞来源不再受到发育时期和区域的限制,并避免了个体间差异带来的免疫排斥反应,因而在医学上有着更为深远的应用前景。目前,重编程主要有三种方法核移植,细胞融合及诱导多能干细胞技术图。砭瞄粥瞄一一,蚓国叫州垤。毫绷喇晰如蚋蜘洲摹酬岫瞎翻忒焉茹磊蔷一一飞是告一一图体细胞重编程的三种方法示意图摘自,核移植。在这种方法中,体细胞的核双倍体,被植入去核的卵中。在卵胞质的环境中,体细胞的核被重编程,获得的细胞具有多能性。得到的克隆囊胚可以在体外组织培养中得到核移植胚胎干细胞系。若条件允许发育得以完成,可以形成整个克隆个体。,细胞融合。在这种方法中,两种不同类型的细胞结合形成一个整体。得到的融合细胞成为异核体或杂合子。,转录因子转导。这种方法可被用来形成细胞。核移植是指将供体细胞核移入去核的卵母细胞中以获得克隆个体或多能干细胞的技术。多莉羊的诞生就是核移植最成功的例子。核移植成功地说明了创造一个整个个体所需要的全部基因均储藏于特化的体细胞的细胞核中,并可在卵母细胞中含有的重编程因子的作用下被重新激活。即与细胞特化过程相关的是基因表达的变化,而非基因内容的变化。核移植从另一个方面说明了体细胞的表观遗传状态并非处于不可逆的固定状态,而是可以被重编程到胚胎细胞状态,并发育成为新的个体。核移植技术为胚胎发育及疾病机制的研究提供了很好的途径,但其仍存在着重编程效率低下,重编程不完全以及卵母细胞破坏所带来的一系列伦理问题。历史在多细胞生物中,首次将一个细胞的细胞核成功移植入另一个细胞时由和在年完成的。虽然此前核移植已经在包括阿米巴虫、纤毛虫等单细胞生物体中获得成功。和将一个豹蛙的囊胚卵泡细胞核移植入一个去核的卵母细胞中,并获得了正常游动的蝌蚪。在该项对豹蛙卵核移植的研究及后续工作中,约的囊胚核移植发育到形态正常的后神经轴胚阶段。这一早期成功的重要性在于它为检测分化细胞的细胞核是否也能支持受体卵的正常发育开辟了道路,即替换正常受精卵的核。年,由和发表的另一篇重要文献报道了在囊胚阶段之后非常短的时间内,体细胞在本例中为内胚层细胞的核失去了支持胚胎正常发育的能力。实际情况是,到尾芽阶段,内胚层的核不再能够支持任何正常的发育过程。此后不久,在爪蟾中报道了成功的核移植年。在爪蟾中,一个遗传标记被用来证明核移植产生的胚胎完全来源于植入核的活性而非被紫外照射自私的受体卵的核。核移植胚胎发育在爪蟾中比豹蛙中更加正常,并且很快能发育到成体阶段。通过在爪蟾中移植入内胚层细胞的核获得了首批性成熟的成体克隆动物,并且绝大多数在各方面均表现正常。核移植要想获得成功,一个卵细胞必须重编程体细胞供体核到一个胚胎的表观遗传阶段,从而使得从胚胎发育所必须的遗传程序可以被活化。这是现阶段研究中为了解核移植实验中重编程分子机制的焦点问题。由于两栖类和哺乳类的胚胎发育非常不同,各系统可以为核移植实验中重编程问题提供不同的线索。例如,从两栖类动物中可以获得大量的体积很大的卵,该系统在生化研究中尤其有用。与之相对的是,哺乳动物,尤其是小鼠,允许组织培养和遗传方面的研究。核移植过程两栖类动物爪蟾卵的全年可获得性以及水生动物在实验室的易维持性,使得两栖类动物核移植工作在豹蛙中首次成功之后,更多地再爪蟾中进行。根据核注射入去核的卵或者未去核的乱母细胞,可以将实验分成两类图。核移植需要供体细胞的质膜经处理具有通透性,这种处理或者是通过机械手段,将细胞吸入比细胞小的吸管或者是通过化学手段,将细胞短暂的暴露于一个能与膜整合的药物。供体细胞随核引入的细胞质含量仪约为卵体积的十万分之一,因而几乎没有任何作用。移植后的卵细胞培养于简单的无营养的盐溶液中,因而其发育不依赖于培养液。核移植入卵母细胞则完全不同。从雌性卵巢中取出的发育完全的卵母细胞处于第一次减数分裂前期。约个体细胞核被注射入这些发育中的卵母细胞的细胞核生殖管,不进行复制或细胞分裂,但在几天之内在转录水平上变得逐渐活跃。