缬沙坦防治糖尿病肾病肾间质纤维化作用机制研究（可编辑）

缬沙坦防治糖尿病肾病肾间质纤维化作用机制研究TOATHESISSUBMITTEDZHENGZHOUUNIVERSITYMASTERFORTHEOFDEGREEINRENALINTERSTITIALFIBROSISEFFECTSOFVALSARTANPREVENTDIABETICRATSNEPHROPATHYQINGPOSTGRADUATEGUOLINSUPERVISORTANGOFNEPHROLOGYDEPARTMENTAFFILIATEDOFTHEFIRSTUNIVERSITYHOSPITALZHENGZHOUZHENGZHOU450052，HENAN2011APRIL原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。日期弘F年岁月圬日学位论文作者奄薏学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。日期驯年J月心日学位论文作者韬纤维化是ESRD的共同的病理学特点，因而尽早的延缓甚至逆转肾间质纤维化对防治DN进展有重要意义。缬沙坦作为一种血管紧张素受体拮抗剂，具有肾脏保护作用，其治疗糖尿病肾病防治间质纤维化的作用机制尚未完全明了。本研究Q、以大鼠糖尿病。|肾病模型为研究对象，应用缬沙坦进行干预，分别检测HIF一1TIMP一1、MMP一9在肾间质中MRNA的表达变化，并结合尿蛋白定量及肾功能等其他生化指标，进而阐明DN间质纤维化的发生机制，同时为临床应用ARB类药物缬沙坦治疗糖尿病肾病提供理论依据。方法G，由河南省实验动物中心提供。随机分为正常对照组C组，18只、糖尿病肾病模型组D组，18只和缬沙坦治疗组T组，18只。动物禁食12小时，D组、T组大鼠采用链尿佐菌素STZ以60MGKG一次性单侧腹腔注射制备糖尿病肾病大鼠模型，C组动物注射等量的缓冲液。稳定3天后尾静脉采血测定血糖，将血糖大于167MMOLL为DM模型动物造模成功。普通饮食继续喂养3周，用金属代谢笼收集24小时尿液后，用磺基水杨酸法，并行空白对照测定24小时尿蛋白排泄量，当24小时尿蛋白定量30MG时确认DN大鼠模型成功。造模后T组大摘要鼠给予缬沙坦混悬液按40MGKGD一次性灌胃，C组和D组大鼠给予同等体积蒸馏水灌胃，分别于4周、8周、12周时测体重、血糖、血肌酐、血浆白蛋白；收集24小时尿标本进行尿蛋白定量；肾脏称重，计算肾脏指数肾重体重肾组织进行石蜡切片、MASSON染色、免疫组织化学法测定HIFIQ、TIMP1、MMP一9在肾组织的表达变化，RTPCR测定上述三因子的MRNA的表达变化。实验期间自由饮水、进食，不使用胰岛素及其他降糖药物。结果1实验室检查DN大鼠造模成功后，D组T组大鼠的血糖即明显高于C组尺005，且在整个实验过程中，血糖持续在高水平见表1。C组大鼠血糖、血浆白蛋白、24小时尿蛋白定量、肾脏指数，血肌酐从4周到12周无明显差别，D组大鼠血浆白蛋白、24小时尿蛋白定量、肾脏指数、血肌酐与同时间C组相比有显著差异尺005，在8周末、12周末T组大鼠24小时尿蛋白定量、肾脏指数，血肌酐显著低于相应D组，血浆白蛋白高于D组只O05见表252免疫组化正常对照组HIF一1Q、TIMP一1在肾间质及肾小管上皮细胞内极少量表达，MMP一9表达呈阳性。D组及T组中HIF一1Q，TIMPI与MMP一9均表达于肾小管上皮细胞的胞浆中，8周与12周时，T组与D组相比较，TIMPI与HIF1Q表达相对减少，姗P一9表达相对增多。3MASSON染色D组、T组大鼠肾间质胶原相对面积MASSON染色肾间质蓝染区面积与视野面积的比值明显高于C组尺005，从8周起T组肾间质胶原相对面积低于D组尺O05。见表6，图41494RTPCR技术C组HIFL少O05。D组、T组HIFLA、TIMPIMRNA的表达明显高于正常对照组尺005，并随时间的变化逐渐增加，在8周、12周时T组的表达水平低于相间的变化逐渐减少，在8周、12周时T组的删P一9MRNA表达水平高于相应D组尺005。见图A、L、2、3摘要A，TIMPL与肾问质纤维化RIF5相关性分析糖尿病大鼠模型中HIF一1面积及血肌酐成正相关，MMP一9与肾问质纤维化RIF面积及血肌酐呈负相关。