血红蛋白的提取和分离 基础知识

1、.第15课时血红蛋白的提取和分离1.归纳蛋白质多样性的原因(1)图甲说明：氨基酸的种类不同，构成的肽链不同。(2)图乙说明：氨基酸的数目不同，构成的肽链不同。(3)图丙说明：氨基酸的排列次序不同，构成的肽链不同。(4)图丁说明：肽链的数目和空间结构不同，构成的蛋白质不同。2.血液包括血细胞和血浆，血细胞又分为红细胞、白细胞和血小板，其中红细胞含有血红蛋白，使红细胞呈现红色。3.红细胞放到低渗溶液中，会吸收水分，体积膨胀直至涨破。课堂导入蛋白质是生命活动不可缺少的物质，随着基因组测序工作的完成，人们对蛋白质的研究和应用工作进入了新的时代，这就需要获得纯度较高的蛋白质。因此对蛋白质的分离就是生物学

2、研究中经常要做的工作，下面我们就以血红蛋白的提取和分离来学习有关蛋白质的一些基本技术。探究点一蛋白质分离技术生物体内的蛋白质多种多样，按照科学的需要有时要把它们分开，分离蛋白质常使用的方法是凝胶色谱法和电泳法，都是根据不同蛋白质分子的之间的差异来分离的。1.蛋白质特性的差异(1)分子的形状和大小；(2)所带电荷的性质和多少；(3)溶解度；(4)吸附性质；(5)对其他分子的亲和力。2.分离的方法(1)凝胶色谱法.概念：凝胶色谱法，也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。.凝胶：是一些微小的多孔球体，大多数是由多糖类化合物构成的，内含许多贯穿通道，具有多孔的凝胶又称为分子筛

3、。.凝胶色谱法分离蛋白质的原理(如图A)相对分子质量直径大小运动方式运动速度运动路程洗脱次序大大于凝胶颗粒空隙直径、被排阻在凝胶颗粒的外面垂直向下移动较快较短先从凝胶柱洗脱出来小小于凝胶颗粒空隙直径，可以进入凝胶颗粒内部垂直向下移动，无规则扩散进入凝胶颗粒较慢较长后从凝胶柱洗脱出来.分离蛋白质的过程(如图B)蛋白质混合物上柱；洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于凝胶颗粒之外；相对分子质量较小的蛋白质被滞留；相对分子质量较大的蛋白质向下移动；相对分子质量不同的蛋白质分子完全分开；相对分子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，相对分子质

4、量较小的蛋白质还在行进中。 (2)电泳概念：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。原理：在同一电场下，由于各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。常用方法a.琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电场中的迁移速率因各种分子带电性质的差异、分子大小和形状的不同而不同，从而得以分离。b.聚丙烯酰胺凝胶电泳加入SDS作用：使蛋白质发生完全变性，解

5、聚成单条肽链；SDS能与各种蛋白质结合形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。(3)缓冲溶液概念：在一定范围内，能够抵制外界的酸、碱或稀释的影响，维持pH基本不变的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液的配制：缓冲溶液通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。小贴士缓冲溶液常见的有三类(1)弱酸及其对应盐，如CH3COOHCH3COONa，H2CO3NaHCO3。(2)多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐，如：NaHCO3Na2CO3，NaH2PO4N

6、a2HPO4。(3)弱碱及其对应盐，如NH3H2ONH4Cl。归纳提炼凝胶色谱法和电泳法凝胶色谱法分离分子是依据分子质量大小，利用凝胶色谱柱使大分子优先洗脱出来，而小分子后分离出来。电泳法分离分子则是依据各种分子带电性质的差异，以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现在电场中将各种分子分离。活学活用1.下列各项中，除哪项外均为电泳使样品中各分子分离的原因()A.分子带电性质的差异 B.分子的大小C.分子的形状 D.分子的变性温度问题导析电泳法是在同一电场下，由于各种分子带电性质的差异及分子本身大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分

