三孢布拉霉菌产β-胡萝卜素发酵条件的研究

三孢布拉霉菌产胡萝卜素发酵条件的研究食品与发酵,I,1技FOODANDFERMENTATIONTECHNOLOGY第46卷第4期VO146，NO4三孢布拉霉菌产I3一胡萝卜素发酵条件的研究潘鹏。，杨斯。，蔡俊，1发酵工程省部共建教育部重点实验室，武汉湖北430068；2湖北省工业微生物重点实验室，武汉430068；3湖北工业大学生物工程学院，武汉430068摘要采用单因素轮换法优化P一胡萝素合成的发酵条件，考察因素包括正负茵种龄、发酵周期、接种量、正负菌种接种比例、初始PH、发酵温度、装液量、摇床转速。结果表明，三孢布拉霉菌的最佳摇瓶发酵条件为正菌种龄12H15H、负菌种龄25H30H、发酵周期120H、接种量20、正负菌种接种比例23、初始PH65、发酵温度28、装液量50ML250ML三角瓶、摇床转速200RPM，B一胡萝I素产量为288MGL。关键词三孢布拉霉；B胡萝卜素；发酵条件中图分类号TS2013文献标识码A文章编号1674506X20100400360O05STUDYONFERMENTATIONCONDITIONSOF3CAROTENEBYBLAKESLEATRISPORAPANPENGYANGSICAIJUN卫NKEYLABORATORYOFFERMENTIONENGINEERING,MINUTRYOFEDUCATION,HUBEIUNIVERSITYOFTECHNOLOGY,WUHAN430062HUBEIPROVINCIALKEYLABORATORYOFINDUSTRIALMICROBIOLOGY,WUHAN430068；3COLLEGEOFBIOENGINEERING,HUBEIUNIVERSITYOFTECHNOLOGY,WUHAN43OO68ABSTRACTTHEELEMENTARYFERMENTATIONCONDITIONSWEREOBTAINEDTHROUGHASERIESOFSINGLEFACTORROTATIONMETHODBASEDONTHEANALYSISOFTHESERESULTS，THEOPTIMALCULTURECONDITIONSWERECONFIRMEDBYORTHOGONALTESTTHERESULTSSHOWEDTHATTHEOPTIMUMCONDITIONSARESEEDAGEOFSTRAIN1215HANDSTRAIN一2530H、FERMENTATIONTIME120H、INOCULUMSIZE20、THERATIOOFSTRAINTOSTRAIN23、ORIGINALPH65、CULTURETEMPERATURE28、MEDIUMVOLUMES50MU250MLTRIANGULARFLASK、ROTATINGSPEED200RPMPCAROTENEPRODUCTIONWAS288MG几KEYWORDBLAKESLEATRISPORA；CAROTENE；FERMENTATIONCONDITIONSDOI1039690ISSN1674506X201004009类胡萝卜素是一类重要的天然色素，专门应用于天然着色剂、食品添加剂、营养食品、保健品、药品、化妆品及生物工程产品的生产。尽管各种天然和生物合成类胡萝B素具有很大的可利用性，但仅有少数被利用于商业开发，包括B一胡萝卜素、番茄红素、虾青素、角黄素、叶黄素等。G一胡萝卜素，包含有8个异戊二烯和2个B一紫罗兰酮环结构，被称为维生素A的前体。它已应用于食品和食品添加剂的生产及食品生产过程中的着色剂，如人工奶油、不含酒精的饮料以及烤培食品，它还被作为抗生素以减少细胞和组织的损伤。8一胡萝卜素的微生物发酵法目前主要由高产优良菌种丝状真菌三孢布拉霉来生产【1】。本研究以三孢布拉氏霉正负菌为生产菌种，采用单因素轮换法利用一系列单因素试验优化B一胡萝卜素合成的发酵条件，以期为工业化生产奠定基础。1材料与方法11菌种三孢布拉氏霉菌BLAKESLEATRISPORA、一收稿日期20100629基金项目湖北省自然科学基金重点项目项目编号2009CDA059作者简介潘鹏1984，男，湖北枝江人，硕士研究生，研究方向发酵工程。I通讯作者蔡俊，教授，EMAILCAIJUNMAILHBUTEDUEN第46卷慧第158期潘鹏等三孢布拉霉菌产B一胡萝B素发酵条件的研究37本实验室保藏。