这一方法获得的核移植卵母细胞如上述的卵,样,在盐溶液中培养,并在两周甚至整个培养过程中不发生形态上的变化。哺乳动物最甲的哺乳动物克隆是在家兔中尝试进行的。在实验中,卵母细胞与桑葚胚时期的胚胎细胞融合,得到的三倍体克隆可以发生几次卵裂。在年,和通过病毒介导的细胞融合,有效地将供体细胞核移植入去核的受精卵中,该方法被用于以下两类实验一、获得单亲胚胎,以雄原核替换雌原核或以雌原核替换雄原核得到单亲胚胎。毫无例外,单性胚胎不能发育,这也是第一次证明了在正常胚胎发育过程中,亲本特异的基因组印记起到了非常重要的作用,。二、将卵裂期胚胎的供体核移植入去核的受精卵中获得克隆胚胎。没有一个重建的胚胎能发育超过卵裂后期,这导致人们认为基因组的全能性在早期发育过程巾被很快的丢失。与两栖动物相比,几乎预示了得到哺乳动物克隆的不可能性。但是,从其他哺乳动物中得到的实验结果很快就挑战了这一结论。年,用细胞时期的供体胚胎核进行核移植成功得到了活体克隆羊,并用该种方法很快得到了克隆牛及克隆猪,。但是,为何是农场动物克隆而非对照严格的小鼠克隆实验得到成功呢这些物种间发育上一个主要的不同在于母源发育控制依赖于母源储存的转变为合子发育控制依赖于合子产生的的时机不同。在羊和牛的胚胎中,这个主要的转变看起来发生于细胞期,但在小鼠胚胎中在细胞阶段就已经完成了。因此,在克隆羊或牛胚胎中比在克隆小鼠胚胎中,激活供体基凶组的时间限制更为宽松。因而在小鼠中,供体核必须在核移植后被迅速激活,才能使得卵裂得以持续完成。由体细胞核移植而非从卵裂期胚胎中获得供体核进行核移植获得首次成功是从体外培养的成纤维供体细胞获得克隆羊的实验。紧接着是以乳腺细胞核为供体的克隆羊“多莉”的诞生,这是第一次从成年供体细胞获得的哺乳动物克隆。随后,共有种哺乳动物,包括小鼠、山羊、猪、牛、兔子、大鼠、猫和狗等相继被克隆。与两栖动物克隆一样,哺乳动物的克隆都要经过两个步骤。绝大多数情况下,成功移植的体细胞核移植实验均是供体细胞核移植入去核的卵母细胞而非去核的受精卵,。首先,在减数分裂后期,用吸管将接受移植的卵细胞的纺锤丝出去,同时将供体细胞核移植入卵细胞。在大多数哺乳动物巾供体细胞核通过电融合的方式进入去核卵细胞。但由于小鼠的卵细胞易碎,所以将供体核通过装置穿过透明带和细胞膜注射进入去核的卵中更为有效。克隆囊胚可以被移植入假孕母鼠的子宫得到克隆小鼠,也可在体外组织培养成核移植胚胎干细胞。细胞在遗传上和供体核是一致的,因而也可以“个性化”地用于细胞治疗又称“治疗性克隆”。克隆动物表型通过核移植从体细胞供体核中获得克隆动物的效率很低,并且存活至成体的克隆动物通常表现出很多异常。相反,当胚胎细胞被用来作为核移植供体细胞时,两栖类动物核哺乳动物克隆的存活率更高。两栖动物当胚泡细胞核被移植入质量良好的爪蟾受体卵中,超过的胚胎发育成为正常的蝌蚪,并且他们之中绝大部分可以发育成为能繁殖的成体。当供体细胞分化后,核移植胚胎发育的正常率下降,并相对于其他供体核,内胚层供体核随着年龄的增加发育正常率下降较慢。在两柄类动物中,将通过体细胞核移植获得的胚胎的细胞核作为供体核再进行一系列核移植,可得到许多有用的信息。由于第一次核移植的胚胎由于体细胞核与活化卵的复制速度不同,通常得到染色体正常及异常细胞的嵌合体。系列核移植发现经历了一次成功的核移植的胚胎,由于其细胞核收到的损伤最小,具有良好的发育潜能。甚至用幼虫蝌蚪的小肠上皮细胞,也可获得一些正常的、性成熟的、具有遗传标记的、雌性和雄性的成体蛙。这一结果说明分化的过程并不必须丢失促进正常发育的能力,因而原则上阐明了细胞分化时仍可以保持基因组的完整性。在两栖类核移植实验中,从一个成体核获得正常的成体克隆动物一直没有实现。但可以从许多不同成体组织的细胞核得到形态正常的蝌蚪,并且这些蝌蚪含有正常功能范围的分化的细胞类型。