7、离。答案D解析电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。样品分子的带电性质不同、分子的大小和形状不同都会影响带电粒子在电场中的迁移速度，与分子的变性温度无关，故选D项。探究点二血红蛋白的提取和分离每一种蛋白质的分离纯化方法因其来源和性质不同会有很大差异，下面以哺乳动物红细胞为材料，学习初步分离蛋白质的方法。1.蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。2.样品处理(1)红细胞的洗涤目的：去除杂蛋白；方法：采集血样，低速短时间离心，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水稀释，再离心，重复三次，直至上清液中不再呈现

8、黄色，表明红细胞已洗涤干净。(2)血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒入烧杯中：加蒸馏水到原血液的体积，其作用是使红细胞吸水涨破；加入40%体积的甲苯，其作用是溶解细胞膜；置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min，其作用是加速红细胞破裂；红细胞破裂，释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2 000 r/min的速度离心10 min，试管中的溶液分为4层：将试管中的液体用滤纸过滤、除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分离出下层的红色透明液体，即血红蛋白溶液。(4)透析原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，

9、将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。目的：a.除去样品中相对分子质量较小的杂质。b.用于更换样品的缓冲液。3.凝胶色谱柱的制作(1)取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。(2)柱底部制作：橡皮塞打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱将橡皮塞上部包好。(3)柱顶部制作：打孔安装玻璃管。(4)将上述三部分按相应位置组装成一个整体。4.凝胶色谱柱的装填(1)计算：根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量(2)凝胶溶胀：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液(3)固定：将色谱柱垂直固定在支架上(4

10、)装填：将凝胶悬液一次性装填入色谱柱内(5)洗涤平衡：用20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤平衡凝胶12 h，使凝胶装填紧密5.纯度鉴定电泳判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定的方法中，使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。归纳提炼实验注意事项(1)红细胞的洗涤离心速度与离心时间十分重要，离心转速要低，时间要短，否则白细胞等会一同沉淀，达不到分离的效果。重复洗涤三次，如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则无法清除血浆蛋白。(2)色谱柱填料的处理：为了加速干凝胶的膨胀，可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，通常只需12 h。这种方法不仅节约时间，还可除去凝胶中可

11、能带有的微生物，排出胶粒内的空气。(3)凝胶色谱柱的装填：在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。(4)蛋白质的分离：滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，不要破坏凝胶面。根据红色区带的移动状况判断收集流出液的时间。活学活用2.下列说法不正确的是()A.在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变B.缓冲溶液通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成C

12、.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程D.透析袋能使大分子自由进出，而将小分子保留在袋内问题导析透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。答案D解析透析袋一般是用硝酸纤维素(又叫玻璃纸)制成的。透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。透析可以除去样品中相对分子质量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。1.用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的蛋白质()A.路程较长，移动速度较慢B.路程较长，移动速度较快C.路程较短，移动速度较慢D.路程较短，移动速度较快答案D解析凝胶颗粒内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部

13、的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。2.在血红蛋白分离过程中，使用缓冲液的作用是()A.维持溶液浓度不变B.维持溶液酸碱度不变C.催化蛋白质分离过程顺利完成D.无实际意义答案B解析分离蛋白质时加入缓冲液，其原因是缓冲液在一定范围内能抵制外界酸和碱对反应溶液pH的影响，保持pH基本不变。3.下列关于蛋白质提取和分离实验中样品处理步骤的叙述，正确的是()A.红细胞的洗涤：加入蒸馏水，缓慢搅拌，低速短时间离心B.血红蛋白的释放：加入生理盐水和甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌C.分离血红蛋白：将搅拌好的混合液离心，

14、过滤后，用分液漏斗分离D.透析：将血红蛋白溶液装入透析袋，然后置于pH为4.0的磷酸缓冲液中透析12 h答案C解析红细胞洗涤步骤中应加入生理盐水而不是蒸馏水，血红蛋白释放中加入蒸馏水，透析时缓冲液pH应为7.0而不是4.0。4.凝胶色谱柱制作成功的标志是()A.凝胶装填紧密、均匀B.凝胶色谱柱中有气泡C.洗脱中，红色区带均匀一致地移动D.洗脱中，红色区带偏向左边移动答案C解析洗脱过程中，如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。5.凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生