12培养基斜面培养基PDA新鲜去皮马铃薯200G、蔗糖20G、琼脂20G、自来水1000ML，PH自然；种子培养基葡萄糖5、蛋白胨25、KHZPO01、VBL0005、PH值60；发酵培养基玉米粉3、大豆粉2、棉籽油3、KH2PO402、MGSO47H2O02、VBL0002、初始PH60。13培养方法131斜面接种培养三孢布拉霉“”、“一”菌株分别接到斜面培养基中，置于培养箱内，28培养3D5D。三孢布拉霉是一种丝状真菌，菌丝体能迅速蔓延至整个斜面。正菌的菌落为黑色，有大量孢子分布，负菌的菌落为白色，有少量孢子分布B4】。132种子培养用无菌水将孢子洗脱下来，并配制成浓度相等的孢子悬液。将正负菌分别以等量的孢子悬液接种到种子培养基中，种子培养基的装液量50ML250ML三角瓶，培养温度28，摇床转速180RMIN振荡培养至对数生长期。133发酵培养将正、负菌分别培养的种子液以一定的接种量和混合比例接入到装有一定体积发酵培养液的250ML的三角瓶中，在适当的温度下，以一定的摇床转速振荡培养至发酵终点。期间在发酵40H后加入B一紫罗兰酮LMLL。14测定方法阎141生物量的测定发酵液用纱布过滤，湿菌体在50下真空干燥，恒重后称量。142B一胡萝卜素含量的测定1_4_21B一胡萝B素标准曲线的绘制精确称取某公司生产的P一胡萝卜素标准品30纯度50MG，加入少量氯仿溶解，用化学纯的石油醚稀释至50ML，吸取20ML用石油醚继续稀释至100ML，此稀释液含B一胡萝卜素20GML。分别吸取10ML、15ML、20ML、25ML、30ML、35ML含P一胡萝B素20GML的稀释液，用石油醚定容至50ML，此时标准B一胡萝卜素溶液浓度梯度分别为021XGML、041XGML、06LXGML、08GML、12PGML、141XGML，然后以石油醚为空白对照，采用分光光度计测定450NM波长处每个标准溶液的吸光值，以标准品浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线图1。所得回归方程为Y06643X003813，回归系数RO9959。EO寸果B一胡萝素标准品浓厦GML图1D一胡萝卜素标准曲线FLGL1STANDARDCHIVEOFIFCAROTENE1422B一胡萝B素含量的测定收集发酵液中的菌体，经真空干燥后得干菌体，采用研磨法粉碎细胞，然后过6080目筛。精确称取一定量菌丝体粉末，加入1LVV丙酮一石油醚混合液少许，研磨萃取，然后加入石油醚继续萃取至菌体基本无色为止，用滤纸过滤萃取后的上清液，收集滤液并记录萃取液体积。然后用石油醚将萃取液稀释至适当倍数后于450NM处测光密度值，用回归方程计算出B一胡萝B素含量其颜色深度与13一胡萝B素的含量成线性关系。15试验设计本研究采用单因素轮换法属于爬山实验法嘲优化B一胡萝卜素合成的发酵条件。该方法是每次实验只变化一个因素的水平，其他因素的水平保持不变，分别确定每个因素的最优水平，最终确定全部因素的最佳试验方案。151正负菌株生长曲线的测定将活化后的正负菌株制成孢子悬液接人到种子培养基中，种子培养基的装液量50ML250ML三角瓶，在培养温度28，摇床转速180RPRN条件下分别振荡培养5H、10H、15H、20H、25H、30H、35H、40H、45H、48H，观察菌体生长情况，并在相应时间取出发酵液，测定生物量。152发酵时间对P一胡萝卜素产量及发酵生物量的影响按10的接种量接入经扩大培养正负菌种，其中正菌种子液的培养时间12HN15H，负菌种子液的培养时间25H30H，正负菌种子液的混合比例11，发酵液初始PH60，在温度28，发酵培养基装液量38食品与发酵科技2010年第4期50ML250ML三角瓶，摇床转速180RMIN的条件下振荡培养160H，每隔24H测定生物量及B一胡萝卜素产量。153种子液接种量对B一胡萝B素产量及发酵生物量的影响分别按3、5、10、15、20、25、30的接种量接入经扩大培养的正负菌种，其中正菌种子液的培养时间12H15H，负菌种子液的培养时间25H30H，正负菌种子液的混合比例为11，发酵液初始PH60，在培养温度28，发酵培养基装液量50ML250ML三角瓶，摇床转速180RMIN的条件下振荡培养120H后，测定生物量及B一胡萝卜素产量。