因此,那些已经决定了分化方向的细胞和卵细胞质一起,包含了促进想绝大多数非相关细胞分化的遗传潜能。从两柄类核移植得到的发育异常类型与供体细胞来源形态水平间不成任何相关性。无论供体核的细胞类型和发育阶段,核移植胚胎死亡予一个相似范围的缺陷,包括不完全卵裂,不能出腔,轴线形成的缺陷,以及缺乏头部结构。这些看起来杂乱的缺陷与初次核移植得到的胚胎细胞中常见大的染色体异常有密切的关系,。哺乳动物绝大多数克隆哺乳动物胚胎在植入子宫后难以继续发育。那些存活到出生后的通常表现出不依赖于供体细胞类型的共同的异常。例如,新生的克隆动物通常过度发育,并有一个增大的胎盘,其症状被称为大子代综合症。并且,新生的克隆动物常伴有呼吸衰竭,以及肝、肾、心和脑的疾病。即便长期存活的个体也可能在其生命后期出现异常。例如,老年克隆小鼠通常变得肥胖,并出现严重的免疫疾病,或过早死亡,。绝大多数克隆无法通过刚植入子宫后和出生这两个关键时期。这可能是对基因表达错误最为敏感的的两个关键性发育时期。但是,即便效率很低,成体动物的获得以及表面健康的成体克隆动物一倍作为核移植可以产生下常克隆动物的证据。重要的是,克隆动物中严重的异常通常只有在动物衰老时菜变得明显,。在许多甚至绝大部分成体克隆动物中随机发生的疾病和其他缺陷意味着克隆动物的存活并不能与其正常性一致。相反,存活的克隆动物的表型在一个广泛的范围内分布,包括出生后早期由异常导致的突然死亡或更多地微笑异常使其得以存活到更高的年龄。这些考虑说明确定细微的基因表达缺陷的复杂性,并强调了对更多精密测试标准如环境压力和行为科学测试的必要性。克隆动物特有的异常并不被其后代所继承,说明表观遗传而非遗传的畸变是导致克隆动物异常的原凶。凶为表观遗传变化,而非遗传变化,是在基凶组从生殖系中传递时町被抹去的可逆的或染色质修饰,。因此,克隆存在的问题是因为植入的供体核发生错误的“表观遗传/基因组重编程”,而非在供体核细胞中获得的体细胞突变。在两栖类核移植实验中已经说明了在供体细胞核分化状态和其在植入卵细胞中后发育的能力之间存在负相关性。那么在哺乳动物中,供体细胞分化的状态是否也会影响重编程的效率呢重编程可以在功能上通过评价克隆在几个不同时期水平的发育而测定,包括在核移植入卵细胞后的囊胚形成率克隆胚胎在植入子宫后存活到出生或成年的比例从克隆的囊胚通过体外培养获得多能胚胎干细胞的比例。重组胚胎到囊胚的植入前发育效率部分上受实验参数如细胞周期和被移植的细胞核的物理状态的影响。例如,非分裂阶段的供体细胞的克隆比比活跃增殖期的细胞的克隆更有效率,。由此可以预期,由处于或细胞周期的成纤维细胞、睾丸支持细胞、卵丘细胞或细胞重组得到的卵具有较高的发育到囊胚的比例。相反,对于大部分处于期的活跃分裂的或胚胎肿瘤细胞,其发育比例较低。由于实验中的分裂期波动性较大,衡量由重组的卵发育而来的囊胚的比例并非一个定量“重编程能力”的可信标准。但是,一旦一个克隆胚胎发育到了囊胚阶段,在植入子宫后到出生阶段的发育依赖于供体核的分化状态。由胚胎累供体如和细胞得到的克隆胚胎的发育效率比从卵丘或成纤维细胞供体细胞来源的克隆发育效率高倍以上,可能是因为一个未分化的胚胎细胞的核比一个分化细胞的核更易于或更少于需要重编程。这说明了再供体细胞分化程度和重编程效率之间存在负相关性。最后,一旦一个胚胎发育到囊胚阶段,其有相当一致的可能性来获得细胞,说明从外植的囊胚中获得细胞的能力更少的依赖于供体核的分化状态。核重编程伴随的变化早期胚胎发育所采取的策略在两柄类和哺乳类中有明显的不同。例如,爪蟾胚胎的卵裂是迅速的,每个细胞周期仅为分钟左右,而哺乳动物胚胎正好相反,其在受精后小时内只分裂一次。并且,爪蟾的合子基因组只在次有丝分裂周期后才在囊胚转变中期开始表达,而小鼠胚胎基因组在细胞期即开始活化。因此,在两栖类和哺乳类中采取不同的发育策略会影响体细胞供体核的重编程。