结论A、TIMP一1表达增多而MMP一91糖尿病肾病大鼠肾小管上皮细胞中HIF一1的表达减少。2缬沙坦可能通过下调HIF1Q的表达，调节MMP一9TIMPL表达的平衡，延缓DN大鼠肾间质纤维化的进程，而发挥肾脏保护作用。Q；TIMP一1；MMP一9关键词缬沙坦糖尿病肾病大鼠肾间质纤维化；HIF一1UIABSTRACTFIBROSISINRENALINTERSTITIALEFFECTSOFVALSARTANPREVENTRATSDIABETICNEPHROPATHYGUOPOSTGRADUATEQINGLINTANGSUPERVISOROFNEPHROPATHYDEPARTMENTOFTHEFIRSTAFFILIATEDUNIVERSITYHOSPITALZHENGZHOU450052ZHENGZHOUABSTRACTANDECTIVES0BJBACKGROUNDOFASERIOUSCHRONICMICROVASCULARDIABETICCOMPLICATIONSNEPHROPATHYDN，ASCAUSEOFRENALBECOMETHEDISEASEESRDRENALENDSTAGEDIABETES，HASMAJORTREATMENTOFFEATURESOFESRDTHUSTHEINTERSTITIALFIBROSISISACOMMONPATHOLOGICALARERENALINTERSTITIALFIBROSISINDNASASOREVENEARLYPOSSIBLEDELAYINGREVERSINGAEFFECTISANRECEPTORANTAGONIST，HASPROTECTIVEVERYANGIOTENSINIMPORTANTVALSARTANFIBROSISARETHEINTERSTITIALRENALTHEMECHANISMSOFINDESEASESBUTKIDNEYPREVENTIONINDUCEDTHERATMODELOFDIABETICUNDERSTOODTHEHADNOTEXPERIMENTYETFULLYWITHINTERVENTEDNEPHROPATHYBYSTREPTOZOTOCINSTZ，ANDANDMMP一9INDETECTEDHIF1TISSUE，MEASUREDURINARYA，TIMP1EXPRESSIONSKIDNEYOFDIABETICILLUSTRATEDTHEANDOTHERBIOCHEMICALINDICATORS，ANDPATHOGENESISPROTONFORIIMECHANISMINTERSTITIALRECEPTORFIBROSIS，THEPOSSIBLEANGIOTENSINNEPHROPATHYORDERTOFUNCTIONWASALSORENALINVESTIGATED，INANTAGONISTVALSARTANTOPROTECTANDTREATMENTOFDIABETICTHEORETICALBASISFORTHENEPHROPATHYPREVENTIONPROVIDEMETHODSWEREWEREDIVIDEDMALESPRAGUEDAWLEYSDRATSRANDOMLYFIFTYFOURHEALTHYTO3CONTROLGROUP，DIABETESNEPHROPATHYGROUPDGROUP，GROUPSNORMALGROUPCIVABSTRACTTREATMENTWITHRATSOFDANDTGROUPVALSARTANTGROUPVALSARTAN40MGKGDTHERECEIVEDAOFATSTZADOSEOFWTSIGNALGROUPSINTRAPERITONEALINJECTION60MGKGANDTHERATSCRECEIVEDANTHEOFOFSAMEVOLUMEOFSODIUMONLYGROUPINJECTIONCITRATETHEDIABETICMODELWASCONSIDEREDTOBESUCCESSFULWHENTHEBLOODGLUCOSEWAS167MMOLLAFTER3OFSTZ3THEURINEOFDAYSINJECTIONAFTERWEEKS，COLLECTING24HOURSMETALMETABOLISMOF24HOURSTHROUGHCAGES，ANDMEASURINGURINARYPROTEINTHERATSOFURINEOF24WERESUCCEEDTHETREATMENTRATSPROTEINHOURS_30MGGROUPWERETREATEDWITHRATSDTHEOFCANDWERETREATEDVALSARTAN40MGKGDANDGROUPWITHTHESAMEVOLUMEOFWATERATAND12TH4TH，8THTAPWEEKS，SERUMCREATININE，SERUMURINEALBUMIN，BLOODGLUCOSE，24HOURPROTEIN，KIDNEYINDEXKIDNEYWEIGHTSIXRATSWERESACRIFICEDFOREACHBODYWEIGHTWEREMEASURED；THENGROUPMETHODSOFANDREVERSERESPECTIVELYTHEIMMUNOHISTOCHEMISTRYTRANSCRIPTASEPCRUSEDTODETECCTTHEOFHIFLINRENALA，TIMP一1，MMP一9RTPCRWEREEXPRESSIONSINTERSTITIALALLRATSWEREALLOWEDFREEACCESSTOFOODANDWATERTHEDURINGINSULINANDOTHERWERENOTEXPERIMENT，WHEREASHYPOGLYCEMICDRUGSSUPPLIEDRESULTS1INTHEWHOLETIMEOFOFTHEDIABETICEXPERIMENT，BLOODGLUCOSENEPHROPATHYRATSATSERUMKEPTHIGHLEVELTABLE1THEALBUMIN，BLOODGLUCOSE，SERUMCREATININE,INTHEDANDTWEREKIDNEYINDEX，24HOURURINARYPROTEINGROUPSSIGNIFICANTLYDIFFERENT州TLLTHOSEOFTHENORMALCONTROLTHETREATMENTGROUP尸O05INGROUP，FROMTHEENDOF8THWEEKTO12THWEEKSERUMINDEXAND24HOURCREATININE，KIDNEYWERELOWERTHANTHOSEINTHEDIABETICURINARYPROTEINSIGNIFICANTLYNEPHROPATHYALBUMINWASMORETHANTHATOFTHEDIABETICGROUP，SERUMNEPHROPATHYGROUPP005TABLE252IMMUNOHISTOCHEMISTRYINNORMALCONTROLWASGROUP，HIFIA，TIMP一1EXPRESSIONWEAKLYPOSITIVE，MMP9WASDIABETICANDEXPRESSIONPOSITIVEINA，TIMP一1NEPHROPATHYGROUP，HIFLMMP9WEREINTHERENALTUBULARTHE8THEXPRESSEDEPITHELIALCELLCYTOPLASMATAND12THWITHTHEDOFTIMP一1ANDHIFLAWEEKS，COMPAREDGROUP，THEEXPRESSIONSINTHETWEREWASINCREASEDGROUPREDUCED，MMP9EXPRESSIONRELATIVELYVABSTRACT3MASSONSTAININGINDIABETICANDTREATMENTWITHVALSARTANTHEAREAOFNEPHROPATHYGROUPGROUPINTERSTITIALFIBROSISWASTHANTHATOFTHECONTROLKIDNEYSIGNIFICANTLYLARGERGROUPPWEEKAREAINTHETREATMENTLESSTHANTHEAREAINTHEENDOF8THTHE005，FROMGROUPDIABETIC6，FIGURE4149NEPHROPATHYGROUPP005TABLE4IMPCRIN4THINNORMALCONTROLMRNAA，TIMPL，MMP9GROUP，HIFLEXPRESSIONSWEEKHADNODIFFERENCEINDIABETICWEEK，8THWEEK，12THSIGNIFICANTNEPHROPATHYANDTREATMENTHIFLMRNAWEREGROUPET，TIMPLEXPRESSIONSSIGNIFICANTLYGROUPTHANTHENORMALCONTROLINCREASEDWITHTIME，GROUPPO05，ANDHIGHERGRADUALLYAFTERANDLEVELINVALSARTAN8WEEKS12WEEKS，THEHIFLET，TIMPLEXPRESSIONSLOWERTHANTHEDIABETICTREATMENTWEREGROUP衅005；MMP9GROUPNEPHROPATHYINTHETHEATMENTWEREMRNADIABETICANDGROUPEXPRESSIONNEPHROPATHYGROUPOVERLOWERTHANTHENORMALCONTROLSIGNIFICANTLYGROUPPO05，GRADUALLYREDUCINGLEVELTIMEATTHEENDOF8WEEKSAND1MMP9INTREATMENT2WEEKS，THEEXPRESSIONWASTHANTHATINDIABETICA，L，2，3GROUPHIGHERNCPHROPATHYGROUP尸005FIGURERATSAND5CORRELATIONDIABETICMODEL，HIFLET，TIMP一1ANALYSISINNEPHROPATHYTHEAREATHEAREAOFINTERSTITIALANDFIBROSISRIFHAVEPOSITIVELYRELATIONSHIP，MMP一9OFRENALINTERSTITIALFIBROSISHAVECORRELATIONNEGATIVECONCLUSIONINCREASEDANDTHE1INDIABETICRATSHIFLA，TIMP1NEPHROPATHYEXPRESSIONSOFMMP9DECREASEDEXPRESSION2VALSARTANREDUCETHEHIFLETTHEOFMAYEXPRESSION，REGULATINGEXPRESSIONTHEOFRENALINTERSTITIALAMMP9TIMP1BALANCE，REDUCINGDEGREEFIBROSIS，PLAYEDINRENALROLEPROTECTIONINTERSTITIALWORDSVALSARTAN；DIABETESFIBROSISRIF；KEYNEPHROPATHY；RATS；RENALHIFLET；TIMPL；MMP9；VI主要符号和缩略语说明I缬沙坦防治糖尿病肾病肾问质纤维化作用机制的研究1L前言12材料与方法33结果”124讨论”225结论”24参考文献”25综述部分基质金属蛋白酶9及其酶抑制物1与肾间质纤维化一28参考文献35附录部分致谢”37个人简历、研究生期间发表论文38主要符号和缩略语说明主要符号和缩略语说明英文全称中文译名英文缩写DMDIABETESMELLITUS糖尿病DIABETICDN糖尿病肾病NEPHROPATHYRIFRENALINTERSTITIALFIBROSIS肾间质纤维化ESLMRENALDISEASEENDSTAGE终末期肾病DRMDIABETICRATMODEL糖尿病大鼠模型AHIF1AFACTORLAHYPOXIAINDUCIBLE缺氧诱导因子I1TIM口1TISSUEINHIBITOROF基质金属蛋白酶抑制因子1METALLOPROTEINASE9MMP9MATRIX基质金属蛋白酶9METALLOPEPTIDASERAASRENINALDOSTERONEANGIOTENSIN肾素一血管紧张素一醛固酮系统SYSTEMSTZSTREPTOZOTOCIN链脲佐菌素IIANGN锄舀OTENSIN血管紧张素IIALMIIIBLOCKERANGIOTENSINTYPERECEPTOR血管紧张素111型受体拮抗剂BUNBLOODUREA尿素氮NITROGENCRCREATININE肌酐RTPCRREVERSEPOLYMERASECHAIN逆转录一聚合酶链反应TRANSCRIPTIONREACTIONPTCTUBULARCELL近端小管上皮细胞PROXIMALECMEXTRACELLULARMATRIX细胞外基质GBMBASEMENTMEMBRANEGLOMERULAR肾小球基底膜PAL1ACTIVATORINHIBITORI纤溶酶原激活物抑制剂一1PLASMINOGENUUOUNILATERALURETERALOBSTRUCTION单侧输尿管梗阻GFRFILTRATIONRATEGLOMERULAR肾小球滤过率TEN兀TOTUBULAUREPITHELIAL肾小管上皮细胞转分化MESENCHYMALTRANSITION前言缬沙坦防治糖尿病肾病肾间质纤维化作用机制的研究硕士研究生郭青导师唐琳郑州大学第一附属医院肾内科郑州4500521前言糖尿病肾病DIABETICNEPHROPATHY，DN是糖尿病中最常见又严重的慢性微血管并发症之一，通常指由于糖尿病引起的肾小球基底膜增厚，系膜扩张以及胞外基质增生，导致肾小球的高滤过和蛋白尿。终末期肾脏病ENDSTAGERENAL的共同的病理学特点，因而尽早的延缓甚至逆转肾间质纤维化对防治DN进展有重要意义。缬沙坦作为一种血管紧张素受体拮抗剂，具有肾脏保护作用，其治疗糖尿病肾病防治间质纤维化的作用机制尚未完全明了。近年来研究发现，肾小管间质病变与DN肾功能衰竭的进展密切相关，它比肾小球硬化更能反映肾脏受损伤的程度。肾素一血管紧张素一醛固酮系统RAAS在糖尿病。肾病的发生发展中起着重要的作用，近端。肾小管细胞存在完整的II是RAAS发挥作用的主要效应因子。已有研究表RAAS，血管紧张素IIANG明，DN患者肾脏局部HNG活性增高，原因可能为高血糖可使近曲小管血管紧张素原表达增高，使系膜细胞合成ANG增多，由此激活肾脏RAS另一方面，DN时肾脏局部的ANG降解速度减慢。在DN的发病机制中，ANG起着血流动力学和非血流动力学的双重作用。近几年研究发现，ANG的非血流动力学作用，如参与细胞外基质ECM成分在。肾脏局部的积聚，促进单核细胞巨噬细胞浸润等作用在为，ANGLL和生长因子通过改变肾脏血流动力学和促肾细胞肥大，最终导致。肾纤TUBULARCELL维化WOLF等的研究表明ANGII可使近端小管上皮细胞PROXIMALPTC转录和合成型胶原的量明显增加，并使其限制性分布在基底侧，而同时ANG刖青从ACEI在防止糖尿病肾组织纤维化的保护作用证明了ANGII的促间质纤维化作用。慢性缺氧是指在进行性肾损害过程中，。肾小管一间质部分存在着慢性氧耗竭的现象，这种慢性缺氧是导致肾脏纤维化的机理之一H1。而缺氧对肾脏损害的作INDUCIBLE用主要是通过HIFLFACTOR1AHYPOXIAQ，HIF1A介导的畸】，低氧通过HIFLQ上调其靶基因的表达而发挥生物学功能，在肾小管间质损伤中起着关键的作用。研究发现HIF1Q可调节多种与RIF有关的细胞因子的表达，II体外刺激肾间质细促进糖尿病肾病RIF的进程1。我们的以往研究发现，ANG胞，可使细胞中HIF一1A的表达增加，并促进肾间质纤维化的进程。肾间质纤维化的物质基础是ECM的大量聚集口1，基质金属蛋白酶MMPS是降解ECM结构蛋白的主要酶类，组织型基质金属蛋白酶抑制物TIMPS是其内源性抑制物徊1，二者在ECM的降解过程中发挥着重要的调控作用，MMP一9TIMPL平衡的失调是导致肾间质纤维化的重要原因阳1。陈荣权等阳1发现，肾间质纤维化及蛋白质的表达也相应增高，说明TIMP1的高表达可能是肾间质损害加重的重要因素之一。汤询等U伽发现TIMP一1表达增高，导致ECM降解减少，促进肾组织纤维化发生。左怡心等1在UUO大鼠肾组织中发现PAL1和TIMPLMRNA明显上升。陈志强等U21发现梗阻后肾组织呈现程度不同的病理损害，可能与MMP一1TIMP一1表达明显失衡有关，GONZALEZ等利用大鼠肾纤维化实验模型也显示，FIB15天大鼠皮质小管细胞胞质内放射免疫荧光显示实验组删PL、MMP一9尽管与对照组无统计学意义，但实验组胶原量仍然升高，因此推断是MMPS活性降低的缘故，同时TIMP1也参与了胶原大量沉积的过程N3】。