酶工程复习资料二

1、酶（enzyme）：酶是具有生物催化功能的生物大分子，按照其化学组成，可分为蛋白类酶（P酶）和核酸类酶（R酶）酶工程：酶的生产与应用的技术过程。水活度：指体系中水的逸度与纯水逸度之比。 aw=YwXw酶的固定化：采用各种方法，将酶与水不溶性的载体结合，制备固定化酶的过程。固定化酶：固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。氨基酸置换修饰：将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法。定点突变：在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。侧链基团修饰：采用一定的方法（一般为化学法）使酶分子的侧链基团发

2、生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。金属置换修饰：把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法。大分子结合修饰：采用水溶性大分子与本科的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与功能的方法。酶的提取：在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程，也称为酶的抽提。沉淀分离：通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，从溶液中沉淀析出与其他溶质分离的技术过程。酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。盐析沉淀法：简称盐析法，是利用不同

3、蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离的过程。等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法称为等电点沉淀法。有机溶剂沉淀法：利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某些有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法称为有机溶剂沉淀法。同步合成型：酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。延续合成型：酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还

4、可以延续合成一段较长时间。中期合成型：该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随之停止。滞后合成型：在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累，又称为非生物偶联型。细胞生长曲线：在微生物的分批培养过程中，定时取样测定单位体积里的细胞数，以单位体积中的细胞数的对数为纵坐标，以培养时间为横坐标，可得到的繁殖曲线。1913年，米彻利斯和曼吞的米氏方程：1926年，萨姆纳首次从刀豆提取液中分离纯化得到脲酶结晶，并证明它具有蛋白质的性质。酶催化作用的特点：专一性强、效率高、条件温和。影响酶催化作用的因素：底物浓度、酶浓度、温度、pH值、抑制剂

5、、激活剂。抑制剂可分为竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制。竞争性抑制特点：酶催化反应的最大反应速度Vm不变，而米氏常数Km增大。非竞争性抑制特点：最大反应速度Vm减小，而米氏常数Km不变。反竞争性抑制特点：最大反应速度Vm和米氏常数Km同时减小。蛋白类酶（P酶）的分类：氧化还原酶；转移酶；水解酶；裂合酶；异构酶；合成酶（连接酶）。酶活力测定方法：化学测定法、光学测定法、气体测定法等。酶活力测定的两个阶段：1、在一定条件下，酶与底物反应一段时间；2、测定反应液中底物或产物的变化量。酶活力测定的步骤：1、根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。2、根据酶的动力学性质，确

6、定酶催化反应的温度、pH值、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。3、在一定的条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。4、反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底的减少量。酶活力单位：在特定条件下，每1min催化1mol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位（IU）或在特定条件下，每1s催化1mol底物转化为产物的酶量定义为1卡特（kat）。固定化酶的活力测定：振荡测定法、酶柱测定法、连续测定法、固定化酶的比活力测定、酶结合效率与酶活力回收率的测定、相对酶活力的测定。酶的生产方法：提取分离法、生物合成法、化学合成法。固定化细胞发酵的

7、特点：细胞密度大，可提高产酶能力；发酵稳定性好，可以反复使用或连续使用较长的时间；细胞固定在载体上，流失较少，可以在高稀释率的条件下连续发酵，利于连续化、自动化生产；发酵液中含菌体较少，利于产品分离纯化。固定化微生物原生质体发酵特点：1、固定化原生质体由于除去了细胞壁这一扩散屏障，有利于胞内物质透过细胞膜分泌到细胞外。2、采用固定化原生质体发酵，使原来存在于细胞间质中的物质，如碱性磷酸酶，游离到细胞外，变为胞外产物。3、固定化原生质体由于有载体的保护作用，稳定性好，可以连续或重复使用较长的一段时间。用于酶的生产的细胞必须具备的条件：酶的产量高；容易培养和管理；产酶稳定性好；利于酶的分离纯化；安

8、全可靠，无毒性。常用的产酶微生物：细菌（大肠杆菌、枯草杆菌）、放线菌（链霉菌）、霉菌（黑曲霉、米曲霉、红曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉）、酵母（啤酒酵母、假丝酵母）。常用的保藏方法：斜面保藏法、沙土管保藏法、真人冷冻干燥保藏法、低温保藏法、石蜡油保藏法等。微生物发酵产酶的一般工艺流程：细胞活化与扩大培养；培养基的配制；pH值的调节控制；温度的调节控制；溶解氧的调节控制。提高酶产量的措施：添加诱导物；控制阻遏物的浓度；添加表面活性剂；添加产酶促进剂。酶生物合成的模式及其特点：同步合成型（该类型酶的生物合成可以由其诱导物诱导生成，但是不受分解代谢物的阻遏作用，也不受产物的反馈阻遏作用，其对应的mRN

