酶促法制备茶黄素工艺初步研究 毕业论文

毕业论文（设计）题目酶促法制备茶黄素工艺初步研究指导老师专业班级生物技术及应用0701姓名学号2010年5月30日I摘要研究利用绿茶鲜叶浆及梨汁为酶源，采用体外氧化中酶促法来制备茶黄素。方法采摘新鲜茶叶，阴凉干燥处摊放12H，18以下冰柜冷冻6H，组织捣碎机粉碎匀浆，添加新鲜梨汁，并柠檬酸调PH值至47；茶多酚40G，加入乙酸乙酯溶解。将上述两部分液体，迅速混匀，加入发酵罐中，温度25，PH值47，通入空气流量06L/MIN，高速搅拌，发酵60MIN。再进一步分离两相，制备得到茶黄素。结论经过液相检测，本文酶促法制备茶黄素工艺可以制得茶黄素，茶黄素主要在乙酸乙酯相中，含量686。关键词茶黄素；茶多酚；体外氧化；酶源；发酵A1A0A2A3A4A5A6A0A7A8A10A11A9A13II目录引言11材料211实验材料212实验试G2070213实验G1214G313222方法221实验方法3211酶源制备3212G5225G10301处G107143213发酵G708酶促G2465G5224G7093214茶黄素G14807G24743215茶黄素G13443化422检测方法43结G7536G994分G75245G22G17G20检测结G75365G22G17G20G17G20茶黄素G4557G10043G2709G3282G16901G24G22G17G20G17G21酶促发酵茶黄素G8999度检测G24G23G5647结G994G16764论G25G2454G13783文G104988A12A14A15A16A17A18A19A14A20A21A22A23A24A25A261A27引言茶G7171源G1122G6117G3281，G17953G5079G1002G11040G11352G7092G18214G12946G20290料G1055一，G20290茶G4557G1166体G7389G1457G1593G1328用，G457本G14621G13446G11458G458中G4613G7389茶叶G14659用G2163G14033G11352G16772G17745。G10628G1207G12197G4410研究G1075G15932G7138，茶叶G7171G1593G5259G20290G2709，含G7389茶多酚G451G2666G2869G11909G451茶多G12970G451茶G8700酸G451茶G14406素G12573G10995G10301G8975G5627G10301G17148，G1867G7389G6245G14752G451G6251G11161G8614G451G19462G11296G6251G11296G12573多G12193G1457G1593G2163G140331。茶G14406素G4658G8712溶G5627G14406素，分为茶黄素G451茶G13430素G2656茶G16100素G989G12879。G1866中茶G14406素中G2265含G11352茶黄素THEAFLAVINS,TFS，G10628G1207研究G15932G7138，茶黄素G993G1177G7171G13430茶G11352G18337要G2709G17148G6116分G1055一，G13792G1000G1867G7389G6245G14752G451G6251G11161G8614G451G6251氧化G451G6251G15940G13781G451G6251G12373G2476G451G6251G11296G19462G11296G451G19489G15892G12970G451G19489G15892G14038G451G19462G8847G5527G15892G12661G11154G11161G12573G2163G6940，并G1000G17836G4557G14418G9375G11161G8614G17882G17728G5417酶G2656多G12193DNAG13870合酶G7389特异G5627G6245制G1328用。自ROBERTSEAH1957年发G10628茶黄素以来，茶黄素一直G7171茶叶研究G11352热点。茶黄素G738912G12193组分，G1866中茶黄素TF，茶黄素3没食子酸酯TF2A，茶黄素3没食子酸酯TF2BG2656茶黄素3,3双没食子酸酯TFDG，G71714G12193最主要G11352茶黄素。茶黄素G11352独特G10995G10714G8975G5627使G1866G10995产G2656研究受到G3281内外G11352广泛关注，随着G1166们G4557茶黄素结构G2656G5627G17148G11352认识越来越深入，制G2474茶黄素G11352方法研究G1075G2474得了很大G11352进展，但由G1122G13430茶茶汤中茶黄素含量低02202，使茶黄素G11352利用受到很大限制，因此，G1166们G993断探索新G11352茶黄素制备途径，G13792儿茶素体外模拟氧化，被G1328为一条研究茶黄素形G6116机G10714及提高G1866制率行G1055G7389G6940G11352方法。