探讨维甲酸诱导HAEC在体外分化为神经样细胞的最适浓度

1、 精选公文范文管理资料 探讨维甲酸诱导HAEC在体外分化为神经样细胞的最适浓度目前，国内外研究多集中于干细胞向神经细胞分化的研究，而对体细胞的研究相对较少。干细胞存在伦理学、免疫排斥以及潜在的致瘤性等问题限制了其在临床上的应用，而具有部分胚胎干细胞特性的人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells，HAEC)不存在上述问题，从而为细胞治疗提供了新的选择。HAEC是一种来源于人胎盘羊膜组织的上皮层体细胞。研究显示HAEC具有部分胚胎干细胞特性，即在体外培养下具有向3个胚层分化的潜能：内胚层(胰腺细胞、肝细胞)、中胚层(心肌细胞)和外胚层(神经细胞、肌细胞、心肌细

2、胞，骨细胞，脂肪细胞，胰腺细胞，肝细胞)。细胞生活的微环境在分子水平决定了细胞的分化方向，因此在维甲酸诱导体外培养的HAEC向神经样细胞分化的过程中，选择最佳维甲酸干预浓度是决定成功与否的关键。本实验通过细胞形态学分析和检测细胞内巢蛋白(nestin)、微管相关蛋白2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和转录因子Oct-4表达，探讨维甲酸诱导HAEC在体外分化为神经样细胞的最适浓度，为HAEC在细胞移植中的应用奠定基础。材料与方法材料与试剂 羊膜标本由复旦大学附属中山医院妇产科提供，本研究经产妇本人签署知情同意书，并经中山医院伦理委员会同意。DMEM/F12、特级胎牛血清、PBS缓冲液

3、、青霉素-链霉素双抗溶液、0.25%胰蛋白酶+0.02EDTA (GibcoLtd，美国)。型胶原酶、Dnase 酶(Sigma Ltd，美国)。鼠抗人vimentin 单克隆抗体(SR0746，EpitomicsInc，美国)。鼠抗人CK-19抗体(BM0033)、兔抗人Nestin多抗(BA1289)、鼠抗人MAP-2多抗(BM1243)、兔抗人GFAP多抗(BA0056)(武汉博士德生物工程有限公司，中国)。兔抗人Oct-4多抗(MAB4305) (Millipore Ltd，美国)。100、200、300、400筛网(上海瑞谷生物科技有限公司，中国)。羊膜组织提取和处理HIV、梅毒、乙

4、肝等血清学反应阴性的足月剖宫产后胎盘，胎盘娩出后，无菌条件下24 h将羊膜与绒毛膜分离，并将羊膜置于DMEM/F12 培养液内保存。羊膜上皮细胞的原代培养应在羊膜取得后6 h内进行。原代HAECs 培养将5 cm5 cm大小的羊膜置于含有双抗(100 UmL-1青霉素、100 UmL-1链霉素)的PBS 中反复冲洗 3次。然后放入不加血清的DMEM/F12培养基中漂洗3次。将漂冼后的羊膜用眼科剪剪成数小块；再将组织块反复剪成1 mm1 mm大小。取10 mL羊膜组织悬液，按14比例加入0.25%的型胶原酶，并置于37恒温振荡孵箱内消化2 h后，1 000 rmin-1离心5 min，吸出上清液

5、(含胶原酶消化液)。再加入等体积0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA室温下消化15 min，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化。1 000rmin-1离心5 min，去上清，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基清洗后，将细胞悬液依次通过100、200、300、400 目筛网过滤，细胞计数，然后将细胞以 1 107个/mL 密度的 HAECs 悬液 2 mL 接种于 25 mL 培养瓶中，置5%CO2、37培养箱内培养。倒置显微镜动态观察细胞形态变化及生长增殖情况。3 d后首次换液，以后根据细胞生长情况，隔天换液，每次换液时去除非贴壁细胞。待34 d 后细胞融合长满时，用

6、0.25% 胰蛋白酶消化，按12 或13 比例进行传代，倒置显微镜观察，待细胞铺满瓶底时，重复上述操作。原代HAECs的鉴定取第3代HAECs制作细胞爬片。常温下将细胞爬片用PBS漂洗3 min，3次；4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3 min，3次；0.2%TritonX-100 破膜 20 min，PBS 漂洗 3 min， 3 次；加入正常的山羊血清室温下封闭30 min，PBS漂洗3 min，3次；加入鼠抗人CK19(1100)抗体和鼠抗人vimentin(1100)抗体，37孵育2 h，PBS漂洗3 min，3次；加入辣根过氧化酶标记的二抗，37孵育30min，PBS洗3mi

7、n，3次；DAB暗环境下显色；自来水冲洗，苏木精复染2 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。倒置显微镜下观察并摄像。对照组用PBS代替一抗。不同浓度维甲酸诱导HAECs向神经样细胞分化 消化收集第3 代HAECs 制成细胞爬片，待细胞生长至60%70% 融合时(对照组用含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养基培养)，各维甲酸组去除培养基，加入含不同浓度维甲酸的DMEM/F12诱导液(内含10%胎牛血清)。实验分组 共分为5组：对照组，含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基处理，不含维甲酸；110-8molL-1维甲酸组含110-8molL-1维甲酸DMEM/F12培养基(

