关于大棚草莓光照的检测控制系统

关于大棚草莓光照的检测控制系统1、相关定义11、超滤膜的定义和分类一般定义为两个不同相之间的一个不连续的区间,通常也称为选择性屏障9,并且能以特定的形式限制和传递各种不同的化学物质。目前工业应用的膜多为固态膜主要以聚合物高分子膜为主。膜的分类方法10可以从不同的角度对其进行分类,可以按照膜的形状、膜的结构、膜的材料、膜的功能、膜的作用机理、膜的制备方法、膜的用途、膜的来源分类等。一般以膜的形态作为分类标准可以将膜分为气相态,液相态,固相态按照膜的来源又可以将其分为合成膜与生物膜。聚合物膜一般按其结构与作用特点分为均质膜或对称膜,非对称膜和复合膜。按照结构特征可分为对称膜和非对称膜两类。一般来讲,由相转化法制备的多为非对称膜,其膜截面结构是非对称性的,它是由极薄的、起分离作用的致2上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述密层即具有一定孔径的细孔表皮层和起机械支撑作用的多孔支撑层组成。其中皮层为活性层,其孔径和性质决定膜的分离特性,而厚度主要决定传质速率。支撑层只起支撑作用,对分离特性和传质速率影响很小。非对称膜除具有高透过速率外,还有一重要特点,即被截留的物质大都聚集在其表面,易于清除。简单的说就是在借助一定的推动力调节下,膜可以实现在两相之间进行物质间的传递11。12、基本概念示的三维物体所采用的模型,它用几何体表面密集采样的离散点来隐式地表示几何体,主要涉及如下基本概念。点元SURFEL一个带形状因子与光照属性的0维元组,用来局部近似物体表面1。点元映射到屏幕后在图像空间内重构物体表面。点云密集三维点集,或称为密集离散点集。基于点的造型基于点云的表面表示、处理及编辑。基于点的绘制计算机绘制基于点表示实体的技术。13、隐马尔可夫模型的定义HMM是基于MARKOV链的一种拓展。在实际应用中,观测的对象并不一定和状态一一对应,不能简单地用MARKOV链来描述。因此,在实际问题中,用双重随机过程来描述。其中一个随机过程,即MARKOV链,描述状态转移情况,另一个随机过程描述状态与观测值间的关系。可见,观测者不能直接看到状态,状态只能通过另一随机过程去估计,所以称之为HMM2224。可以用如下的例子来具体描述。假设有N个水缸,每个水缸中装有许多各种不同颜色的小球,通过一组概率分布来对小球的颜色进行描述。实验过程如下根据球初始的概率分布,随机选取一个水缸开始实验。彩球的颜色在水缸中有一个初始分布概率,然后随机选取一个颜色为O1的小球作好记录,再放回去。再由水缸转移概率分布随机地选取一个水缸进行反复实验,直到得到一个完整的观测序列O1,O2,为止。可见在这个实验中,直接观测不到水缸间的概率转移,水缸和从中选择的小球的颜色并不相对应,而是由水缸的转移概率所决定的。可以用如下的HMM来描述8表21HMM的实例描述一个HMM的参数描述如下N模型中MARKOV链的状态个数。N个状态集表示为SS1,S2,SN,T时刻状态表示为QT,则QTS1,S2,SN。M每个状态对应的可能的观测值数目。M个观测值表示为VV1,V2,VM,T时刻的观测值表示为OT,则OTV。初始状态概率矢量,表示初始状态Q1为状态SI的概率1,2,N,其中IPQ1SI,1INA状态转移概率矩阵,AAIJ,其中AIJPQTSJQT1SI,1I,JN且满足0AIJ1,NA1。J1IJB观测值概率矩阵,BBJKNM,其中BJKPOTVKQTJ,1JN,1KM这样,HMM可表示为N,M,A,B,或者简写为,A,B。其中,A表示一个MARKOV链,模型的输出状态序列,用B来表示HMM的观测值序列,如图21所示。9MARKOV链随机过程,A状态序列B观测值序列图21HMM组成模型图14、寡糖的定义、结构、性质一般将210个单糖通过糖苷键连接起来形成直链或支链的一类糖11个单糖以上的结合物则称为大糖类,100200个单糖结合物称为多糖类称为寡糖又称低聚糖、寡聚糖2325。许多特定结构的寡糖被证明具有诱导植物抗性的作用。对具有诱导抗性作用的葡聚寡糖结构分析表明,其最小活性寡糖单位是由7个葡糖残基组成的葡聚糖苷,在一个连接的葡聚糖残基主链上带有两个葡糖残基侧链,而且分支的残基之间有一段主链残基分隔。这对于大豆植保素的积累是必需的,所以诱抗活性寡糖对其结构有特定的要求26,27。目前常见的、已确定结构的寡糖类激发子有葡聚六糖和葡聚七糖、寡聚半乳糖醛酸及几丁质寡糖等28。其中葡聚六糖和葡聚七糖的结构如图1、图2293图1葡聚六糖FIGUE1GLUCOHEXAOSE图2葡聚七糖FIGUE2HEPTAGLUCOSE寡糖具有低热、水溶性好、稳定、安全无毒、对人畜无害、能迅速降解、无残留、不污染环境等良好的理化特性,以及具有调整肠道菌群平衡和提高免疫力等保健功能和促生长作用30,31,因此对寡糖的研究成为热点。15、真核启动子的概念,结构及分类11启动子的概念启动子是位于基因5端上游的一段DNA序列,它可以结合各种转录因子,并与RNA聚合酶和各种蛋白形成转录起始复合体,确保转录精确而有效地起始。RNA聚合酶启动转录过程必须定位并结合在启动子上,因此启动子是基因表达调控的重要顺式作用元件,它与RNA聚合酶及其他蛋白辅助因子等反式元件的相互作用是启动子调控模式的实质。