淋病实验室诊断

,淋病实验室诊断,河北省疾病预防控制中心性病中心实验室,1,主要内容,淋球菌及致病性淋病实验室诊断淋病实验室诊断策略小结,2,一、病原菌与致病性,奈瑟氏淋球菌是淋病的病原菌，主要引起泌尿生殖系统化脓性炎症。淋病的潜伏期平均3-5天,淋球菌主要侵犯上皮细胞,尤其是柱状上皮细胞。,3,男性：引起尿道炎，可合并前列腺炎、精囊炎、 附睾炎。女性：引起宫颈炎、尿道炎，可合并子宫内膜炎、输卵管炎或输卵管卵巢脓肿、盆腔炎、肝周炎、前庭大腺炎等。男女：都可引起淋菌性肛门直肠炎、淋菌性咽炎、淋菌性结膜炎，都可合并播散性淋球菌感染。有5%-20%的男性和60%的女性病人呈无症状经过。,4,一. 病原菌（萘瑟氏淋球菌）,1.形态 (1).形态呈肾形或蚕豆形，常成对排列，邻近面扁平或略凹陷。无芽孢、无鞭毛。 (2).大小为0.6-0.8m。 (3).革兰氏染色阴性，呈粉红色。美蓝染色呈蓝色。 急性炎症期病人，细菌多在患者分泌物的白细胞胞浆中。慢性炎症期病人，细菌多在白细胞外。,5,2、生物学特性,(1).淋球菌适宜在潮湿、温度为35-36、含5-7%二氧化碳的条件下生长。生长最适PH为7.2。 (2).淋球菌对外界理化因素抵抗力均差，在完全干燥环境中只存活1-2小时，室温存活1-2天，50时存活5分钟。附着于衣裤能存活18-24小时。,6,(3).淋球菌为需氧菌，对培养的要求较高，普通培养基不易生长， 在含有动物蛋白的培养基上生长良好。 (4).能分解葡萄糖、产酸不产气。 (5).生长过程中产生氧化酶。还产生自溶酶。,7,淋病的传播途径有以下二种：,1)直接性接触感染：成人淋病几乎全部通,过性接触感染。,2)间接接触感染：新生儿可通过母亲产道分泌物间接感染。,8,二、淋病的实验室诊断方法,分泌物涂片镜检；分离培养淋球菌；检测淋球菌核酸：PCR,9,1、标本的采集,取材部位依据,年龄性别性接触方式临床表现,取材拭子种类,藻酸钙拭子普通棉拭子涤纶拭子,10,标本的采集-取材部位(1)男性,异性恋者:采集尿道标本，有口淫史者加取咽部标本；同性恋者: 采集尿道、直肠及咽部标本.,女性采集宫颈标本，必要时从尿道、直肠、咽部、前庭大腺和尿道旁腺取材.,11,标本的采集-取材部位(2),幼女幼女和/或处女膜未破的感染者标本：采集阴道分泌物新生儿眼炎患者采集眼结膜分泌物,12,标本的运送,淋球菌的抵抗力弱，对热敏感，不耐干燥。取材后标本若不能立即接种于选择培养基上，需采用运送系统。置于非营养性运送培养基中的标本应在12小时内送到实验室，接种于选择培养基，分离阳性率可达90%以上。超过12小时则分离阳性率下降。,13,2、显微镜检查,1.染色涂片的制备：涂片方法 在干净玻片上预加一小滴生理盐水。 * 用白金耳蘸取样时，应将白金耳半悬状态使分泌物洗脱于盐水； * 用棉拭子取样时，应将棉拭子在盐水处轻轻“滚动”，而不是涂抹。 * 自然干燥后, 涂漠面朝上快速通过火焰三次固定。,14,显微镜检查,注意事项： * 涂片手法要轻，避免细胞破裂。薄厚得当，以基本无细胞重叠为宜； * 火焰固定以涂片在腕背皮肤接触时仅感微热为宜； * 避免用加热法使湿片干燥，避免固定时过度加热,以免扭曲细胞形态。,15,显微镜检查染色方法:,革兰染液美兰染液姬姆萨染液荧光抗体革兰染色为一传统方法，因简便、快捷及价廉、仍然为最广泛采用的方法。革兰染色将菌分为二大类，即染成紫色的革兰阳性菌及染成红色的革兰阴性菌。,16,直接显微镜检查革兰染色:,涂片：将拭子在载玻片上轻轻滚动涂片。