8、含10胎牛血清)；110-7molL-1维甲酸组含1 10-7molL-1维甲酸DMEM/F12培养基(含10%胎牛血清)；110-6molL-1维甲酸组含110-6molL-1维甲酸的DMEM/F12培养基(含10% 胎牛血清)；1 10-5molL-1维甲酸组含110-5molL-1维甲酸的DMEM/F12 培养基(含 10% 胎牛血清)。每天换液，换液时去除非贴壁细胞，共诱导7 d。不同浓度维甲酸诱导HAECs分化后Nestin免疫组化染色取出细胞爬片。常温下，将细胞爬片PBS漂洗3 min，3次；4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3 min， 3 次；0.2%TritonX-10

9、0 破膜 20 min，PBS 漂洗3 min，3 次；加入正常的山羊血清，室温下封闭30 min，PBS 漂洗 3 min， 3 次；加入兔抗人 Nestin 抗体(1100)，37孵育2 h，PBS 漂洗3 min，3 次；加入辣根过氧化酶标记的二抗，37孵育30 min，PBS漂洗3 min，3次；DAB暗环境下显色；自来水冲洗，苏木精复染2 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。倒置显微镜下观察细胞并摄像，Nestin标记的神经样阳性细胞呈棕褐色。不同浓度维甲酸诱导HAECs分化后MAP-2免疫组化染色取出细胞爬片。常温下，将细胞爬片PBS漂洗3 min，3次；4%多聚甲醛固

10、定10 min，PBS漂洗3 min， 3 次；0.2%TritonX-100 破膜 20 min，PBS漂洗3 min，3次；加入正常的山羊血清室温下封闭30 min，PBS 漂洗 3 min， 3 次；加入兔抗人 MAP-2抗体(1100)，37孵育2 h，PBS漂洗3 min，3次；加入辣根过氧化酶标记的二抗，37孵育30 min，PBS漂洗3 min，3次；DAB暗环境下显色；自来水冲洗，苏木精复染2 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。倒置显微镜下观察细胞并摄像，MAP-2标记的神经样阳性细胞呈棕褐色。不同浓度维甲酸诱导HAECs分化后GFAP免疫组化染色取出细胞爬片。常

11、温下，将细胞爬片PBS漂洗3 min， 3 次；4% 多聚甲醛固定 10 min，PBS 漂洗 3min， 3 次；0.2%TritonX-100 破膜 20 min，PBS 漂洗3 min，3次；加入正常的山羊血清室温下封闭30 min，PBS漂洗3 min，3次；加入兔抗人GFAP抗体(1100)，37孵育 2 h，PBS 漂洗 3 min， 3 次；加入辣根过氧化酶标记的二抗，37孵育30 min，PBS漂洗3 min，3 次；DAB 暗环境下显色；自来水冲洗，苏木精复染 2min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。倒置显微镜下观察细胞并摄像，GFAP标记的神经样阳性细胞呈棕褐色。

12、不同浓度维甲酸诱导HAECs分化过程中Oct-4免疫组化染色取出细胞爬片。常温下将细胞爬片PBS洗3min，3次；4% 多聚甲醛固定10 min，PBS洗 3 min，3 次；0.2%TritonX-100 破膜 20 min，PBS 洗 3 min，3 次；加入正常的山羊血清室温下封闭 30 min，PBS 洗3 min， 3 次；加入兔抗人 Oct-4 抗体(1100)，37孵育2h，PBS洗3 min，3 次；加入辣根过氧化酶标记的二抗，37孵育30 min，PBS 洗3 min，3次；DAB暗环境下显色；自来水冲洗，苏木精复染2 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。倒置显微

13、镜下观察细胞并摄像，Oct-4标记的神经样阳性细胞呈棕褐色。图像分析 随机取10 个不同视野(100)，以每个视野内阳性细胞数为量化指标，每组视野阳性细胞数量作为该组HAECs 诱导分化为神经样阳性细胞密度代表值，以阳性细胞数/100倍视野表示。统计学方法 采用SPSS17.0 统计软件进行统计学分析。各组计量资料以 s表示。各组间比较采用单因素方差分析，以=0.05为检验水准，P结 果体外培养 HAECs 细胞的生长特性 倒置显微镜下观察细胞在贴壁前轮廓清晰、体积较小、圆形、透亮、折光性较强、富有立体感。接种23 d后贴壁，细胞逐渐变大，折光性降低，整个细胞轮廓变暗，完全伸展的细胞形态多样，

14、呈梭形、多角形、眼睛样等，轮廓清晰，胞质丰富，胞核居中，可见12个核仁，呈圆形、卵圆形。接种3 d后，人羊膜上皮细胞进入指数生长期，细胞数量明显增多，呈不规则多角形。接种57 d时90%细胞融合成片，形成单层放射状或漩涡状生长，开始进行传代。传代6 h 后即可贴壁，细胞34 d融合长满，形成单层放射状或漩涡状单层细胞。传至25代，细胞形态、大小、活性均匀一致。传至6代以后少数细胞形态发生变化，呈不规则形，细胞增殖减慢。传至第8代细胞胞质内出现空泡和黑色颗粒，细胞增殖能力减弱，逐渐停滞生长，凋亡并从瓶壁脱落。第3代细胞融合后数量恒定，符合实验要求，取第3代细胞作为实验对象。体外培养细胞的来源鉴定