真核生物中,有三种RNA聚合酶,并因此将这三种RNA聚合酶作用的启动子分为三类类别I启动子、类别H启动子、类别M启动子。类别N启动子指导MRNA的转录,对基因的调控表达具有更为重要的意义。12真核启动子的结构模型真核生物类别N启动子可以分为两部分结构核心启动子区和上游启动子元件。核心启动子区包括转录起始位点和护介订A盒,二者是启动子必需的盯日订A盒HOGNESS盒是转录起点上游的一段富含AT碱基对的保守序列,工入RA盒有7对保守的碱基序列5毛灯认A广1,AA汀一3,提供RNA聚合酶N的结合位置,在很多情况下也会影响到基因的转录水平。在哺乳动物、昆虫以及高山东大学硕士学位论文等植物的细胞基因组DNA中,T戌RA盒一般位于帽子位点上游20一30BP处,而在低等真核生物如酿酒酵母中,刀订A盒位于帽子位点上游80一100BP处。许多真核基因启动子在距转录起始位点大约80一220BP的上游序列处都存在着上游元件,它们可以极大地提高基础启动子的转录活性。较为重要的上游元件有两种一种是一般上游元件,如CCAAT盒和GC盒,它们在真核基因启动子中是普遍存在的另一类上游元件可能是启动子特有的,称为启动子特有的上游元件,或者仅局限于某种基因家族特有,如B一珠蛋白基因家族特有的一100盒。13启动子的分类启动子的分类可以依据不同的标准进行划分。按启动子来源可分为原核启动子和真核启动子,如大肠杆菌LAC启动子为原核启动子,水稻配了动基因启动子ACTL为真核启动子从转录模式上,启动子又可以分为组成型启动子和诱导型启动子,如花椰菜花叶病毒CAMV35S是组成型启动子,番茄ES基因启动子是受乙烯诱导的特异启动子。上述分类方法基本反映了不同启动子各自的特点,但在很多情况下,一个启动子往往兼有多种类型启动子的特性。植物基因工程常用的启动子按其作用方式及功能可分为三类组成型、组织特异型和诱导型。迄今为止,在高等植物转基因研究中使用较多的是组成型的启动子,比如花椰菜花叶病毒CAMV的355启动子。由于目前生物安全和植物发育生长的需要,组织特异型和诱导型启动子应用越来越广泛。诱导型启动子可以在特定条件下诱导基因的转录,使植物在不同信号的刺激下特定诱导某些基因表达,使植物能够对这些信号产生响应,对有利环境产生趋向,从而可以稳定的生长。而组织特异型启动子能控制基因在植物特定的组织器官表达,避免目的基因在受体细胞内过量表达造成的过度能耗及对转基因植物细胞生长的影响。因此,组织特异型启动子在植物转基因研究中对于建立一个高效、实用的表达系统具有重要的理论和实践意义。131组成型启动子组成型启动子在所有细胞中都启动基因的表达,基因表达的产物具有稳定性和持续性,基因的表达量不随植物的生长发育而发生明显的变化。对组成型启动子研究发现,在其转录起始位点上游几百个核昔酸处,存在共有序列TGACTG山东大学硕士学位论文。目前广泛使用的组成型启动子主要有花椰菜花叶病毒CAMV35S启动子、水稻ACTIN基因启动子AED、水稻UBIQUNTLN基因启动子、土壤根癌杆菌TI质粒的胭脂碱合成酶基因NOS启动子和章鱼碱合成酶基因OES启动子。花椰菜花叶病毒355启动子是目前广泛使用的一个启动子,特别是在双子叶植物上的应用己得到人们的认可,具有启动活性强、表达量高的特点。但在单子叶植物中调控表能力较差2,3,。经研究证明,水稻ACTL启动子也是一个高效表达的组成型启动子,这主要是由于ACTIN基因的表达产物是植物细胞骨架的基本组成成分,故其启动子在所有组织中都具有活性51。水稻UBIQUNTI。基因启动子是近年来逐渐被人们重视的一个启动子,转录活性较高,目前已在植物转基因中尤其在单子叶植物中得到了广泛应用L6。112诱导型启动子植物在生长发育过程中受外界环境的影响可使一些基因的表达发生改变,而在物理或化学信号的刺激下调节基因转录水平的启动子即为诱导型启动子。诱导型启动子一般具有以下共同特点启动子的活化受到物理或化学信号的诱导启动子序列中具有增强子、沉默子或类似功能的序列结构受特异性诱导的序列都有明显的专一性一部分该类型的启动子同时具有组织特异性表达的特点。根据诱导因素,诱导型启动子可被分为激素效应启动子、环境效应启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等LV。1121环境响应启动子植物在长期的进化过程中已具备了一定的环境适应能力,对一定范围内的光、温、水等环境因素产生响应,此时环境响应启动子对基因的表达起关键的作用。这一类启动子主要包括光效应启动子、温度效应启动子和水效应启动子181。13211光效应启动子LAMPPA等1985研究小麦CAB基因时发现,在转基因烟草中CAB基因表现出了光调控和器官特异性91。王念捷等1996将水稻R4CL一1基因与GUS基因融合导入烟草基因组中,紫外光照射下R4CL一I启动子能在植物发育过程中启山东大学硕士学位论文动GUS基因的组织特异性表达0。AWINDERKS等1999发现甘蓝型油菜脂类转移蛋白LTP启动子于光诱导下,可在转基因拟南芥的侧根、花药、柱头和维管组织中启动GUS基因的表达,其光调节启动子中存在的顺式作用元件有GT1位点、I一盒、G一盒和ATRICH序列川。水稻中的三个八番茄红素合成酶基因伪尸害YI,乙坛尸害力和山尸害扮的启动子,伪尸害YI,坛尸害Y2的启动子受光诱导,而山尸害”的启动子则不表现光诱导性,但三者都受到ABA的诱导汇2,31。