9、A很不稳定）、延续合成型（该类型酶的生物合成可以受诱导物的诱导，一般不受分解代谢物阻遏，其对应的mRNA相当稳定，在平衡期以后的相当长的一段时间内仍然可以通过翻译合成其所对应的酶）、中期合成型（酶的生物合成受到产物的包馈阻遏作用或分解代谢物阻遏作用，而酶所对应的mRNA稳定性较差）、滞后合成型（酶所对应的mRNA稳定性很好）。固定化细胞发酵产酶的特点：提高产酶率；可以反复使用或连续使用较长时间；基因工程菌的质粒稳定，不易丢失；发酵稳定性好；缩短发酵周期，提高设备利用率；产品容易分离纯化；适用于胞外酶等胞外产物的生产。固定化细胞发酵产酶的工艺条件及其控制：固定化细胞的预培养；溶解氧的供给；温度的

10、控制；培养基组分的控制。固定化原生质体的特点：变胞内产物为胞外产物；提高酶产率；稳定性较好；易于分离纯化。固定化原生质体发酵产酶的工艺条件及其控制：渗透压的控制；防止细胞壁再生；保证原生质体的浓度。植物细胞培养的特点：提高产率；缩短周期；易于管理，减轻劳动强度；提高产品质量等。植物细胞培养的工艺流程：外植体的选择与处理；植物细胞的获取；细胞悬浮培养；分离纯化。工艺条件及其控制：温度的控制；pH值的控制；溶解氧的调节控制；光照的控制；前体的添加；刺激剂的应用。植物细胞培养产酶的工艺流程：植物愈伤组织的诱导；植物细胞悬浮培养；超氧化氧化物歧化酶的分离纯化。动物细胞培养的特点：动物细胞培养主要用于各

11、种功能蛋白质的生产；动物细胞的生长较慢，细胞倍增时间15100h；为了防止微生物污染，在培养过程中，需要添加抗生素；动物细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感，所以在培养过程中，必须严格控制温度、pH值、渗透压、通风搅拌等条件，以免破坏细胞；大多数动物细胞具有锚地依赖性，适宜采用帖壁培养；部分细胞可采用悬浮培养。动物细胞培养成分较复杂，一般要添加血清或其代用品，产物的分离纯化过程较繁杂，成本较高，适用于高价值药物的生产。原代细胞继代培养50代后，即会退化死亡，需要重新分离细胞。动物细胞培养的方式：悬浮培养；帖壁培养；固定化细胞培养。动物细胞培养的工艺过程：将种质细胞用胰蛋白酶消化处理，分散成悬

12、浮细胞；再将悬浮细胞前所未有入适宜的培养液中，在人工控制条件的反应器中进行细胞悬浮培养或者贴壁培养；培养完成后，收信培养液，分离纯化得到所需产物。动物细胞培养的工艺条件及其控制：动物细胞培养基的组成成分（氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、激素、生长因子）；动物细胞培养基的配制；温度的控制；pH值的控制；渗透压的控制；溶解氧的控制。细胞破碎：机械破碎法（捣碎法、研磨法、匀浆法）；物理破碎法（温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法）；化学破碎法；酶促破碎法。酶提取的方法：盐溶液提取；酸溶液提取；碱溶液提取；有机溶剂提取。影响酶提取的主要因素：温度；pH值；提取液的体积。沉淀分离的方法：盐析沉淀法、

13、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法、选择性变性沉淀法等。过滤根据过滤介质的不同，可分为膜过滤（大部分微滤、超滤、反渗透、透析、电渗析）和非膜过滤（粗滤和部分微滤）。根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同，可分为粗滤、微滤、超滤、反渗透。根据推动力的产生条件不同，过滤有常压过滤、加压过滤、减压过滤等。膜分离技术：加压膜分离（微滤、超滤、反渗透）；电场膜分离（电渗析、离子交换膜电渗析）；扩散膜分离。层析分离：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析、层析聚焦。电泳分离：纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、等电噗聚焦电泳。酶分子修饰的作用：通过酶分子修饰，可以使酶分子结构发生某些改变