154正负菌种子液混合比例对B一胡萝卜素产量及发酵生物量的影响按2O的接种量接入经扩大培养的正负菌种，其中正菌种子液的培养时间12H15H，负菌种子液的培养时间25H30H，正负菌种子液的混合比例分别为91、41、73、32、L1、23、37、14、19、120，发酵液初始PH为60，在培养温度28，装液量50ML250ML三角瓶，摇床转速为180RMIN的条件下振荡培养120H后，测定生物量及B一胡萝卜素产量。155发酵初始PH值对B一胡萝卜素产量及发酵生物量的影响按20的接种量接人经扩大培养的正负菌种，其中正菌种子液的培养时间12H15H，负菌种子液的培养时间25H30H，正负菌种子液的混合比例为23，发酵初始PH分别为50、55、60、65、70、75、80，在培养温度28，装液量50ML250ML三角瓶，摇床转速为180RMIN的条件下振荡培养120H后，测定生物量及B一胡萝卜素产量。156发酵温度对P一胡萝卜素产量及发酵生物量影响按20的接种量接人经扩大培养的正负菌种，其中正菌种子液的培养时间12H15H，负菌种子液的培养时间25H30H，正负菌种子液的混合比例为23，发酵初始PH为65，培养温度分别为25、28、30，33、35，在装液量50ML250ML三角瓶，摇床转速为180RMIN的条件下振荡培养120H后，测定生物量及B一胡萝B素产量。157摇瓶装液量对B一胡萝B素产量及发酵生物量影响按20的接种量接人经扩大培养的正负菌种，其中正菌种子液的培养时间12H15H，负菌种子液的培养时间25H30H，正负菌种子液的混合比例为23，发酵初始PH分别为65，培养温度为28，装液量分别为30ML、50ML、70ML、90ML、110ML250ML三角瓶，在摇床转速180RRAIN的条件下振荡培养12OH后，测定生物量及P一胡萝B素产量。158摇床转速对B一胡萝B素产量及发酵生物量影响按20的接种量接入经扩大培养的正负菌种，其中正菌种子液的培养时间为12H15H，负菌种子液的培养时问为25H30H，正负菌种子液的混合比例为23，发酵初始PH分别为65，培养温度为28，装液量为50M250ML三角瓶，在摇床转速为150RPM、180RRAIN、200RMIN、220RRAIN、250RMIN、270RMIN条件下振荡培养120H后，测定生物量及B一胡萝B素产量。2结果与讨论21正负菌株生长曲线的测定JE0O恻H_垃悃U1U2U3U4U3U6U培养时间H图2正、负菌株生长曲线FIG2GROWTHCURVEOFSTRAINTOSTRAIN一从图2可以看出，正负菌的生长趋势大致相似，但培养过程中正菌生长速度明显要快于负菌。正菌在12H左右就开始进入快速生长期，而负菌在25H开始进入快速生长期，两者在35H40H进入稳定期，45H以后进入衰亡期。从菌体的生长情况也可以看出，正菌培养10H后种子液变浑浊，出现大量颗粒状的微小菌体，之后随着培养时间延长，颗粒状菌体逐渐变大，随后开始呈球状，而后球状菌体开始成团，并逐渐增大。而负菌延迟期较长，培养20H后菌体才开始变得较为浑浊，形成颗粒状的微小菌体，同时发酵液粘度增大，并出现长丝状培养物，菌体有挂壁现象，围绕三角瓶内出现一圈白色菌体。根据实验现象及结果，我们选择对数生长期后期作为种子培养的最佳时间，即正菌种子液培养12H15H，负菌种子液25H30H。22发酵时间对P一胡萝卜素产量及发酵生物量的影响从图3可以看出，种子液接人发酵培养基后，迅速进入了快速生长期；随着发酵时间的延长，约4845352515O第46卷遐第158明潘鹏等三孢布拉霉菌产P胡萝卜素发酵条件的研究390三稠懈蹯发酵时【司H图3发酵时间对一胡萝卜素产量及发酵生物量的影响FIG3EFFECTSOFFERMENTATIONTIMEON13CAROTENEANDBIOMASS小时后菌体干重接近40GL，大约120H时，生物量达到最大；随着发酵时间继续延长，生物量开始下降。分析认为是种子培养液处于对数生长期，活力旺盛，缩短了接种后的延滞期，接种后迅速进入快速生长期，并在120H左右生物量达到最大，随后，因为培养基营养成分消耗殆尽，菌丝开始自溶，生物量下降，应该在菌体自溶前结束发酵。而B一胡萝卜素产量随发酵时间的变化是一个缓慢而逐渐增加的过程，在发酵初期，产物生成速度慢，大约在48H，合成速度增快，在发酵48H一120H时间，是大量合成期，在120H产量达到最大值。