11212温度效应启动子MARIAAE等1996从向日葵中分离了编码小热激蛋白SHSPSHALLSPLS6GZ和HALLSP177G4的基因,发现HAHSPISG2基因只具有热诱导活性,而HAHSPI77G4基因对高温42、脱落酸和水分胁迫都有应答口4。通过与番茄中的两个热胁迫转录因子HSFSLPHS认1和LPHSFAZ的序列进行比较发现,高温胁迫响应元件的一段特异序列对于月扩启动子的选择度是非常重要的I5。1122真菌诱导表达启动子高等植物在进化过程中,对病原菌的侵染逐渐形成了严密的抗病防御系统,病原菌侵染可诱导许多基因的表达。植物受病原菌侵染后,几丁质酶基因在植物的抗病防御系统起着重要作用,在烟草悬浮培养细胞中,类型L几丁质酶的表达受到真菌的强烈诱导,转录起始位点上游一788一345区域是诱导所必需的L6。马铃薯尸石A召和尸矽C基因编码两个功能密切相关的枯草杆菌蛋白酶,JORDA等2000把这两个基因的启动子分别与GUS和LUC报告基因相连后转入拟南芥中,结果表明尸反活和尸矽C启动子受水杨酸诱导以及在假单胞菌的侵染下启动抗性作用7。GULDERDONI等2002发现水稻中的脂质转移蛋白基因LTPI的启动子可以受到真菌感染的诱导8。S韶翻K等2004,2007在研究水稻中的两个过氧化物酶基因RZ刃夕和R2I84时发现RZJZ夕和R2I84的启动子受到稻瘟病菌感染的诱导,进一步的研究发现,RZ了29基因启动子的一1798一748,R2I84启动子的一1975到一548的区段含有许多胁迫响应元件,包括茉莉酮酸响应元件,ABA响应元件,乙烯响应元件等920。1323创伤诱导表达启动子山东大学硕士学位论文很多植物能对自然创伤或害虫造成的机械损伤做出反应,诱导基因的特异表达。这些创伤诱导的基因编码多种蛋白产物,如几丁质酶、日一1,3一葡萄糖酶等水解酶类、木质素、结构蛋白、蛋白酶抑制剂等。李红等1997对水稻的I类几丁质酶基因RC月R8启动子进行研究发现RCHS启动子受到创伤诱导,进一步的缺失分析发现RC月R8启动子一1016一676的DNA序列缺失后,GUS酶活性显著下降,缺失到一68BP处时的启动子仅有极低的活力2。此外,泛素一核糖体蛋白融合基因UBI3基因启动子也同样受到创伤诱导22。水稻蛋白酶抑制蛋白基因山尸活I启动子在水稻叶片中受到创伤的诱导23。ALEXANDRE等2007在研究PUROINDOLINEA基因PINA启动子时发现PI叭启动子在水稻中受到创伤的诱导24。1324植物激素诱导表达启动子植物合成和分泌多种激素,主要包括生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸和乙烯等。植物激素可调节细胞的伸长、分裂和分化,并且控制植物的生长、发育、休眠、萌发、生根、开花、结果以及果实成熟等过程。植物激素本身不能直接作用于DNA,其首先必须与受体结合,使受体蛋白激活再启动特定基因的表达。植物激素诱导表达启动子除基本启动子元件外,还存在一些顺式调控元件,这些顺式调控元件在基因响应不同激素诱导的过程中发挥重要作用。某些生长素调节的启动子含有一个或多个保守的5、TGTCTC一3序列和与之相似的5一G厅OTEEE户A3序列,后者含有。盒结构和/或TGAHEX盒125。在脱落酸ABA诱导的启动子中,已经发现不少于20种脱落酸效应元件ABRE,ABA效应元件含有G一盒结构,其共有序列为5、C/G汀ACOTOOC/O一3,6。植物激素诱导表达启动子的特异效应元件虽然存在差异,但也具有某些共同的基本特征一般此类启动子都含有某些近距离启动子作用元件,它们对基因表达起重要作用,这些元件往往位于转录起始点上游300BP处此类启动子含有的多个顺式作用元件常以组合形式调节转录,不同顺式元件之间的偶联导致基因表达的多样性G一盒是共有的与邻近元件组合发挥作用的顺式元件,它与邻近元件组合,使启动子产生不同的效应闭。11241生长素诱导表达启动子山东大学硕士学位论文NAGAO等在研究G月份启动子时发现其序列中含有两个独立的生长素效应元件,1LBP的DI亚元件5,一CCTCGTGTCTC一3,和24BP的D4亚元件5,CACGCAATCCTTTGTCTCA尤以六G3。这两个顺式作用元件均含有一个生长素诱导表达所必需的TGTCTC基元MOTIO。在DL亚元件中,TGTCTC基元上游有一个5CCTCGTG3元件,与TGTCTC基元序列重叠在D4亚元件中,TGTCTC基元上游有一个组成型元件5CACGCAA刀汀3。G厅J启动子中的两个生长素效应元件被称为复合元件,因为它们既包括一个组成型元件又包括一个TGTCTC元件。当细胞中生长素浓度过低时,TGTCTC元件作为生长素效应元件发挥作用,抑制组成型元件的作用,提高生长素浓度,抑制解除,复合元件活化,启动G石旧基因的转录1261。11242赤素诱导表达启动子禾本科植物的Q淀粉酶基因受到赤霉素的诱导,这些基因的启动子序列中一般含有哮咤序列、TAACA刀GA序列和1ARCCAC/T序列。WOIF等1992发现在某些禾本科植物。淀粉酶启动子中,赤霉素响应的产生可能是元件之间组合或赤霉素效应复合体作用的结果27。GUBLER等L992在研究大麦的。淀粉酶启动子时发现,低等电点。淀粉酶启动子AMY32B中的嚓睫序列的突变导致赤霉素效应活性的丧失。