两栖类两栖类卵的胚泡包含有最大程度伸展的在转录水平上极度活化的灯刷状染色体,直观地反映出转录基因比例很高,并且绝人多数基因上密集存在聚合酶。这种特殊的转录状态在早期卵子发生中获得,并可能在成年雌性动物的卵巢中维持。成熟的精子则被最大限度地压缩并在转录水平上完全失活。常见的染色体组蛋白在精子中被精蛋白所替代。该蛋白在受精时进入卵的精子核中北交换,精子细胞核在分钟内进行非常快的去致密化过程。两栖类中,没有发生哺乳动物中发生的染色体失活和印记。在从受精到中囊胚转化过程中,甲基化水甲下降,在转化后,甲基化水平又随着发育过程逐渐上升。综上所述,在正常发育过程中,基本的核重编程时间发生于胚子发生和受精后的几个小时内。两栖类核移植中最明显的变化是染色质的弥散和体积增加。该现象在胚胎细胞来源的核中比分化的或成体细胞来源的核中发生地更快。被移植的核你改了受精卵或卵细胞的环境,核酸合成也跟随着核移植发生变化。不分裂的细胞如神经细胞的细胞核在受精卵中很快发生合成。从单个核移植的卵中获得的胚胎,合成了与正常受精发育而来的胚胎自身细胞核合成的水平相当的和。基因转录模式从供体细胞模式转变成早期胚胎模式。所有的基因转录在核移植胚胎的卵裂过程中被关闭,然后根据细胞类型在存活的核移植胚胎中被重新激活。即使克隆胚胎由小肠细胞核移植获得,肌肉形成的相关基因也在核移植胚胎的肌肉细胞中表达。在核移植入卵的过程中,没有任何复制的情况下,被植入的细胞核发生了大规模的转录变化,表现了广泛的基因转录的重编程,从而使得体细胞的核及其有丝分裂的后代,改变了基冈转录模式以适应于受体细胞的转录模式。在两柄类核移植实验中,长期以来认为由分化程度更高的供体细胞核米源的克隆胚胎发育异常的原因是不完全的复制。在正常爪蟾发育过程中,雌雄原核染色体在受精后分钟开始复制,并于分钟内完成。相反,体外培养的细胞核分裂需要约个小时。因此,移植后的体细胞核通常用远超过分钟的时间继续复制。因此,染色体复制可能是不完全的,并且不完全复制的染色体被强行分开,即植入的核被强迫进入他们的第一次有丝分裂。破碎的染色体片段常在核移植胚胎中被发现,并与体细胞相比,这种发生于受精卵的复制速率和细胞分裂的不吻合性导致了染色体非整倍化,从而比较可能导致许多核移植胚胎发育的异常,尤其是高比例的核移植受精卵难以进行任何正常分裂。目前,可以认为成功的重编程需要个必需步骤在或蛋白上的决定分化状态的表观遗传标记已被去除新表达的那些基因所必需的转录因子相互作用基因的染色质己去致密化使得转录冈子可以接近。哺乳类连续的表观遗传重编程是正常发育的一个重要方面。在配子发生过程中,和组蛋白甲基化状态的变化连续地发生于两个亲本基因组上。受精后,胚胎的基因组在卵裂过程中和植入了宫后又进一步被修饰。正常胚胎发育中最重要的表观遗传重编程发生于配子发生时期。这个过程是指将精子和卵子基因组赋予“表观遗传感受态”,从而使今后的受精过程和早期发育关键基冈的正常活化得以顺利进行。在克隆个体中,这个过程被截短了,并且许多影响克隆动物“正常化”的问题可能归凶于植入卵中的体细胞核不适当的重编程。在卵裂过程巾,基因组范围的去甲基化除去了存在于受精卵中的表观遗传标记,使得胚胎的大部分没有甲基化。在植入子宫到原肠形成过程中,基因组范围的从头去甲基化过程重新确立了所有的甲基化模式,这个模式随后贯穿动物体细胞的一生。在克隆胚胎中,重复序列的甲基化模式是异常的。在核移植实验中需要再何种程度上模拟正常发育中染色质结构和甲基化的表观遗传修饰才能成功,是一个未解决的问题。在植入后和原肠发生前,三个关键事件塑造了胚胎基因组的表观遗传状态基因组水平的从头甲基化重新确立了成体特异的并在体细胞整个生命过程中维持的全部甲基化模式在雌性胚胎中通过随机失活两条染色体中的一条而实现剂量补偿效应端粒调整为体细胞特异的长度。而在克隆动物中科发现这些表观遗传事件调节的紊乱。在新生的克隆小鼠中对基凶表达进行了最为“泛的研究。