14、，就有可能提高酶的活力，增强酶的稳定性，降低或消除酶的抗原性等；通过酶分子修饰，研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响，可以进一步探讨其结构与功能之间的关系。酶分子修饰的分类：金属离子置换修饰；大分子结合修饰；侧链基团修饰；肽链有限水解修饰；核苷酸链有限水解修饰；氨基酸置换修饰；核苷酸置换修饰；酶分子的物理修饰等。金属离子置换修饰的方法（过程）：酶的分离纯化；除去原有的金属离子；加入置换离子。金属离子置换修饰的作用：阐明金属离子对酶催化作用的影响；提高酶活力；增强酶的稳定性；改变酶的动力学特性。大分子结合修饰的方法：修饰剂的选择；修饰剂的活化；修饰

15、；分离。大分子结合修饰的作用：通过修饰提高酶活力；通过修饰可以增强酶的稳定性；通过修饰降低或消除酶蛋白的抗原性。侧链基团修饰方法：氨基修饰；羧基修饰；巯基修饰；胍基修饰；酚基修饰；咪唑基修饰；吲哚基修饰；分子内交联修饰。氨基酸置换修饰的作用：通过修饰可以提高酶活力；通过修饰可以增强酶的稳定性；通过修饰可以使酶的专一性发生改变。定位突变技术用于酶分子修饰的主要过程：新的酶分子结构的设计；突变基因碱基序列的确定；突变基因的获得；新酶的获得。酶的固定化方法：吸附法、包埋法、结合法、交联法、热处理法。固定化酶的特性：稳定性；最适温度；最适pH值；底物特异性。固定化酶的稳定性表现在：1、对热的稳定性提高

16、，可以耐受较高的温度。2、保存稳定性好，可以在一定条件下保存较长时间。3、对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解。4、对变性剂的耐受性提高，在尿素、有机溶剂和盐酸胍等蛋白质变性剂的作用下，仍可保留较高的酶活力等。固定化酶的最适温度表现在：1、固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大；2、有些固定化酶的最适温度与游离酶比较会有较明显的变化；3、同一种酶，在采用不同的方法或不同的载体进行固定化后，其最适温度也可能不同。原生质体固定化的制备原则:必须将微生物细胞和植物细胞的细胞壁破坏而分离出原生质体；同时要在破坏细胞壁的时候，不能影响到细胞膜的完整性，更不能使细胞内部的结构受到破坏

17、。只能使用对细胞壁有专一性作用的酶。原生质体的制备过程：将对数生长期的细胞收集起来，悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中；加入适宜的细胞壁水解酶，在一定的条件下作用一段时间，使细胞壁破坏；分离除去细胞壁碎片、未作用的细胞以及细胞壁水解酶，而得到原生质体。为防止制备得到的原生质体破裂，应加入适当的渗透压稳定剂，注意所加入的化合物对细胞和原生质体无毒性，不会影响溶菌酶等细胞壁水解酶的活性，而且对原生质体的代谢产物没有显著的不良的影响。原生质体固定化的方法：琼脂-多孔醋酸纤维素固定化法、海藻酸钙凝胶固定化法、角叉菜胶固定化法、光交联树脂固定化法。固定化原生质体的特点：1、固定化原生质体由于解除了细胞

18、壁这一扩散屏障，可增加细胞膜的通透性，有利于氧气和营养物质的传递和吸收，也有利于胞内物质的分泌，可显著提高产率。2、固定化原生质体由于有载体的保护作用，具有较好的操作稳定性和保存稳定性，可反复使用和连续使用较长的时间，利于连续化生产。在冰箱保存较长时间后仍能保持其生产能力。3、固定化原生质体易于和发酵产物分开，有利于产物的分离纯化，提高产品质量。4、固定化原生质体发酵的培养基中需要添加渗透压稳定剂，以保持原生质体的稳定性。这些渗透压稳定剂在发酵结束后，可用层原或膜分离技术等方法与产物分离。固定化原生质体的应用：氨基酸的生产；胞内酶的生产；生物碱的生产；甾体转化；木质素降解。酶的非水相催化主要包括：有机介质中的酶催化；气相介质中的酶催化；超临界流体介质中的酶催化；离子液介质中的酶催化。水对有机介质中酶催化的影响：水对酶分子空间构象的影响；水对酶催化反应速度的影响；水活度。有机溶剂对有机介质中酶催化的影响：有机溶剂对酶结构与功能的影响；有机溶剂对酶活性的影响；有机溶剂对底物产物分配的影响。酶在有机介质中的催化特性：底物专一性；对映体选择性；区域选择性；键选择性；热稳定性；pH值特性。酶反应器的类型：搅拌罐式反应器；填充床式反应器；流化床反应器FBR；鼓泡式反应器BCR；膜反应器MR；喷