而某些高等电点。淀粉酶启动子,嗜吮序列的缺失则对赤霉素诱导的表达效果没有太大影响。在这两类的。淀粉酶启动子中厂1AL,CCAC序列的突变均可导致赤霉素效应活性的基本丧失128。11243脱落酸效应启动子在脱落酸ABA诱导的启动子中,一已经发现不少于20种脱落酸效应元件ABRE,ABA效应元件一般含有G一BOX结构,其共有序列为5一C/G/TACGTGGC/G一326。水稻OSEM基因受到脱落酸的诱导,其启动子含有三个类似脱落酸效应元件的结构5一ACGTG一3和一个SPH一盒5一CATGCATG一329。RAIFWELSCH等2008研究发现水稻中的三个八番茄红素合成酶基因坛尸害Y1,山尸客Y2和伪尸害扮的启动子都受到ABA的诱导31。1124乙烯效应启动子山东大学硕士学位论文在某些植物中,乙烯的大量合成和释放对果实的成熟起到非常重要的作用,产生的乙烯启动许多与成熟有关的基因的表达如在番茄果实成熟过程中高效表达的ES基因,其表达受乙烯激活30。该基因启动子的一1528一1100片段能使355启动子具有乙烯效应特性。植物在遭受病原体进攻后,乙烯的生物合成迅速上升,大量受病原体诱导的基因迅速编码病理相关蛋白。在病理相关的碱性蛋白质基因启动子中,存在5TAAGAGCCGCC一3保守序列,即GCC一盒,GCC一盒的点突变能导致乙烯效应活性的丧失。在病理相关的启动子中,GCC一盒对产生乙烯诱导具有重要作用,其它元件如G一BOX也可能在产生乙烯效应过程中具有一定作用131。因此,乙烯效应元件可能不止一种类型,在成熟和衰老过程中表达的基因与病原体进攻诱导表达的基因,二者的乙烯效应元件在结构上可能存在差别。133组织特异性启动子组织特异性启动子也称为器官特异性启动子。在这些启动子的调控下,基因的表达往往只发生在某些特定的器官或组织部位,并往往表现出发育调节的特性。这种特异性通常以特定的组织细胞结构和化学物理信号为存在的基础,因此,这类转录调控序列与诱导型启动子有一定的共同点。对组织特异性启动子的调控机制的研究表明,组织特异性表达基因的上游存在着调控序列,其启动子除具有一般的结构外,往往还有增强子和沉默子的一般特性。组织特异性启动子中可能含有两类调控序列,一类决定表达的组织特异性,一类起增强子作用。许多研究表明,组织特异性启动子的调控往往受到组织细胞生理状态和化学物质等的诱导,同时还受到植物发育阶段的调控。组织特异性表达是多种因子相互作用的结果132。1331根特异性启动子根是植物的重要器官,起固定和吸收作用,同时还有合成和贮藏有机物,以及进行营养繁殖的功能,对植物的生长发育有着非常重要的生物学意义。研究根特异性基因的表达和调控及其启动子的结构功能对研究植物的生长和发育具有重要意义。SBPRPI是大豆中的一种脯氨酸丰富蛋白,主要在大豆的根部表达,推测由山东大学硕士学位论文其启动子特异调控肠尸尺刀基因的表达。SUZUKI等1992将11KB的及分切尹少启动子区域与GUS基因构建融合基因,转化烟草,GUS组织分析结果表明GUS基因主要在根尖、根的初生根、次生根的伸长区以及根部的皮层中表达。进一步的缺失分析发现,转录起始位点上游的262BP决定基因的根特异表达,而可以和根部的特异核蛋白结合的一1080一262区域,可以增强报告基因在根部的表达132。TOBRB夕是烟草的一个根特异表达基因,原位杂交显示该基因主要在根的分生组织和未成熟的中柱鞘中表达。TOBRB7基因启动子在转录起始位点上游一823一300区域中存在可以与根组织特异性反式激活因子结合的顺式作用元件,它决定了被调控基因的根组织特异性表达,而一823一70区域富含AT,在该区域同时存在着两个不同方向的微启动子,它们决定了启动子的极性和调控基因表达的双向性33L。YANG等13412007研究了拟南芥中阿拉伯半乳糖聚糖糖蛋白ATAGP18表达的器官和组织表达模式以及亚细胞定位。发现ATAGPIS基因启动子可以启动GUS基因在根,花和茎中高效的表达,尤其在根中表达最强,在莲座叶和幼苗中表达较弱。ATAGPIS基因启动子在幼嫩组织中有较高的活性。小麦中的磷酸盐转运体基因几尸T2具有根表达特异性,其启动子可以启动GUS基因在小麦及拟南芥根中的特异表达35。AN一PINGCHEN等2007研究了拟南芥中一个编码富含甘氨酸蛋白的盐胁迫响应基因ATGRP夕的表达模式,发现ATGRP夕启动子可以启动GUS基因和G尸尸基因在根的维管组织中特异表达。同时研究表明,拟南芥肉桂醇脱氢酶基因ATCAD的也具有与ATGRP夕相同的表达模式,由此推测ATCA历启动子也具有根表达特异性36L。1132叶片特异表达启动子叶片是植物进行光合作用的主要器官,对植物固定能量有着非常重要的作用,许多叶片特异表达基因的产物都参与光合过程。根据光对叶片特异表达启动子的诱导,可将其分为两大类型L光诱导型叶片特异表达启动子2非光诱导型叶片特异表达启动子。13321光诱导型叶片特异表达启动子光诱导型叶片特异表达启动子,如RBCS、CAB、几沪CB。、STLSI等基因的启动子研究的较为透彻。它们的启动子序列中发现,它们大都具有重复序列,而且相距很近,这可能有利于它们之间的的相互作用,以及它们与蛋白质因子的相互作用。总之,光诱导型叶片特异表达启动子一般具有两个特征一是具有光反应元件区域,二是有决定组织特异表达区域,这两个区域有时交错在一起,既能受光的诱导,还能决定基因的组织特异性表达139。