表达谱显示在新生克隆小鼠的胎盘有的基因组和的印记基因是异常表达的,。这说明了哺乳动物发育对于广泛的基因调节异常具有令人惊讶的忍耐性,而补偿机制确保了一些克隆可以存活到出生后。这些结果表明存活的克隆动物也可能有潜在的缺陷,虽然不会严重到威胁当前的存活,但仍可能在发育后期引发异常的表。型。细胞融合是将两种或多种细胞类型整合为一个整体。细胞融合使得基因组之间相互影响的研究成为可能。并且,通过细胞融合这种方法,人们发现了一些肿瘤抑制蛋白和反式活化蛋白。并且,细胞融合的研究第一次证明了哺乳动物体细胞的分化状态并不是同定和不可逆的,而是动态的处于调节因子的持续的调节过程中。随着现代分子生物学技术的发展,人们发现细胞融合实验在特定的条件下,若将多能性细胞与体细胞融合,多能性的状态可以主宰体细胞的分化状态,从而使体细胞早期的被沉默的基因重新激活。因而细胞融合技术被用来研究重编程过程中相关的调控机制。导入特化体细胞中的特性基冈细胞融合可以产生杂合体或异核体。杂合体细胞分裂增殖,使得融合两方的细胞核发生融合,而异核体由于不能分裂增殖,冈而含有多个不同的核。早在四十年前,细胞融合实验就发现了当一个分化的细胞,如小鼠的成纤维细胞与仓鼠的一个黑色素细胞或大鼠一个肝细胞融合后,黑色素和酪氨酸氨基转移酶会被分别合成。这些研究为基因表达不仅被顺式作用元件调控,也被反式作用因子调控的结论提供了最新的证据。几年之后,在将正常的非癌症细胞与肿瘤细胞融合后,人们发现所得到的杂合子细胞其正常的状态主宰了转化的状态,抑制了肿瘤的生成,从而为反式作用肿瘤抑制蛋白的存在提供了强有力的证据。这种对肿瘤的抑制并非缘于原癌基因的丢失,因为随着杂合子细胞的分裂增殖,癌化的表型会重新渐渐表现出来。在许多细胞融合的研究中,在一种细胞类型中北沉默的基因会在融合后被重新活化,但是,杂合子在进行细胞分裂是会出现核的融合,染色体的丢失和重新排列,以及混合物种杂合子染色体的非整倍性。因此,在这些增殖的细胞杂合子中观测到的基因活化是南编码抑制于基因的缺失造成的还是由活化子的功能导致的,这一点还不清楚。在年,及其同事通过制造异核体,第一次为哺乳动物融合前细胞中沉默基因可以通过细胞融合而活化提供了确切的证据。异核体是一种由两种不同类型的细胞融合后形成的多核融合产物,其寿命较短且不能分裂。如果融合的细胞来源于不同的物种,他们的基因产物可能非常不同,并且可实现细胞核的重编程。这是第一次通过细胞融合确定哺乳动物细胞的分化状态并非固定而不可逆的。由于异核体不能进行细胞增殖,并且其来源细胞的核始终处于分开而不接触的状态,凶而在杂合子中常见的染色体丢失和重新排列的问题得以解决。早期对异核体的研究发现,异核体中的核发生膨大,也存在和合成,但是沉默的基因并没有被激活,这可能是细胞类型选择的结果。这些研究丰要是关于鸡的红细胞。鸡的红细胞虽然有核,但是一种最特化的细胞,并且难以被重编程。最早检测到的早先沉默基因的活化是在肌肉细胞和羊膜细胞融合后形成的异核体细胞中。在该项研究中,为了增加基因剂量并且抑制细胞分裂,小鼠的肌肉细胞由于其天生的多核性和后有丝分裂性,被选为融合的一方。而人的羊膜细胞由于其胚胎性被选为融合的另一方,因为人们认为它们和其他类型的细胞相比,更具有可塑性。在得到的异核体中,可以观察到直接的分化,和许多人的肌肉蛋白的表达,证明了肌肉基凶在非肌肉细胞中得到了活化,。随后,在由小鼠肌肉含胞体和来源于三个胚层的不同细胞类型,包括人的成纤维细胞来源于中胚层,肝细胞来源于内胚层或角质细胞来源于外胚层的融合形成异核体中也发现了早期沉默的肌肉基因可以被活化,。其细胞核之间的相对比例,或基因表达的剂量说明了重编程的方甸,。复制并非是必需的,但的甲基化状态对异核体研究的结果至关重要。重编程的频率和动力也随细胞类型的不同而不同。例如,红细胞特异基因和肝细胞特异基因在成纤维细胞核来源的异核体的核中被活化。