本研究选取姗P_9TIMP一1作为肾间质纤维化的评价指标。在DN问质病变的发展中，HIF一1Q，MMP一9TIMP1之间有着密不可分的关系，但上述基因在DN间质纤维化发生中的作用机制及相互关系如何，至今为止尚未见报道。本研究应用糖尿病肾病大鼠模型系统的探讨了HIF1Q，MMP一9、TIMP一1在肾脏中的表达和分布情况，观察应用缬沙坦干预后上述指标的变化，为进一步阐明缬沙坦防治DN肾间质纤维化的作用机制及其应用提供理论依据。2材料与方法2材料与方法21主要试剂1链脲佐菌素STZ美国SIGMA公司2无水乙醇南京化学试剂一厂3乙醚南京化学试剂一厂4DBA显色试剂盒北京中杉金桥生物技术有限公司5苏木素北京中杉金桥生物技术有限公司6二甲苯南京化学试剂一厂7BCA蛋白浓度测定试剂盒碧云天公司，9异丙醇南京化学试剂一厂10封片剂北京中杉金桥生物技术有限公司11柠檬酸上海试剂一厂12柠檬酸钠上海试剂一厂132戊巴比妥钠SIGMA公司14氯化钾南京化学试剂一厂15氯化钠南京化学试剂一厂16RTPCR试剂盒日本TAKARA公司17TIMP一1兔抗人单克隆抗体浓缩液北京中杉金桥生物技术有限公司18MMP一9兔抗人多克隆抗体浓缩液北京中杉金桥生物技术有限公司19HIFL121鼠抗人单克隆抗体浓缩液北京中杉金桥生物技术有限司20PV一9001免疫组织化学试剂盒北京中杉金桥生物技术有限公司21缬沙坦胶囊代文北京诺华公司22TRIZOL试剂TRIZOLREAGENT北京赛百盛生物技术有限公司23溴酚兰北京SOLARBIO科学技术有限公司24扩增试剂盒绿色体系PROMEGA公司25目的基因和GAPDH引物上海捷瑞生物技术有限公司26琼脂糖PROMEGA公司27DEPCINVITROGEN，USA材料与方法28EB北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司22所用设备与仪器120低温冰箱青岛海尔2便携式血糖仪强生ONETOUCH快速血糖检测仪3一80超低温冰箱SANYO，JAPAN4JAI003电子天平上海天平仪器厂UUIL5微量加样器1000ILL，2001，40L，LO1德国EPPENDORF公司67230分光光度计惠普上海分析仪器有限公司7REICHEITJUNG切片机2030，GERMANY8图象分析系统捷达801形态图像分析系统，江苏捷达科技发展有限公司9全自动生化分析仪HITACH日立7250，JAPAN10高速离心机德国LABOFUGE公司11PCR仪美国BIOMETRA公司12石蜡切片机德国LECIA公司13电热恒温干烤箱202OAB型天津市泰斯特仪器有限公司143034A数显电热保温箱上海阳光实验仪器有限公司15BX41光学显微镜日本OLYMPUS公司16QCAPTURE图像采集系统加拿大QIMAGING公司17洁净工作台北京市西城半导体设备一厂18HJ3恒温磁力搅拌器江苏金坛医疗仪器厂19H1微型混合器上海彭氏实业有限公司21DYYIIL2稳压稳流电泳仪北京市六一仪器厂22DYYIIL31D型电泳槽北京市六一仪器厂23微波炉MICROWAVEOVEN上海中达医学应用研究所24凝胶成像系统安莱有限公司23缓冲液配制方法10OLMOL4材料与方法NA2HP04299，NAHP04039。液450MI蒸馏水；24动物模型1802209，由郑州大学实验动物中心提供。自由摄取标准大鼠饲料郑州大学实验动物中心，自由饮水，室温控制在253郑州大学实验动物中心。将SPF级大鼠54只随机分为正常对照组C组，18只、糖尿病肾病模型组D组，18只和缬沙坦治疗组T组，18只。以新鲜配制的枸橼酸缓冲液01MOLL、PH为46稀释成1溶液，按60MGKG体重单侧腹腔一次性注射对照组的大鼠腹腔注射等容积的柠檬酸缓冲液。在注射STZ后，各组大鼠自由进食饮水，实验中不给予任何降血糖药物。大鼠饮水TOUCH快量、尿量明显增加，体重下降，消瘦，精神差，第3天用强生ONEFPG，D组和T组大鼠的血GLUCOSE速血糖检测仪测定空腹血糖FASTINGPLASMA糖值全部超过167NUNOLL，糖尿病模型复制成功。