KWON等1994将拟南芥3一磷酸甘油醛脱氢酶日亚基基因的启动子上游664如的片段与GUS基因融合并转化烟草,GUS活性分析发现光照情况下GUS基因在叶片特异表达。通过缺失分析,发现在一261一173这段存在光诱导必需区段,含有4个正向重复序列,它们共有5一ATGAAC刀GA一3的保守序列,即G叩一BOX。另外将一261一173这段含有的4个正向重复序列的片段与截短的355启动子含有一90十6融合,发现该融合启动子能启动GUS基因在叶片中特异表达,同时也具有光诱导的活性,因此推测GAP一BOX中含有光反应元件和决定组织特异表达的元件,这些元件对3一磷酸甘油醛脱氢酶P亚基基因在光诱导下的表达及其表达呈现组织专一性有很大的作用。进一步通过凝胶阻滞分析,发现了一种特别的蛋白质因子,该因子称为GAPF,它不同于与RBCS一3A启动子中光反应元件BOXN和BOXNL结合的GT1因子,它与G叩七OX专一结合,可能对3一磷酸甘油醛脱氢酶P亚基基因的诱导性表达和组织专一性的表达有一定的作用40L。11122非光诱导型叶片特异表达启动子HAJ汀AK等1995研究不依赖于光的质体核蛋白即LZI基因的启动子时,发现其启动子无典型的毛幻人一BOX,具有两个转录位点PI、PZ。P2启动子为一个组成型启动子,可在富含多聚啼吮的区段启动低水平的转录,而PL启动子主要调控相关基因在叶肉细胞中表达。PL启动子在叶绿体发育早期阶段即可被激活,无论在黑夜或白昼叶片中PL调控的转录产物的含量是根中细胞的2050倍14L。此后对该启动子进行了深入的研究和分析,通过缺失分析发现1一89计38山东大学硕士学位论文这段核心启动子足以启动报告基因在叶片中特异高水平表达2在核心启动子的上游存在两个调控区域,一20今一89的一个负调控区和一328一04的一个正调控区,它们可以在无光的情况下调控基因的转录。负调控区有一个叶特异因子SLF结合位点,即SLF位点,SIF因子与SIF位点的结合将导致转录活性的降低。正调控区存在一个新的顺式元件,核酸序列为5七川队以一3,称为52位点,该位点在其他质体相关基因启动子也很保守,它和G不L因子结合位点有一定的关系,与52位点结合的SZF因子可能作为一个偶联因子激活GTL因子促进叶片特异表达的调控42。1333维管束特异表达启动子目前己克隆得到了多个维管束特异表达启动子拟南芥P耐LINZ基因启动子、菜豆苯丙氨酸解氨酶基因2的启动子、菜豆富甘氨酸细胞壁蛋白G尺尸18基因启动子,并对其进行了功能分析。拟南芥P耐左刀2基因启动子的一1677一1380区可启动基因在维管束中特异表达,若缺失这段序列,则维管束特异表达变为组成型表达。此外,在一1647一1639处有一个AC一I元件,其可能与该启动子的维管束特异表达有关I43。HATTON等1995对菜豆苯丙氨酸解氨酶基因ZPALZ启动子进行研究,结果表明该启动子中的AC一ICCCACCTACC、AC一11CCACAACCCCC、ACMGTTAGGTTC等元件对基因在维管束的特异表达起着十分重要的作用。这三个元件任何一个发生了突变,GUS基因在维管束的表达量明显降低,仅为野生型的1/2一L/3。从表达模式上看,AC一M突变对基因的表达影响较小,而AC一I或AC一N单独突变时,基因在木质部的表达降低,韧皮部的表达提高。AC一I和AC一11同时突变,则根、茎木质部和韧皮部中GUS基因的表达都明显降低,因此用乙2基因的维管束特异表达至少需要有AC一I或AC一N元件44。KELLE和BAUMGARTNE1991对菜豆G尽8基因启动子进行了缺失分析,发现转录起始位点上游一205BPGRP启动子仍能驱动GUS基因在维管束特异表达,当缺失到186BP时GUS基因明显变成组成型表达。缺失分析结果表明此20BP片段是维管束特异表达必须的,而且此20BP片段恰好与己知的28BP的维管束特异表达片段VS一CATGCTCCGTTGGATGTGGAAGACAGCA重叠。进一步的研究表明,山东大学硕士学位论文VS一1DNA序列的结合因子为VSF一1,它是一个转录激活因子,其C端有一个碱性区及亮氨酸拉链结构BZIP基元序列45。REJANEL等2007发现黄豆蔗糖结合蛋白基因SBPZ的启动子中决定组织特异表达的区段位于序列的一200小一700的末端顺式结构域ADISTALCIS一REGULATORYDOMALNACRD一A中,CRD一A可以抑制基因在维管组织以外的组织的表达146。1334花器官特异表达启动子花是植物进行有性生殖的器官,对植物有着非常重要的作用。目前,已有一些花器官特异表达启动子被克隆,如TAZ夕基因启动子、LAT分基因启动子等得到了详细研究,对花卉花色基因工程的研究起到了重要的促进作用。TAZ夕基因来自于烟草中,其表达呈现严格的花药专一性。KOLTONOW等1990对TAZ夕基因启动子一5670一18区段进行了缺失分析发现一279一150区段能决定TAZ夕基因在花药中高效表达。进一步分析发现一207一191之间的序列TGAAATCA和一165一158之间的序列ACTAAGCT是决定TAZ夕专一表达的两个关键元件47L。LATJZ基因在花粉成熟时在花粉的营养细胞中优先表达。BATE等通过对LAT犯基因启动子的5端非编码区进行了缺失分析,发现一492一52区域可以调控该基因在花粉中特异表达48。