同时,这些异核体实验说明,甚至在体内,哺乳动物不同类型的分化细胞中沉默的基因可被其他类型的分化细胞活化。而且,这项实验说明了细胞的分化状态并非固定且不可逆的,而是在任何时间都处于调控因子持续调控的平衡之中,为细胞核的可塑性提供了强有力的证据。在体细胞中导入多能基因随着分子生物学工具的日益强大,人们开始试着把关注点投向将细胞融合作为研究多能性及其相关调控机制的一种方法。为了避免核非整倍性所带来的问题,人们采用了同物种细胞融合的方法。,和其同事第一次发现在增殖的杂合予中体细胞的核被重编程。他们将来源于原始生殖细胞的一种多能干细胞,雌性胚胎生殖细胞与成体小鼠的胸腺细胞融合。然后运用甲基化敏感的限制性内切酶来检测去甲基化的序列,以及来自于体细胞的特定的印记基因和非印记基因是否被活化。并且,他们说明了得到的融合后的四倍体细胞具有多能性这些细胞在嵌合体胚胎中具有发育到三个胚层的能力。和同事随后证明体细胞可通过与胚胎干细胞融合而获得多能状态。他们将来自于雄性小鼠的胚胎干细胞与来源于转基因即在多能性标记基因的启动子后带有报告基因,若内源基因被激活,表达雌鼠的胸腺细胞进行融合,发现在失活的染色体上基因和胸腺细胞巾的转基因被重新活化了。用胚胎干细胞而非胚胎生殖细胞作为融合细胞,印记基因在融合得到的四倍体细胞中并没有去甲基化。随后,同一研究小组通过将两种不同小鼠的胚胎干细胞和胸腺细胞融合,得到了亚种间的杂合子。由于这两个弧种的基因组之间频繁地出现序列多态性,因而为观测杂合子中和的起源提供了条件。通过这一模型,科学家们发现与细胞融合形成的杂合子中,重编程的体细胞基因组其组蛋白和变得高度乙酰化,而组蛋白上第位赖氨酸残基在全基因组上被高度二甲基化和三甲基化,说明其表观遗传水平被转变为多能状态。和其同事通过将人的体细胞与人的胚胎干细胞以的比例融合,证明了四倍体杂合子中人的体细胞核发生了重编程。与其同事随后证明,在小鼠中过表达多能性转录因子基因可以显著地提高细胞融合基础上的核重编程水平。虽然,通常而言,由于只有少数基因产物存在特定差异,类似的核重编程分析存在一定的局限性,但是这些实验清楚的说明了在一定条件下,多能性调节因子可以战胜细胞分化的调节因子,导致重编程。由于可在种类特异的差别基础上观测所有的基因表达变化,不同物种细胞融合后得到的异核体与同物种细胞间融合得到的杂合子相比,在核重编程方面的研究具有更大的优势。并且,在异核体中,并未发生在混合物种细胞融合后得到的可增殖的杂合子中常见的染色体丢失,重排和非整倍性。但是,由于胚胎干细胞分裂很快而规模较大,因而人们觉得可能异核体并不适合研究体细胞中多能性的引入。因此,在细胞融合形成异核体后引入生长阻滞,使得细胞不能分裂,可能会防止多能性或分化性的丢失。但与推测相反的是,在两个实验室将小鼠的胚胎干细胞与人的成纤维细胞或淋巴细胞融合后得到的异核体中,多能基因如和均被迅速活化,其启动子也在一天内被去甲基化,。异核体是研究重编程过程中最早期的分子事件的理想工具。这项基因表达分析研究的关键是在融合后迅速地从融合产物中纯化出占很小比例通常仅约的异核体的能力,而目前可以通过流式细胞分选达到。而目前得到的实验结果显示,杂合子细胞广泛增殖并且在分析前进行了药物筛选,因而不可能用于测定基因表达最初期的变化。重编程的效率依赖于用于形成异核体的细胞类型在上述实验巾,淋巴细胞是而成纤维细胞时,并且细胞来源一同时基因活化和去甲基化的时机也有所不同。由此可推测,这些显示的不同可能是因为融合来源细胞的核所占的比例不同,以及转录调控因子之间的相互平衡作用不同,从而使得细胞重编程的范围不同。通过功能缺失和功能获得的方法,在异核体中检测到的快速重编程速率使得它们在研究初始重编程过程中所必需的分子机制方面非常有用。例如,当小鼠表达缺失的胚胎干细胞与人的淋巴细胞融合成异核体后,淋巴细胞被没有被重编程,说明蛋白在体细胞重编程到多能状态是必需的。