本文以新鲜茶叶为原料，并利用梨中所含G11352多酚氧化酶，酶促法体外氧化3制备茶黄素，着力寻求酶促法制备茶黄素G11352方法，G7171为更高G6940G451更绿G14406G451更节G14033G11352途径。G11458前市场G7171直接购买酶源来发酵G10995产，G6116本提高，综合利用资源率G19489低。因此研究利用绿茶鲜叶汁做为酶源，适宜G2454数条件下，添加到干茶提G2474液中，发酵G10995产茶黄素4。如该项技术获得G6116G2163，将意义G18337大G451前景广泛。A12A14A15A16A17A18A19A14A20A21A22A23A24A25A262A271材料11实验材料新鲜茶叶G7081芽23叶，产G1122浙江杭州G709；梨G708购G1122华联超市G709；茶多酚G708浙江绍兴东灵G1457G1593食G2709G7389限公司提供，TP98G70912实验试剂柠檬酸，乙酸乙酯，冰醋酸分G7524G13443食用乙醇乙腈G14406G16901G13443蒸馏G8712由G13443G8712G3132ULTRAPUREPLUS制得AB8大孔吸附树G1403813实验仪器组织捣碎机G708878B上海正慧工贸G7389限公司G709电子天平G708JY10001上海华岩G1214G3132公司G709分G7524天平G708AR2140上海力衡G1214G3132G1214G15932G7389限公司G709低温箱G708HF135U40G6116都市G10995G12197G1214G3132G7389限责任公司G709冷冻离G5527机G708SIGMA3K15上海基汇G10995G10301G12197技G7389限公司G709发酵罐G708SFV10L职G1006技术G4410G19510G10995G10301实验G4472G4462做G709超G3780G8886发G10995G1214G708KQ500DB上海G7982G4462分G7524G1214G3132G7389限公司G709G7071G17728蒸发G1214G708RE52AA上海G1134G14647G10995化G1214G3132G2390G709冷冻干燥G1214G708ALPHA12LDG8839G2347G1816G5363G1214G3132G16786备G7389限公司G709高G6940液相G708DIONEXG6152G4445中G3281G7389限公司G7092方法利用绿茶鲜叶浆及梨汁为酶源，采用体外氧化中酶促法来制备茶黄素G11352G6984A12A14A15A16A17A18A19A14A20A21A22A23A24A25A263A27体G6817G1328G17347G13459流G12255如下G328221所G12046。G3282G21G17G20酶促法制备茶黄素G6817G1328流G12255G328221制备方法211酶源制备58酶源G2265G6336来自茶叶G11352多酚氧化酶G2656来自梨G11352多酚氧化酶，酶源制备如下新鲜茶叶1000G，G3546放G13634阴凉干燥处12H，在18以下低温箱G18336冷冻6H，G2474G1998冰冻G11352茶鲜叶，用组织捣碎机将G1866粉碎匀浆，所得茶浆液冷G15267备用；提供G17287G3827G11352梨，采用G13449G2011方G5347，要捣碎G1817分，匀G17148并冷冻离G5527，G2474上G4630G9177液，所得梨汁冷G15267备用；将G6365上述方法制备所得G11352茶浆液中添加梨汁至2000ML，并用柠檬酸溶液调节此混合液PH值至47，酶源制备G4448G6116。212底物处理G12228G2474茶多酚40G放入大G9915G7491中，G9994G2530再加入乙酸乙酯溶解至1000ML，G5465用。213发酵（酶促反应）9将上述酶源G2656G5225G10301，迅速混匀，G16025入10L发酵罐体中，G6523制温度25，PH值47G11352条件下，通入空气流量为06L/MIN，高速搅拌，G6357G13505发酵60MIN。214茶黄素萃取发酵结G7475G2530，G1584G8502通入空气，G12239G1998发酵液，G17728入分液G9443G7019中，G19757G13634分G4630，A28A29A30A31A32A33A34A35A36A37A38A39A40A41A32A33A42A43A44A45A44A46A47A48A37A44A45A44A46A49A50A51A30A52A3225A53A54PH47A5460MINA37A55A56A32A57A49A58A59A37A60A49A61A58A59A32AB8A37A62A63A64A65A48A49A66A67A68A69A70A71A72A73A74A69A75A76A32A77A78A37A794A80G12239G1998乙酸乙酯相备用；G8712相G2029迅速G2331温至80，G1457G635730MIN，G6289G9400得G9400液，G9400G9207加入2000MLG8844G8712超G3780G8886G70880G709G8712G9032G9036提15MIN，G6289G9400，合并G9400液，70G11507空G8999G13565至原体G12227G113521/3，G12573G5465进一步处G10714。