郎志宏克隆得到了马铃薯花粉特异表达基因S召工R,其启动子是一个花粉特异性启动子,驱动基因在花粉管中特异表达,在其它组织没有表达149。LU等2007研究发现水稻金属硫蛋白MT基因R才彻口启动子可以诱导GUS基因在转基因拟南芥的柱头、花丝、花粉囊、早期和成熟的花丝,子叶以及受伤组织中高水平的表达,在根中只有很低水平的GUS基因的表达,而在茎,叶片和种子中没有表达。进一步通过5缺失分析发现该启动子的根,花器官及创伤诱导表达特异性分别由启动子序列中不同的区域控制50。1335种子特异表达启动子种子作为植物的繁殖体,与人类生活关系密切,除日常生活必需的粮、油、棉外,种子中还含有很多有重要的经济价值的蛋白。这些蛋白在种子发育过程中的基因表达受到严格的调控,而且有一些也具有种子表达特异性,如凝集素基达十分重要,RY基序的突变明显降低基因在种子中的特异性表达,并可以致使该基因在叶片中表达。因此,RY基序可能具有抑制种子特异性基因在非种子组织中表达的负调控元件NEGATIVEELEMENO的作用5。DEPATE等1993发现单个TGACG基序即可启动特定基因在种子特异表达,将豌豆凝集素基因启动子中含1个TGACG基序的3个串联22BP的拷贝序列与一46CAMV35S启动子融合,发现这个嵌合启动子可以启动报告基因在转基因烟草种子中特异表达521。E盒E一BOX和G盒G一BOX广泛存在于各种种子特异性启动子中,是高度保守的,对种子特异性基因的表达起非常重要的顺式调节作用,突变后会使种子特异性启动子的活性大部分丧失1531。GCN4基序,谷醇溶蛋白盒PROLAMIN一BOX,AACA基序等一般存在于单子叶植物贮存蛋白基因启动子中,这些顺式元件对调节基因的种子特异性表达起到十分重要的作用54,均。AACA基元在谷蛋白基因的启动子中很保守,它参与控制谷蛋白基因的胚乳特异表达56J7L。WU等2000发现水稻贮存蛋白基因G翻召一启动子转录起始位点上游一197个碱基的序列中含有GCN基元、AACA基元、PROLAMINBOX等元件。这段序列可指导GLUB一I基因在胚乳中特异表达,若突变GCN4基元则导致启动子活性的严重丧失并改变其在胚乳中的表达方式,但是有GCN4基元串联在一起的21饰片段驱动基因的表达模式却与天然启动子相同。进一步研究发现GCN4基元对指导GLUB一I基因在种子的特异表达至关重要,而AACA、ACGT、PROLAMIN一BOX基元参与GLUBI基因在种子表达时的定量控制作用,即GCN4指导G了动一I基因在种子中表达与否,而AACA、ACCT、PROLAMIN一BOX基元决定其在种子中表达的强度。因此,这些顺式元件的联合作用对调节种子贮存蛋白的表达至关重要158。PUROLLNDOLLNES基因是决定谷物如水稻和小麦的籽粒的硬度的重要基因。DIGEONJF等1999发现PUROINDOLINE一B基因几”刀启动子可以启动山东大学硕士学位论文GUS基因在水稻种子中的特异表达59。ALEXANDRE等2007在研究PUROINDOLINE一口基因PINA启动子时发现PINA启动子不但可以启动GUS基因在水稻种子中的表达,还可以启动GUS基因在根中的表达。同时PI耐启动子还受到创伤的诱导24,60,6。1316果实特异衰达启动子1331果实特异表达启动子的克隆果实作为植物的生殖器官含有丰富的营养成分,有着特殊的商业价值,而且果实对植物的繁衍有着非常重要的作用,研究果实特异性启动子对我们了解果实的发育过程及启动子的调控机制有着重要的理论意义。目前,果实特异性启动子的研究近年来取得了较大进展。植物的果实按照成熟过程中呼吸强度和乙烯生物合成是否增强,分为呼吸越变型和非呼吸越变型果实62。呼吸越变型果实在成熟过程中伴随呼吸强度和乙烯生物合成的增强163,而非呼吸越变型果实则没有。典型的呼吸越变型果实有番茄、苹果、香蕉等,这类果实的成熟依赖乙烯的合成增强和释放非呼吸越变型果实有草毒、葡萄、冬枣等、这类果实的成熟与乙烯关系不大。许多果实特异表达基因都与果实的成熟有关,如番茄E4、E8基因和尸G基因等30冈。此类果实特异启动子除了含有调控基因果实特异表达的元件外,还常常含有与果实成熟信号诱导元件和乙烯应答元件等顺式元件,因此研究果实特异启动子必须要了解果实成熟的生理基础。目前果实特异性启动子研究在番茄上开展较多,其中最深入的包括E4,E8,PG多聚半乳糖醛酸酶基因,ZALL基因的启动子。E4、ES基因的果实成熟调控类型的启动子,具有果实成熟信号诱导元件、乙烯诱导元件。DEIKMANJ等1998在对ES启动子研究发现,E4启动子上游的乙烯诱导元件结合蛋白也能与E8启动子的乙烯诱导元件相互作用,此外在ES启动子的一1088一863区段含有一个EVES结合蛋白的结合位点,其结合位点的保守序列为5一ATTNCNANNNANAGAAA一3。若缺失这段序列,则基因在未成熟果实表达减弱,而在叶中的表达增强,因此其在果实特异表达中起到重要的作用1301。山东大学硕士学位论文PG多聚半乳糖醛酸酶基因仅在番茄的成熟果实中表达,其4SKB的启动子片段能调控报告基因在果实中高水平表达,并表现出高度的成熟依赖性。在PG基因启动子一80卜一443区段有一个正调控区,决定基因在内果皮表达,但在一141卜一1150有个负调控区,抑制基因在内果皮表达“,65。