另一个例子是,和同事们最近通过异核体的研究方法,发现了胞嘧啶碱基脱氨酶基因的新功能。它们发现了其酶活对于去甲基化和成纤维细胞核重编程是必需的。这些新的实验结果显示,虽然直接去除胞嘧啶碱基甲基基团的酶还未被发现,但是哺乳动物中存在的修复机制可以将甲基化地碱基或核苷酸换成非甲基化的。这些研究扩展了细胞融合的研究潜能,并对一些目前不清楚的问题,如去甲基化,提供了机制性的探讨。诱导多能干细胞,技术作为年最大的科学发现及重编程领域的重要里程碑,自问世至今,极大地推动了重编程领域的发展。年,日本科学家和运用病毒转导的方法,将一系列转录因子转入小鼠胚胎成纤维细胞,得到了类似于小鼠胚胎干细胞的一种细胞,并命名为诱导型多能干细胞,。同时,他们运用标记基因筛选系统,得到了获得细胞的关键因子/,。年,和分别运用内源和的表达作为更严格的筛选系统,得到了可以嵌合入生殖嵴的细胞图。随后的报道证明,细胞依靠区分而非药物筛选也可获得,增加了其医疗应用的可行性。而近期分别发表于及的文章通过四倍体囊胚注射实验,获得了完全由细胞发育而来的成体小鼠,从而证明了细胞具有与细胞完全相同的多能性。图特定因子诱导体细胞重编程示意图,也摘自年,不同国家的科学家运用相似的方法,通过病毒转导,将,和或/,和引入人的成纤维细胞,获得了人的细胞,。人细胞的获得使人们开始将视线投向细胞的医疗应用之中,运用技术获得病人特异的细胞,进行药物筛选或基凶治疗。细胞与细胞相比,更容易获得,因而具有更广泛的应用前景。细胞的获得使得重编程领域的研究走进分子水平。通过对细胞形成的机制的研究,可以加深对重编程机制的理解。之前的生化及分子生物学研究发现,和基因对于胚胎干细胞多能性的维持具有非常重要的作用,但形成细胞所转导的另外两个关键因子和在重编程中所起到的作用未能引起足够的重视。人们认为这两个原癌基因可能在重编程过程中体细胞增殖中起到了一定的作用,从而提高了细胞的诱导效率,加速了其形成的过程。其中一种推测是这两个因子共同作用,使体细胞发生了类似于癌化的转化过程。另一个模型认为基因修饰了成纤维体细胞的染色体状态,从而使得重编程因子更有效地接近于重编程所必需的基因,活化这些基因。也有报道证明在去除转导的条件下,也可得到细胞,但效率大大降低。第三个模型认为基因的过表达可以促进的复制,从而为体细胞基因组在外源重编程因子的调控下重建其表观遗传状态提供了机会,而可以刺激体细胞中基因的转录,使其与和协同作用,以在体细胞中表达胚胎干细胞的关键基因。因次,可能是重编程过程中唯一一个独立作用的因子,而其他的因子可能起到了协同的作用,从而在转化的细胞中建立起多能性的状态。和两个小组运用四环素诱导的慢病毒载体转导小鼠胚胎成纤维细胞,发现了重编程是个逐步的过程,并且在这个过程中,在细胞进入到一个稳定的自我维持多能性的状态之前,至少需要四个因子持续表达天,。在这个过程中,碱性磷酸酶活性被首先活化,随后胚胎特异表面抗原出现,最后随着内源性基因和基因的表达,标志着细胞被完全重编程,证明了多能基因的表达是随着重编程过程的发展而逐渐顺序出现的图蝴鹦鬻眷谬鬻嗲簿气。七,懒茹庸船群础髫彩静竹矗,蠡曩等,翥,一激旦鸯囊,把土一一一。一,婚量委一一二嘞糍鬻磁缓鏊赫茹矗进蠹差冀巍蒜钟哮锄彩砧图在体外重编程过程中多能性标记基因的顺序活化过程摘自疾病相关的细胞研究进展最早关于疾病相关细胞应用的报道来自于实验室。年底,他们通过将人源化的镰刀型细胞贫血病的小鼠成纤维细胞诱导成细胞,采取基因打靶技术改正了突变的基因,最后将修正的细胞分化得到的造血祖细胞移植回小鼠体内,首次建立了通过细胞技术进行治疗的小鼠模型图。