固定：待涂片在室温中空气自然干燥， 涂片经火焰固定 革兰染色： 第一液（结晶紫）染3060秒，流水冲洗数秒； 第二液（碘液）染60秒，水洗； 第三液（95%乙醇）脱色3060秒，水洗； 第四液（复红）复染30秒，水洗。,17,革兰染色：细胞内革兰阴性双球菌,18,直接显微镜检查的临床意义,男性淋菌性尿道炎的尿道标本敏感性及特异性可高达95%99%，具诊断价值。宫颈标本、无症状男性尿拭子及取自直肠的涂片时敏感性仅4070%。不推荐直接显微镜检查诊断直肠和咽部，以及女性宫颈淋球菌感染。 亦不能用于疗后判愈。如果在多形核细胞外见到形态典型的革兰阴性双球菌，需做培养进行确证。,19,3、淋球菌培养鉴定,培养法为诊断淋病的金标准.对女性淋病、直肠、咽部的确诊应做淋球菌培养培养的敏感性81100%。培养的优点有：,特异性极高（100%）；可发现无症状淋球菌感染患者；可用于进一步作药敏试验；可用于治疗后的判愈试验。,20,3、淋球菌培养鉴定,1、培养基 淋球菌对营养要求较复杂,培养基中应含有动物蛋白及细菌生长所需的各种因子。目前常用的选择培养基有Thayer-Martin(T-M)培养基、血液琼脂或巧克力琼脂培养基。为抑制杂菌，在培养基中可加入少量抗菌物质如多粘菌素(25g/ml)和万古霉素(3.3g/ml)等。 目前淋球菌的成品培养基均有商品出售。,21,淋球菌培养,接种标本,取材后标本应尽可能及早接种。培养基应先置于室温或孵箱中预温。将取材的拭子转动涂布于平皿的上1/4范围，然后用接种环分区划线，以保证获得较纯的单个菌落。,22,接种标本-四区划分接种,23,接种标本-四区划分接种,24,淋球菌培养,培养条件 ： 35 36，含5%10% CO2，湿润（70%湿度）的环境。CO2环境可由CO2培养箱、CO2产气袋及烛缸提供。使用烛缸时，应使用白色、无芳香味的无毒性蜡烛。在烛缸底部放些浸水棉球以保持一定的湿度。培养时间：2448小时,25,淋球菌培养-培养条件,26,淋球菌培养-观察结果,培养24小时后检查平皿，此时没有菌生长的平皿应继续培养至48小时，仍无菌生长才可丢弃，作出淋球菌培养阴性的报告。对选择性培养基上分离的直径在0.51mm，无色、灰白色的半透明菌落应作进一步鉴定。,27,淋球菌培养-观察结果,培养 24 小时后的淋球菌菌落,28,淋球菌培养-观察结果,29,淋球菌培养-淋球菌的初步鉴定,初步鉴定淋球菌的主要依据菌落特征氧化酶试验革兰染色,30,淋球菌氧化酶阳性,31,淋球菌培养-淋球菌的确证试验,来自泌尿生殖道符合初步鉴定标准的分离株，一般可诊断为淋球菌，准确性达98%。对于菌落形态不典型的分离株，来自咽部、眼睛、或其他泌尿生殖道外部位的分离株，来自低危人群（如儿童）的分离株，以及涉及医疗法律案例的分离株，应作确证试验。,32,淋球菌培养-淋球菌的确证试验,糖发酵试验DNA检测全自动细菌检定仪,33,糖发酵试验,糖发酵试验检测奈瑟球菌分解特定糖类(葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖)产酸的能力。根据淋球菌仅分解葡萄糖，脑膜炎球菌分解葡萄糖和麦芽糖，乳屑奈瑟球菌分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖或不分解这些糖类，可将淋球菌与可能在淋球菌选择性培养基上分离出的其他奈瑟球菌加以鉴别。,34,35,糖发酵试验-奈瑟球菌属的糖发酵特征,36,淋球菌的鉴定特征,37,淋球菌种保存,脱脂牛奶 -25 2个月 -70 1年液氮 长期冻干 长期,38,革兰氏阴性细胞内双球菌男性确诊 女性（其它样本）,未见革兰氏阴性细胞内双球