215茶黄素纯化乙酸乙酯相低温G11507空G8999G13565，G6393发G1998G2447乙酸乙酯，加入70乙醇溶解G11507空G8999G13565，G17226G17220G2447乙酸乙酯，G8999G13565液冷冻干燥，干燥G7691G2709进行HPLC检测。G8712相G8999G13565液，AB8树G14038分离。G1820用2G5214G4630G11352体G12227蒸馏G8712G19512G2447多G12970及G7446G10301；再用25乙醇2G1505G5214G4630体G12227G8939G14085G6922G19610G12544一馏分；最G2530用70乙醇15G1505G5214G4630体G12227G8939G14085G6922G19610G12544G1120馏分。G2520馏分70G11507空G8999G13565，G8999G13565液G11507空干燥，干燥G7691G2709进行HPLC检测。22检测方法1G709G2345体G7643G7691G18209制分G2047G1946G11842G12228G2474TF124000MGG451TF2A32500MGG451TF2B13500MGG451TFDG46000MG，G1393G8437加入10MLG4493量G10954中，分G2047G18209G6116G8999度为TF10240MG/MLG451TF2A0325MG/MLG451TF2B0135MG/MLG451TFDG0460MG/MLG11352溶液为G7643G1946G2709溶液。2G709G7691液G18209制G1946G11842G12228G2474G19668要检测G11352G10301G，用蒸馏G8712G4462溶至25ML，G18209制G61162MG/MLG11352G7691液，溶液过G5506孔G9400G14192，G12573G5465进G19036。3G709HPLC检测方法G14406G16901G7621G4719G8953VPODSG7085UM，250MMG10446MMG709；流G2172相A相05冰醋酸3乙腈G8712B相05冰醋酸30乙腈G8712；G7621温28；流速1ML/MIN；检测G8886G19283280NM；检测G7114G1940060MIN。液相G7811度G8939G14085条件TIME0B0TIME5001B0TIME45B100TIME60B0TIME50B100TIME0STOP4G709茶黄素含量G16757G12651100A81A82A83A81A84A85A86A87A88A84A85A89A86A87A88A90G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16公G5347G708G21G17G20G709A68A69A70A71A72A73A74A69A75A76A32A77A78A37A795A803结果与分析31检测结果311茶黄素的对照品图谱G6365G1004322检测方法，分G7524检测茶黄素G2345体G4557G10043G2709，检测HPLCG3282G16901G328231所G12046G3282G22G17G20茶黄素G23G12193G2345体G4557G10043G2709G43G51G47G38检测G3282G16901由G3282G22G17G20G993G19602发G10628，G23G12193茶黄素G2345体G4557G10043G2709G1998G4804G7114G19400G1393G8437为30005G45142697G45153102G45157027MIN，G16826G13466G11352G7691G2709G8999度G994G4557G5224G1998G4804G12227分G19766G12227如G1593231所G12046。表31茶黄素单体对照品进样浓度及对应峰面积G2345体G1457G11053G7114G19400G53G55G4804G19766G12227G68G85G72G68进G7691G8999度G80G/G80LTF1G220G1700G24G230G2400G24G200G17G21G230TF2AG23G21G17G2597G23G23G24G21G24G2380G17G22G21G24TF2BG24G22G17G200G21G2007G20G20G2000G17G20G22G24TFDGG247G170G217G258G237G22700G17G23G250312酶促发酵茶黄素浓度检测结果将G6365G10043G21G17G20G6817G1328方法制备茶黄素溶液冷冻干燥，获得茶黄素粉末G7691G2709G6365G1004322G6817G1328方法进行HPLC检测，检测茶黄素G8999度含量如G1593232。