当进人平衡期后，B一胡萝卜素产量不再显著增加而是保持恒定。23种子液接种量对B一胡萝卜素产量及发酵生物量的影响菌体干重GL01L田ILH_橱正负菌种子液接种量3E一删糕蹯I。D_图4种子液接种量对P一胡萝1素产量及发酵生物量的影响FIG4EFFECTSOFINOCULUMSIZEORCAROTENEANDBIOMASS从图4可以看出，随着接种量的增加，发酵液中13一胡萝H素的含量也在逐渐增加，当接种量达到20时，T3一胡萝卜素的含量达到最大，当接种量继续增大时，会使菌体生长过快，发酵液黏度增加，溶解氧不足，菌体提前自溶，造成菌体生物量及P一胡萝卜素产量均下降，因此我们选择20作为出发菌株发酵的最合适接种量。24正负菌种子液混合比例对B一胡萝卜素产量及发酵生物量的影响表1正负菌种子液混合比例对B一胡萝I素产量及发酵生物量的影响TAB1EFFECTSOFRATIOOFBLAKESLEATRISPORATOBLAKESLEATRISPORA一ON3CAROTENEANDBIOMASS从表1可以看出，随着接入的种子液中负菌比例的增加，合成13一胡萝卜素的量也随之增加；当接种比例达到23时，13一胡萝卜素的含量达到了最高；随着负菌比例继续增加，13一胡萝卜素的产量却下降了。分析认为，由于13一胡萝卜素主要由负菌产生的，随着负菌比例的增多，发酵形成的B一胡萝卜素也随之增多。当正菌与负菌比例达到23时，P一胡萝卜素发酵产量最高，认为此时培养基得到了充分利用；随着负菌比例继续增加，发酵液中正菌量过少，产生三孢酸太少，影响了产物的合成。25发酵初始PH值对13一胡萝卜紊产量及发酵生物量的影响8O7060H54OO30悃2O1O04O35151O5蹯0CD_I发酵初始PH图5发酵初始PH值对P一胡萝H素产量及发酵生物量的影响FIG5EFFECTSOFORIGINALPHONBCAROTENEANDBIOMASS在各种关于三孢布拉氏发酵产13一胡萝卜素最适PH的研究中，最适PH的差别很大。SEONWONKIM等发现，强碱性作用对B一胡萝H素生产有利，PH10是发酵生产的最佳PH；在FMANTZOURIDOU等的研究中，认为最佳的PH在78之间，另有一些实食品与发酵科技2010年苇4期验报道最佳PH位于6070之间；秦敬改认为发酵起始最佳的PH是6367之间，而当PH偏碱性后，菌体生产13一胡萝卜素的能力开始下降嘲。单志萍等研究发现三孢布拉霉在发酵过程中能分泌胞外脂肪酶，因而能分解利用培养基中的植物油，并讨论了发酵液PH对酶活性的影响，结果认为在接近中性或微碱性的PH条件下，最有利于三孢布拉霉胞外脂肪酶的活性川。从图5可以看出，发酵初始最佳PH值在6070之间，超过这一范围，菌体合成13一胡萝卜素的能力开始下降。分析认为起始PH为65时，最能促进脂肪酶的活力，有利于菌体分解利用培养基中的植物油，因而更有利于13一胡萝卜素的合成。26发酵温度对13一胡萝卜素产量及发酵生物量影响0H_圈0E删L懈ID发酵温度图6发酵温度对胡萝卜素产量及发酵生物量影响FIG6EFFECTSOFTEMPERATUREON13CAROTENEANDBIOMASS从图6可以发现，在28时，细胞合成B一胡萝卜素的能力达到最大。分析认为，因为培养基粘度大，温度过高菌丝生长过于旺盛，造成培养液中供氧不足，影响发酵产量，同时，由于温度高，造成菌体过早自溶，影响发酵的最终生物量。根据实验结果，我们认为28是发酵的最适温度。27摇瓶装液量对13一胡萝卜素产量及发酵生物量影响从图7曲线可以看出，装液量在50ML时，B一胡萝卜素发酵水平最高。分析原因认为，在高转速下，当装液量小于50ML时，菌丝体发生挂壁现象，同时水分蒸发量较大。随着装液量增大，水分损失相对减少，但摇瓶内溶氧量也逐渐减少。在50ML时，两种作用影响对发酵最佳，B一胡萝卜素的合成量最大。因此，选择装液量为50ML250ML三角瓶。28摇床转速对B一胡萝卜素产量及发酵生物量影响从图8曲线可以看出，摇床转速为200DMIN时，B一胡萝卜素发酵水平最高。分析原因认为，当摇床转速小于200RMIN时，摇瓶内通气量不足，不利于菌体的生长和代谢产物的合成。当摇床转速超过200DMIN01I田IIH躅103O5O709011O装液量ML0E粕I。CL图7摇瓶装液量