在接卜来的时间里,疾病相关的细胞进展飞速实验室于年首次将包括、帕金森疾病、亨廷顿舞足舀症和唐氏综合症在内的种遗传疾病的病人细胞诱导成细胞,并对这种细胞的全能性进行了鉴定同年,由实验室发表在上的文章将一位岁的病人来源的体细胞通过病毒转导诱导得到的细胞定向分化为在该疾病中被损坏的运动神经元而在年发表于的文章中,实验室将疾病患者的皮肤成纤维细胞诱导得到细胞,并将该细胞定向分化成运动神经元。尤为突出的是,该实验室通过疾病机理研究,使用诱导复合物刺激增加该运动神经元中的蛋白水平,从而对该疾病进行治疗。这项研究为对疾病特异的细胞进行机理研究和药物筛选打下了良好的基础。洲”连。噶蛔弛睨呻,臻图用细胞技术和基因打靶技术治疗镰刀型细胞贫血病小鼠模型摘自甜遗传性疾病可通过基因修复的方法进行治疗。近期发表于的。篇文章运用携带蛋白的慢病毒载体感染贫血症病人的体细胞进行基因修正,再将修正后的体细胞诱导成细胞,该细胞的通路功能恢复正常,并可分化成正常的造血干细胞,这是首次通过基因修复,运用疾病特异的细胞对遗传性疾病进行治疗。运用基因打靶技术进行定向同源是治疗遗传病的一个主要方向。虽然该技术在小鼠细胞中得到了广泛应用,但由于人的细胞对胰酶尤为敏感的特性,运用定向打靶进行疾病治疗不仅是细胞领域,也是人的细胞领域所面临的一个难题。文章中运用锌指核酸酶等在发表在,转染,利用其可诱导靶向基因形成序列特异的双链断裂,从而在不影响其核型和多能性的前提下,大大提高人的细胞及细胞同源重组效率,为疾病相关的细胞通过同源重组进行疾病治疗提供了很好的模型。疾病细胞在应用研究中遇到的问题和改进疾病细胞的研究虽然推动了干细胞领域向实际应用的进展,但真正将疾病特异的细胞应用于临床还有很大的距离,面临很多问题。这些问题包括如何用其他类型的体细胞而非病人皮肤细胞获得细胞如何提高细胞重编程的效率如何解决病毒转导而使外源基因整合入病人基因组所带来的危险,以及最基本的一个问题细胞重编程的机制是什么。解决这些问题不仅是疾病细胞研究中的重点,也是整个细胞和干细胞领域的重点。用非成纤维细胞的体细胞重编程获得细胞在用成纤维细胞成功重编程获得细胞后,人们开始试着把目标转向其它类型的体细胞。年,实验室首先运用病毒转导体系,将成体小鼠的肝细胞和胃上皮细胞重编程为细胞,并证明了细胞的形成与特定病毒整合位点无关。同年月,实验室在发表于上的文章中运用转基因和诱导系统,将小鼠非终末分化的细胞成功重编程为细胞,并在四个转录因子诱导表达基础上再过表达/或特定干涉细胞转录因子,可将终末分化的淋巴细胞完全重编程。这项研究充分证明了终末分化的细胞仍可被体外重编程为多能细胞图。而实验室根据小鼠神经干细胞中表达较高水平的和正常水平的这一结果,运用/和两个因子,将其诱导成为细胞。同年月,实验室将小鼠胰岛的细胞成功诱导为细胞,为糖尿病的治疗提供了一个新的模型。而一篇发表于的文章通过个因子逆病毒转导,将人的角细胞重编程为细胞,并说明其重编程效率比成纤维细胞的重编程效率更高,速度更快。这些研究充分证明了非成纤维体细胞也可以通过技术体外重编程为多能干细胞,为其医学应用提供了更广阔的供体体细胞来源。哪咿咖埔啪蜕,糊嘶孵塑一一每麓订咄时咄脚工回懈曲岫/孙慵幻嘲,岫哺一一拭麓静瞩州憎脚砷岫触吖删嘶砸虮口眦图细胞体外重编程流程示意图摘自提高细胞重编程效率运用逆病毒转导体细胞,虽然可以使其重编程为多能干细胞,但效率极低,只有。低效率诱导必然会造成应用上的不稳定性。提高细胞重编程效率主要有两个方面一是尽量减少诱导所需的转录因子一是添加化学小分子,通过影响表观遗传修饰,提高重编程效率。这两个方面是相互联系,相互影响的。早在技术建立之初,就有文献报道小鼠和人的细胞都可以在无而用其它三个因子的诱导下形成。虽然这样并不能提高重编程效率,但避实验免了原癌基因整合入基因组导致肿瘤易生性的后果。室近期发表在上的文章报道了根据神经干细胞本身的特性,在原来利用/和两个因子的基础上进行改进,只用一个转录因子/就町以将的两神经干细胞重编程为细胞。而近期分别发表于和篇文章均采用多顺反子性的病毒