普通饮食继续喂养3周，用金属代谢笼收集24小时尿液后，用磺基水杨酸法，并行空白对照测定24小时尿蛋白排泄量，当24小时尿蛋白定量30MG时确认DN大鼠模型成功。3普通饮食继续喂养4周、8周、12周，用金属代谢笼郑州大学实验动物中心收集24D,时尿液，T组给予缬沙坦混悬液北京诺华公司，生产批号X0888按40MGKGD一次性灌胃，C组和D组给予同等体积蒸馏水灌胃。24实验方法241样品收集各组分别于第4周、8周、12周末，检测大鼠血糖、体重，用金属代谢笼留取24D,时尿标本，测尿量，测定24D,时尿蛋白总量。并在上述时间点，采用3水合氯醛麻醉，经腹主动脉取血，检测血糖、血肌酐、血浆白蛋白。各组分别处死大鼠，取右肾，称重，右肾与体重的比值作为肾脏肥大程度的指标。右侧5材料与方法肾脏剖开，生理盐水清洗血液后放入无菌灭酶的EP管中，放入液氮中急冻后一80“C低温冰箱郑州大学一附院肾脏病理室保存备用。大鼠左侧肾脏生理盐水清洗血液后经10福尔马林多聚甲醛中固定后，按梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片，MASSON染色和免疫组化郑州大学一附院病理室。242血糖检测美国强生ONETOUCT快速血糖检测仪检测。造模前测空腹血糖，在注射STZ后，72D,时，实验4周、8N、12周末，分别检测各组大鼠血糖。24324小时尿蛋白总量测定采用双缩脲法。具体步骤代谢笼收集24D,时尿，测量尿量，混匀后取68ML尿液到干燥清洁试管中离心，取上清液。磺脲酸法进行尿蛋白定性。尿蛋白定离心5分钟，倾去上清，将试管倒置于滤纸上，沥干液体，保留沉淀，加生理盐水至LML混匀；再取两支试管，空白管加生理盐水LML，标准管加用蛋白标准液50LLML，以上试管中分别加入双缩脲4ML，充分混匀后置入37水浴箱内水浴30分钟后，1500RPG离心5分钟。540NM波长下比色，以空白管调零，读取测定管和标准管的吸光度。根据公式计算出24D,时尿蛋白24D时尿蛋白G测定管光密度标准管光密度24D时尿量LXQ尿蛋白定性卅时，Q为03，尿蛋白定性卅时，Q为15。分别在实验第4周末、第8周末及第12周末，检测各组大鼠24D“时尿总蛋白定量。244载玻片和盖玻片的处理新载玻片上常附有油污，故必须经清洁液浸泡，流水漂洗过夜，用蒸馏水清洗后，浸泡在95酒精内，再用绸布擦干，贮放于玻片盒内备用。准备干净塑料器皿，多聚一L一赖氨酸用蒸馏水L10稀释后，干净玻片室温浸泡5分钟。捞出后于无尘处干燥或烘烤，密封后备用。盖玻片则直接浸泡在无水酒精中，用绸布擦干后备用。245MASSON染色步骤6材料与方法1石蜡切片置于60恒温箱晕烘烤20分钟52脱蜡水化依次浸入二甲苯I10分钟，二甲苯II10分钟，无水酒精I分钟，无水酒精LI5分钟，95酒精I5分钟，95酒精II5分钟，80酒精5分钟，6096酒精5分钟，蒸馏水冲洗3二次固定固定于BOUIN液，水洗405天青石蓝染色3分钟，流水冲洗10分钟5HARRIS明矾苏木素液染3分钟，蒸馏水冲洗6丽春红酸性品红液染色510分钟，蒸馏水冲洗71磷钼酸水溶液处理约5分钟，不用水洗82苯胺蓝液复染5分钟91冰醋酸处理1分钟1095酒精脱水多次11无水酒精脱水，二甲苯透明12中性树胶封片13显微镜下观察，结果可见胶原纤维染绿色肾间质纤维化相对面积测定码显微图像分析系统进行自动分析。取MASSON染色组织切片，每张选取10个不重复的200倍视野，测定肾间质绿染区面积与整个视野面积的比值，取平均值。25免疫组织化学染色251免疫组化步骤SP1切片脱蜡至水，PBS洗35分钟2柠檬酸抗原修复10分钟，自然冷却3PBS浸泡5分钟，3次35分钟43H。0封闭内源性过氧化物酶，室温20分钟5PBS浸泡5分钟，3次35分钟6滴加山羊血清50U1片，室温封闭内源性生物素20分钟7甩除勿洗，滴加一抗TIMP1兔抗人单克隆抗体，HIF1Q鼠抗人单克隆7材料与方法U抗体、MMP9兔抗人多克隆抗体501片，4过夜8PBS浸泡5分钟，3次35分钟U9滴；ON抗SP9001兔SP501片，室温30分钟10PBS浸泡5分钟，3次35分钟11滴加辣根酶标记卵霉链白素50UL片，室温30分钟12PBS浸泡5分