霉菌和毒素的检测方法

1、,食品中霉菌及毒素的检测方法,专 业：食品科学,Number 1,研究背景及意义,Number 2,霉菌的检测方法,Number 3,毒素的检测方法,Number 4,参考文献,目 录 contents,霉菌,霉菌广泛分布于自然界中，由于其可形成各种微小的孢子， 因而很容易污染食品。,霉菌毒素,霉菌毒素是霉菌产生的一种有毒的次生代谢产物，毒素污染会导致营养价值降低，引起动物疾病，并直接或间接危害人类健康。,1 研究背景及意义,自从20 世纪 60 年代发现强致癌的黄曲霉毒素以来,霉菌与霉菌毒素对食品的污染日益引起重视。我国在2011 年颁布了国家标准 GB2761-2011食品中真菌毒素限量,

2、各级食品监督检测机构全面开展霉菌的检测工作。,方法,01,GB4789.15-2010 食品微生物学检验霉菌和酵母计数。,方法,02,食品中霉菌和酵母计数 PetrifilmTM测试片法。,2.1霉菌检测方法,03,菌落计数,结果和报告,04,05,镜检,培养,02,01,样品的稀释,2.1食品微生物学检验霉菌和酵母计数,2.1.1 样品的稀释,2.1.2 培养,肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（colony forming units，CFU）表示。 选取菌落数在 10 CFU150 CFU的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数霉菌蔓延生长覆盖

3、整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。,2.1.3 菌落计数,2.1.4.1 结果,计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。 若所有平板上菌落数均大于 150 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 若所有平板上菌落数均小于 10 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于 1计数。,2.1.4.2 报告,1)菌落数在 100 以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。 2)菌落数大

4、于或等于 100 时，前 3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前 2 位数字，后面用0 代替位数来表示结果；也可用 10 的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字。 3)称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母数。,2.1.5 镜检,B.1 检样的制备：取定量检样,加蒸馏水稀释至折光指数为 1.34471.3460（即浓度为7.9%8.8%），备用。 B.2 显微镜标准视野的校正：将显微镜按放大率 90125 倍调节标准视野，使其直径为 1.382 mm。 B.3 涂片：洗净郝氏计测玻片，将制好的标准液，

5、用玻璃棒均匀的摊布于计测室，以备观察。 B.4 观测：将制好之载玻片放于显微镜标准视野下进行霉菌观测，一般每一检样观察 50 个视野，同一检样应由两人进行观察。 B.5 结果与计算：在标准视野下，发现有霉菌菌丝其长度超过标准视野（1.382mm)的1/6或三根菌丝总长度超过标准视野的1/6（即测微器的一格）时即为阳性（+），否则为阴性（-），按100个视野计，其中发现有霉菌菌丝体存在的视野数，即为霉菌的视野百分数。,2.1 食品中霉菌和酵母计数 PetrifilmTM测试片法,PetrifilmTM霉菌和酵母测试片： 1）测试片中添加抗生素，可抑制细菌生长； 2）含有酵母菌指示剂，使酵母菌更易

6、计数； 3）适用与菌落总数、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、单增李斯特氏菌。,酶菌毒素,Text 1,酶 联 免 疫 吸 附 法,Text 2,荧光检测法,Text 3,近红外光谱法,Text 4,微柱法,Text 5,薄层色谱法.,Text 6,气相色谱和气质谱联用法,Text 7,高效液相色谱法和液质联用,2.2 霉菌毒素检测方法,ELISA 是利用抗原抗体反应原理 ，已知抗原吸附在酶标板上 加入酶标记抗体和样品提取液并混合均匀，充分反应后用去离子水洗去多余抗体，再加入酶的底物，产生有色物质，最后加入终止液使反应终止。柳其芳 2006 ELISA法操作简单、检测速度快、成本低，适用于大批量样品的

7、快速筛选。蒋建云 2006 等也用此法检测饲料中黄曲霉毒素 B1 的含量，不但特异性强 提取纯化步骤简单，结果也易判读 回收率在 90%左右。,2.2.1 酶 联 免 疫 吸 附 法,2.2.2 荧光检测法,荧光检测法 FLD 常结合免疫亲和柱使用，是美国 AOAC 的标准检测方法，我国国标(GB/T 18979-2003)也采用此法检测黄曲霉毒素的含量，检测样品经甲醇/水提取后、过滤、稀释。用含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和柱层析净化，超纯水洗去杂质，甲醇洗脱，加入溴溶液衍生后用荧光光度计测定。赵东豪等 2009 此法也常用来检测玉米赤霉烯酮等。荧光检测法方便、快捷、花费少、不需使用霉菌毒素

8、的标准品，减少对人的伤害 也常作为快速筛选方法使用。,2.2.3近红外光谱法,近红外光谱法（NIR）是近年来发展得比较快的光谱分析技术。 NIR 可以用来检测小麦中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇等霉菌毒素。使用 NIR 分析，样品不需预处理，多种组分可以同时测定，分析速度快，重现性好，但是此方法必须先建立准确的校正模型， 适用于经常性质量控制分析。,2.2.4 微柱法,微柱法：将样品提取液通过氧化铝-硅镁型吸附剂填充的微柱，样品中的杂质被氧化铝吸附，霉菌毒素则被硅镁型吸附剂吸附，在紫外分析灯下观察荧光环与标准比较定量 本法简便快速、灵敏度高。主要用于饲料中黄曲霉毒素的筛选。,微柱凝胶免疫监测仪,2.2.

9、5 薄层色谱法,薄层色谱法：将样品提取液在薄层板上点样， 展开后，用吸收法或荧光法对被测样品与标准品扫描测定。对于黄曲霉毒素B1的检测，我国国标采用(TLC)法，该方法更适于确认黄曲霉毒素 存在与否。,气相色谱和气质联用法,2.2.5 气相色谱和气质联用法,气相色谱和气相色谱-质谱联用法20世纪70年代，气相色谱和气相色谱-质谱联用法开始用于霉菌毒素的检测毒素等单端孢霉烯族毒素。常采用气相色谱法检测，食品中毒素的检测，由于未知成分较多，一般采用与质谱联用，灵敏度也有较大的提高，检测限更低。,高效液相色谱法较早用于霉菌毒素的检测 常用的检测器有荧光、紫外、二极管阵列、蒸发光散射等检测器，目前使用最广泛的检测霉菌毒素的方法 涉及到畜牧化工和食品等各行业。,2.5.6. 高效液相色谱和液质联用,液相色谱,液-质联用,HPLC-MS具有灵敏度高、特异性强、精确度和选择性好等特点，能够对霉菌毒素进行准确的定性分析，不但检测霉菌毒素还可以检测结构类似的其他物质 ,但是仪器设备比较昂贵 检测成本高 操作步骤复杂 因此目前国内的普及率不高。,2.5.6 高效液相色谱和液质联用,4 参考文献,1 龚阿琼，胡骏鹏.常见霉菌毒素的危害及检测方法J,2014; 2 施震地.食品中霉菌检测方法探究J，2012； 3 GB4789.15-2010 食品微生物学检验霉菌和酵母计数； 4 食品