15、物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答下列问题：(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是_，原因是_。(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由_替代。(3)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是_。(4)若选用Sephadex G100，则“G”表示_，100表示_。答案(1)aa相对分子质量大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快(2)尼龙网和尼龙纱(3)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果(4)凝胶的交联程度，膨胀程

16、度及分离范围凝胶得水值解析用凝胶色谱法分离各种大分子物质时，大分子物质先洗脱出来，然后是小分子物质。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布于颗粒之间，所以向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一个凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而落后于大分子物质洗脱出来。在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。一是在装填凝胶柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。二是凝胶色谱操作过程中，不

17、能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。基础过关知识点一蛋白质分离技术1.利用凝胶色谱法先洗脱出来的蛋白质是()A.相对分子质量大的B.溶解度高的C.相对分子质量小的D.所带电荷多的答案A解析相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。2.凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法，但并非所有的蛋白质都可以用此方法进行分离，能分离的蛋白质分子之间必须()A.具有相同的相对分子质量B.相对分子质量不同，但都是相对分子质量较大的分子C.相对分子质量不同，但都是相对分子质量

18、较小的分子D.具有不同的相对分子质量答案C解析若在每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内的各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的，分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶。3.凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是()A.改变蛋白质分子通过凝胶时的路径B.吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度C.将酶或细胞固定在凝胶中D.与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度答案A解析凝胶的种类较多，但每种凝胶内部都有孔隙。相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质分子可以进入凝胶内部，通过

19、的路程较长，洗脱时从凝胶柱中出来的较晚，相对分子质量较大的蛋白质分子则可以较早地洗脱出来，从而达到分离蛋白质的目的。4.已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种物质，其分子大小、电荷的性质和数量情况如图所示。下列叙述正确的是()A.将样品装入透析袋中透析12 h，若分子乙保留在袋内，则分子甲也保留在袋内B.若五种物质为蛋白质，则用凝胶色谱柱分离时，甲的移动速度最快C.将样品以2 000 r/min的速度离心10 min，若分子戊存在于沉淀中，则分子丙也存在于沉淀中D.若五种物质为蛋白质，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子，则分子甲和分子戊形成的电泳带相距最近答案C解析透析的原理是相

20、对分子质量小的物质能透过半透膜，相对分子质量大的物质不能透过，乙保留在袋内，甲则不一定保留在袋内；凝胶色谱柱分离时，相对分子质量小的物质路程长、移动慢；离心时相对分子质量大的物质先沉淀，戊沉淀，则乙、丁、丙均已沉淀；用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质时，电泳迁移率主要取决于分子大小。知识点二血红蛋白的提取和分离5.洗涤红细胞时，离心所采用的方法是()A.低速长时间离心 B.低速短时间离心C.高速长时间离心 D.高速短时间离心答案B解析高速或长时间离心，会导致白细胞和淋巴细胞一同沉淀，得不到纯净的红细胞，而影响后面血红蛋白的提取纯度。6.对在凝胶柱上加入样品和洗脱的操作，不正确的是()A.加样

21、前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐B.让吸管管口沿管壁环绕移动，贴壁加样至色谱柱顶端，不要破坏凝胶面C.打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后，直接连接缓冲液，洗脱瓶开始洗脱D.待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集流出液答案C解析打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口，再用同样的方法小心加入适量的20 mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度，然后连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，开始洗脱。7.在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程的分析正确的是()A.洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐B.洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞

22、等会沉淀，达不到分离的效果C.洗涤过程选用0.1%的生理盐水D.透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质答案D解析洗涤红细胞的目的是去除血浆中除血红蛋白以外的杂蛋白；洗涤时离心速度过大，时间过长，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果；洗涤过程选用0.9%的生理盐水。8.将处理破裂后的红细胞混合液以2 000 r/min的速度离心10 min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是()A.血红蛋白、甲苯层、脂质物质层、红细胞破碎物沉淀层B.甲苯层、红细胞破碎物沉淀层、血红蛋白、脂质物质层C.脂质物质层、血红蛋白、甲苯层、红细胞破碎物沉淀层D.甲苯层、脂质物质层、血红蛋白、红细胞破碎物沉淀