番茄ZALL基因是果实特异性表达基因,长度为4OKB和13KB的的启动子序列可以驱动报告基因在果实中高水平的特异表达,同时发现在该基因启动子的一179卜1324区段有一个强的负调控元件,该元件能导致报告基因在果实中无法表达。番茄ZALL基因是果实特异性表达基因,长度为4OKB和13KB的的启动子序列可以驱动报告基因在果实中高水平的特异表达,同时发现在该基因启动子的一179卜一1324区段有一个强的负调控元件,该元件能导致报告基因在果实中无法表达66L。目前对单子叶植物果实特异表达启动子研究的比较少,香蕉ACC合成酶基因的启动子调控基因果实表达特异性,对该启动子进行缺失分析发现,调控基因果实特异性表达的区域可能位于转录起始位点至一1111的启动子区。在一川L一608区段可能存在一个正调控元件。另外该启动子与番茄E4,ES,PG基因启动子相似性仅有219一25,同时也不具有与番茄E4,ES启动子中的E4尼8蛋白结合位点及乙烯应答元件一致的序列6V。草毒属于蔷薇科草蓦属的多年生植物,其“果实”的可食部分由花托RECEPTACLE发育而来,真正的果实是嵌入花托中的瘦果ACHENE。草墓果实属非呼吸跃变型果实,其成熟过程与乙烯无关PERKINS一VEAZIE,1995。可分为五个阶段绿熟期I期,果实个体己转白,部分种子着色、挂粉期II期,果实向光面大约L/4面积转红、半红期M期,1/2转红、红熟期W期,L/2转红和全红期V期1691。目前关于草墓果实特异启动子的研究比较少。HYP砂是一类富含脯氨酸的细胞壁结构蛋白,在果实的发育和成熟过程中起重要作用。ROSARI。等2004研究表明御尸尺尸基因在草薄果实中特异表达,在果实的各个发育阶段都有表达,在未成熟绿色果实厚壁组织细胞、维管组织细胞、花托细胞中以及成熟红色果实维管组织细胞中表达很强,以成熟阶段表达量最高。在此基础上,对脚朋尸基因的5端上游的部分序列进行了生物信息学的预测分析,其中包括两个ABA山东大学硕士学位论文应答元件和一个茉莉酮酸甲酷应答元件。目前草苟HYP即基因启动子的研究没有见到相关报道170。13362果实特异性启动子的应用利用果实特异性启动子使外源基因在植物的果实中特异表达,从而改良植物果实品质以及其他一些生物学形状。毛自朝等2002将在ZALL启动子的基础上通过PCR扩增得到的ZA12启动子和异戊烯转移酶ISOPENTENYL一TRANSFERASE,IPT基因连接,导入番茄品种”中蔬4号”中,GUS组织化学活性分析发现ZA12启动子具有严格的果实表达专一性。转基因果实中细胞分裂素的含量增加,最终导致果实中种子发育的停滞和胎座组织的增厚,并形成无籽番茄,且果实采后的保鲜时间延长了1一2周7L。、恤KOBY等2006用ES启动子研究扩增促进序列确PLIFICATIONPROMOTINGSEQUENCE,APS对外源基因表达的影响结果显示,APS可以促进外源基因在果实中特异高效表达,这为提高果实特异性启动子的表达效果研究提供了优良的素材72。AMEMIYA等2006将ZALL启动子与液泡三磷酸腺昔酶VACUOLARH书ATPASE,VATPASE基因中7个A亚基序列融合,利用反义技术转入番茄中,转基因番茄果实中VATPASEA亚基的MRNA合成减少。转基因番茄果实较小,种子较少,蔗糖浓度增加,而果糖和葡萄糖浓度不变V3L。14启动子克隆的方法目前,克隆启动子的方法大致可分为两种一种是利用启动子探针质粒载体筛选启动子另一种是利用PCR技术克隆启动子,主要包括己知序列的PCR,反向PCR、手柄PCR和衔接头PCR等74。141利用启动子探针载体筛选启动子启动子探针载体筛选启动子是一种常用的方法,它是利用缺失了启动子的,产物易检测的报告基因系统,构建启动子探针质粒载体来克隆具有启动子功能的DNA片段。启动子探针载体包括两部分转化单元和检测单元。启动子探针载体筛选启动子一般程序是用一种适当的限制性核酸内切酶消化基因组DNA,然后将消化产物与无启动子的探针质粒载体重组,并按照设计的要求使克隆的片段恰好插在紧邻报告基因的上游位置,随后再把重组混合物转化给寄主细胞,构山东大学硕士学位论文成质粒载体基因文库,并检测报告基因的表达活性。构建启动子探针型载体时,常见的检测标记基因有日一半乳糖昔酶基因勿论,氯霉素乙酞转移酶基因CAT,四环素抗性基因TETR和卡那霉素抗性基因犬劝刀。近年来人们开始较多的使用潮霉素B磷酸转移酶基因句茗作为检测标记基因。DOIMAL,习等1981以氯霉素抗性基因作为报告基因,FODO产76等1990以大肠杆菌LACZ为报告基因。构建了酵母启动子探针质粒并克隆了一些启动子片段。李维等17712000曾构建了含有句召R抗性基因的启动子探针型载体PSUPVS,直接在大肠杆菌中分离黄抱原毛平革菌基因的启动子。该方法不需要知道具体基因的序列,可随机筛选启动子,避免了引物设计,能获得大量的启动子片段。142普通PCR克隆启动子根据己报道的序列设计引物,通过PCR扩增,从基因中克隆启动子,这种方法简便,快捷,是一种常用的克隆启动子的方法。可以在设计引物时在两端加入限制酶切位点,产物回收后可经限制酶切后克隆到载体上得到重组质粒。经测序后进行同源性比对,确定克隆正确。这种方法是以知道基因的全序列为基础的,只能扩增两端己知序列之间的DNA区域。