A68A69A70A71A72A73A74A69A75A76A32A77A78A37A796A80表32酶促法制备所得茶黄素样品HPLC检测结果G7691G2709检测G10301G17148G1457G11053G7114G19400G7691G2709G4804G19766G12227G4557G10043G2709G4804G19766G12227G4557G10043G2709G8999度G7691G2709G8999度茶黄素G5647G8999度G8712相25G8939G14085TF130532080094050051024000123300387TF2A432117586744525480325001284TF2B53586773810711100135000854TFDG57787402868473700460000497G8712相70G8939G14085TF130746532884050051024000387100804TF2A436427165544525480325001983TF2B541711031210711100135001390TFDG585011835568473700460000795乙酸乙酯相TF130388689024050051024000514901372TF2A430653251144525480325003887TF2B534120898710711100135002634TFDG576430575968473700460002054结合G1593232检测结G7536，通过公G5347G70821G709G16757G12651可得茶黄素G11352含量分G2047G717125G8939G14085，194；70G8939G14085，202；乙酸乙酯相，686。由此可以发G10628茶黄素主要G19610中在乙酸乙酯相，这G1075G7171下一步想着G18337研究G11352关键环节。4总结与讨论通过酶促法制备茶黄素工艺进行试验，制得了茶黄素，说G7138酶促法制备茶黄素这一工艺G7171可行G11352。检测结G7536G15932G7138制备得到G11352茶黄素主要G19610中乙酸乙酯相中，含量可达686。G6984套酶促法制备茶黄素G11352工艺虽G9994只得了茶黄素，但G7171相G4557来说，G1866含量G17836G7171较低，G17836G19668继G13505研究调G6984G7389关G2454数，提高茶多酚向茶黄素G11352G17728G2476率，这G4613G7389G5465进一步G11352研究下G2447。G10628G1207化G4410G451G10995G10301G4410G2656医G4410实验提高技术G2656深入研究发G10628G993同G11352茶黄素G1867G7389G993同G11352化G4410结构，鉴G1122绿茶中儿茶素G12879化合G10301G11352许多G10995G10301G8975G5627G10301G17148主要源G1122它们酚羟基结构G11352G6251氧化G8975G5627；从化G4410结构上看，茶黄素G12879G10301G17148含G7389较多G11352酚羟基团，A68A69A70A71A72A73A74A69A75A76A32A77A78A37A797A80因此，茶黄素G12879G10301G17148相比儿茶素G12879可G14033G7389更强G11352G10995G10301G8975G562710。茶黄素制备方法G11458前G7389化G4410氧化G2656酶促氧化两G12193，前者G993符合G10995态G1457护G11352要求，副产G2709复G7446，产G2709G13443度较低，G13792G2530者解决了上述问题并G14033提高茶黄素G11352得率，因此今G2530酶促氧化法G7171制备茶黄素G11352G10714想方法。虽G9994本文中以绿茶鲜叶浆及梨汁做为酶源，采用体外氧化中酶促法来制备茶黄素G11352方法，制得G11352茶黄素G11352量G993大，但G7171从G19283久来看酶促法制备茶黄素今G2530必将G2656G4462向固G4462化酶技术G12573G6116为研究热点，另外，利用G5506G10995G10301G4462向发酵产G10995茶黄素G1075将G7171G10995产茶黄素G11352趋势。茶黄素G11352G13443化以SEPHADEXLH20G7621G4630G7524法G2656高