23、层答案D解析混合液经离心后按密度大小排列，在离心管中从上到下的顺序依次是：第1层为无色透明的甲苯层，第2层白色薄层固体是脂溶性物质沉淀层，第3层红色透明液体是血红蛋白水溶液，第4层暗红色沉淀物主要是红细胞破碎物沉淀。能力提升9.使用凝胶色谱法分离蛋白质实验中，相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程，可表示为图中()答案B解析相对分子质量较大的蛋白质留在颗粒外面，相对分子质量较小的蛋白质进入颗粒内部；相对分子质量大的通过凝胶间隙先被洗脱，相对分子质量小的进入凝胶内部而后被洗脱。10.蛋白质的分离与纯化是蛋白质研究的重要技术。下列有关叙述不正确的是()A.根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性，可

24、将样品中各种不同的蛋白质分离B.根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小等，可通过电泳法分离蛋白质C.根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质D.根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质答案A解析蛋白质分子是生物大分子，都不能通过半透膜，因此不能利用半透膜分离蛋白质；蛋白质分子所带电荷性质的差异及分子大小可以使蛋白质分子在电场中获得不同的迁移速度，因此可以利用电泳法分离蛋白质；蛋白质相对分子质量的大小不同，通过凝胶柱的时间不同，可通过凝胶色谱法分离蛋白质；蛋白质的分子大小、密度不同，具有不同的离心力，可通过离心沉降法分离蛋白质。11.凝胶柱制作的顺序一般是()橡

25、皮塞打孔挖凹穴装玻璃管盖尼龙网盖尼龙纱将橡皮塞插入玻璃管接尼龙管、装螺旋夹柱顶插入安装玻璃管的橡皮塞A. B.C. D.答案B解析凝胶柱制作的一般流程是：选择玻璃管选择合适的橡皮塞打孔挖凹穴盖尼龙网盖尼龙纱将橡皮塞插到玻璃管接尼龙管装螺旋夹柱顶插入安装玻璃管的橡皮塞。12.下列关于电泳的说法，不正确的是()A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程B.带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动C.蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少D.用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小答案C解析蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及

26、分子的大小等因素，SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。13.下列操作正确的是()A.分离红细胞时采用低速长时间离心B.红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水即可C.分离血红蛋白溶液是低速短时间离心D.透析时要用20 mmol/L的磷酸缓冲液，透析12 h答案D解析分离红细胞时，采用低速短时间离心，如500 r/min离心2 min；分离血红蛋白溶液时，离心时间较长，如2 000 r/min离心10 min。释放血红蛋白时，加入蒸馏水和40%体积的甲苯；透析时用物质的

27、量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液，以除去相对分子质量较小的杂质。14.血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2或CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。(1)将实验流程补充完整：A为_，B为_。凝胶色谱法是根据_而达到蛋白质分离的有效方法。(2)洗涤红细胞的目的是去除_，洗涤次数过少，无法除去_；离心速度过高和时间过长会使_一同沉淀，达不到分离的效果。洗涤干净的标志是_。释放血红蛋白的过程中起作用的是_。(3)在洗脱过程中加入物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)的目的是_。如果红色区带_，说明色谱柱制作成功。答案(1)血红蛋白

28、的释放样品的加入和洗脱相对分子质量的大小(2)杂蛋白(血浆蛋白)血浆蛋白白细胞和淋巴细胞离心后的上清液中没有黄色蒸馏水和甲苯(3)准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内一致均匀一致地移动解析凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法，在蛋白质提取与分离过程中包括样品的处理、粗分离、纯化和纯度鉴定四步，每一步均应用了不同的操作技术，需要注意。15.如图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请据图回答下列问题。(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，它在红细胞中的作用体现了蛋白质具有_功能。(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是_；乙装置中，C溶液的作用是_。(3)甲装置用于_，目的是_。用乙装置分离蛋白质的方法叫_，是根据_分离蛋白质的有效方法。(4)用乙装置分离血红蛋白时，待_时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。答案(1)运输(2)磷酸缓冲溶液洗脱血红蛋