这种方法也有很大的局限性,若不知道启动子的序列信息,则无法使用此方法。曹军根据番茄ZAU基因的序列设计特异引物,通过PCR克隆了番茄ZALL基因的1SKB启动子片段178。苏宁等792003根据已报道的水稻叶绿体16SRRNA基因序列设计特异引物,以水稻叶绿体DNA为模板。PCR扩增得到了165识NA基因启动子区的片段。彭仁旺等邝011996根据己报道的烟草TAZ夕基因序列设计引物。通过PCR从烟草中克隆了花药特异表达基因TAZ夕的启动子。143以PCR技术为基础的技术克隆启动子利用PCR的方法扩增DNA片段非常简便,快捷,经济,随着PCR技术的发展,人们越来越多的开始使用基于PCR方法的体系来克隆基因的启动子。目前已经开发出多种克隆启动子的方法,包括环状PCR,利用载体或接头的染色体步行技术,热不对称交错PCR等。山东大学硕士学位论文1431环状PCR环状PCR是根据一端已知序列设计嵌套式引物,然后通过PCR克隆启动子,包括I一PCRINVERSE一PCR和P一PCRPANHANDLE一PCR两种。I一PCR是TRIGLIA设计的一种基于PCR的改进的染色体步行方法,其实验程序包括基因组DNA经限制酶酶切后用几DNA连接酶进行自连接,产生环状DNA片段,然后以环化产物为底物用根据己知片段设计的反向引物进行PCR扩增,从而得到含有未知片段的扩增产物。韩志勇等2001以I一PCR技术为基础克隆了转基因水稻的外源基因旁侧序列18L。李竹红等1999利用改进的1一PCR方法克隆了TCL转座子左侧反转重复序列的旁侧序列182。P一PCR是由JONES等设计的利用末端反向重复序列与已知序列互补配对形成环状单链模板克隆DNA片段的技术,它有效增强了引物与模板结合的特异性。P一PCR反应需要3个根据己知序列设计的引物,3个引物在己知序列内呈线性排列,其中第3个引物可作为接头使用,可与已知序列互补配对形成锅柄状单链模板83。JONES等1992,1997利用改进的P一PER,在形成PANHANDLE结构之前3末端连上DDCTP,使引物错配的机率减少,特异性增加。P一PCR是目前能够扩增距已知序列最远的未知DNA序列的方法,有很高的特异性83,84。1412利用载体或接头的染色体步行技术染色体步行技术是将基因组DNA的限制性酶切产物与特定的载体或接头连接,然后根据基因组DNA序列设计特异引物与载体的通用引物或接头序列进行扩增。SHYAMALA等1989利用单特异性引物PCR以小鼠伤寒杆菌组胺酸转运操纵子为起始位点进行连续步行,用PSTL和ARAL酶切基因组DNA,以M13MP8RFDNA为载体,用PSTL和XM口I酶切载体DNA,然后将基因组酶切片段与载体片段连接,根据基因组DNA序列设计特异引物,与载体的通用引物组合进行扩增,扩增得到了特异性片段85L。王新国等2001利用加接头的方法,设计了位于单链DNA两端互补的颠倒末端重复序列,增加了反应的特异性,克隆得到了胡萝卜2型转化酶基因启动子的部分序列86。CHEN2007等用PCR的方法从拟南芥中扩增得到了富含甘氨酸蛋白ATGP火夕基因启动子区的3KB的DNA片段36。山东大学硕士学位论文1433TAILPCR随机引物PCR由于无法有效地控制由随机引物引发的非特异产物的产生,所以一直未能广泛应用。刘耀光等1995设计的热不对称交错PCR即TAIL一PCRTERMALAS丫INMETRICINTERLACEDPCR解决了这个问题,利用改良的成功地从突变体中克隆得到外源插入基因的旁侧序列,从而为启动子的克隆提供了有效的新方法87。TAIL一PCR方法降低了由随机引物引发的非特异性扩增的问题,同时克服了常规的PCR不能对已知序列的侧翼未知序列进行扩增的缺点。TA几一PCR方法与传统的克隆方法相比,省去了一些实验前、后的繁琐操作,如酶切、连接、加尾等,具有许多优点I操作简便直接以DNA作为模板,省去了RTPCR,RACE等如提取RNA等的繁琐操作,且TAIL一PCR整个反应可在一天内完成,可以快速获得目的序列。2成本较低只需要设计几个嵌套引物和简并引物,和其他方法比较,大大降低了成本。3特异性强,重复性好。此外,由于其操作程序化,引物可通用,适合处理大批量样品,有自动化应用前景。但是TAIL一PCR方法也存在一些缺点,这主要是因为TAIL一PCR程序很复杂,有三步连续的PCR组成,实验条件的摸索是个很复杂的过程,每一步的条件都较难控制,随机引物与特异引物的组合较多。另外不是每次都有阳性结果,而且有时有假阳性的存在。TAIL一PCR方法具有高度的特异性、灵敏性,该项技术在分子生物学研究中已经得到了较为广泛的应用。目前国内外进行的研究中,TAIL一PCR主要应用在扩增TDNA的旁侧序列,以确定其插入位点,扩增己知序列的旁侧序列,从而绘制遗传图谱或为基因定位188951。认白NG2004等应用TAIL一PCR技术在一种小球藻属椭球体CHLOREJLLAELLIPS口矛山口中扩增硝酸盐还原酶基因NR基因的5端,得到的序列与GUS基因融合,在藻类口伽中检测表达,证明扩增得到的片段具有驱动表达的启动子元件96。目前,利用TAIL一PCR技术克隆高等植物启动子的研究也有报道。杨国栋2007利用TAILPCR技术,从棉花基因组中克隆了长度为1610BP的G人凡限口基因启动子片段1971。刘召华等根据ACA基