15、 上皮细胞标记物CK19标记的贴壁细胞胞质内有大量棕褐色物质，胞核呈蓝紫色(图 1A)；间质细胞标记物波形蛋白(vimentin)标记的贴壁细胞胞质内仅有少量棕褐色物质，胞核呈蓝紫色(图1C)。不同浓度维甲酸对HAECs分化作用的影响1.不同浓度维甲酸组HAECs分化的形态学变化：对照组细胞形态未发生改变；110-8molL-1维甲酸组少数细胞形态有所改变，胞质回缩，胞体伸出轴突样长突起；1 10-7molL-1维甲酸组部分细胞形态发生改变，出现双极或多级细胞，少数细胞在突出末端出现分支；110-6molL-1维甲酸组出现较多双极或多级细胞，部分细胞出现突起并相互连接成网；110-5molL-

16、1维甲酸组细胞胞质出现空泡或黑色颗粒状物，大量细胞固缩脱落。2. 免疫组化法检测不同浓度维甲酸组HAECs诱导分化细胞的Nestin 阳性细胞(图2，3)表达率：对照组为(12.120.37)%，110-8molL-1维甲酸组为(15.130.28)%，1 10-7molL-1维甲酸组为(17.561.15)%，1 10-6molL-1维甲酸组为(20.980.95)%，110-5molL-1维甲酸组为(19.203.12)%。不同浓度维甲酸组与对照组比较，均差异有显著统计学意义(P3. 免疫组化法检测不同浓度维甲酸组HAECs诱导分化细胞的MAP-2 表达率(图2，3)：对照组为(14.12

17、 1.04)%，1 10-8molL-1维甲酸组为(22.811.32)%，110-7molL-1维甲酸组为(24.211.65)%，110-6molL-1维甲酸组为(29.56 1.35)%，110-5molL-1维甲酸组为(24.343.85)%。不同浓度维甲酸组与对照组比较，均差异有显著统计学意义(P4. 免疫组化法检测不同浓度维甲酸组HAECs诱导分化细胞的 GFAP 表达率(图2，3)：对照组为(11.23 0.26)%，1 10-8molL-1维甲酸组为(13.210.60)%，110-7molL-1维甲酸组为(15.631.18)%，110-6molL-1维甲酸组为(22.691

18、.62)%，110-5molL-1维甲酸组为(15.79 3.31)%。不同浓度维甲酸组与对照组比较，均差异有显著统计学意义(P5. 免疫组化法检测不同浓度维甲酸组HAECs诱导分化细胞的 Oct-4 表达率(图 2，3)：对照组为(25.23 3.12)%，1 10-8molL-1维甲酸组为(18.121.23)%，110-7molL-1维甲酸组为(12.650.52)%，110-6molL-1维甲酸组为(10.020.28)%，110-5molL-1维甲酸组为(9.652.03)%。不同浓度维甲酸组与对照组比较，均差异有显著统计学意义(P讨 论HAECs为人体正常细胞，其能够在体外大量培养

19、且被诱导分化为不同类型的细胞5，且HAECs还具有低免疫原性、不具致瘤性及无伦理法律问题等优点4，为治疗神经系统退行性疾病和外伤性神经损伤带来新的契机。但目前维甲酸诱导HAECs 分化的研究仍不十分完善，本研究拟探索不同浓度维甲酸对HAECs的诱导分化作用，从而确定其最适浓度，为HAECs在临床治疗神经系统疾病提供理论基础。Takashima 等研究发现：新鲜分离的HAECs能够表达抗胰蛋白酶、CPS-I、CYP2D6、CYP3A4等肝细胞功能基因及 HNF-3、HNF-4、C/EBP-、HNF-1等转录因子，在加入110-7molL-1地塞米松和0.1 ?molL-1胰岛素诱导1周后，上述功

20、能基因随诱导天数增加表达也逐渐增强。此外，还发现诱导后的HAECs能够合成并分泌白蛋白、储备糖原的功能，这正是肝细胞所具有的典型功能。Miki等研究发现：HAECs加入10 mmolL-1尼克酰胺悬浮培养14 d后，可检测到胰岛发育、胰岛功能基因，如胰腺十二指肠同源盒(PDX1)、神经源素3(Ngn3)、同源异形盒转录因子6(PDX6)、胰岛素、胰高血糖素的表达，且随着培养基中葡萄糖浓度的升高，胰岛素分泌也增加，证实HAECs可向胰腺样细胞分化。Miki 等还发现：HAECs在加入1 mmolL-1抗坏血酸磷酸盐培养14 d 后，可以检测到心肌特异性基因表达，如转录因子Nkx2.5和GATA-4及房、室肌球蛋白轻链2(MLC-2A，MLC-2V)。此外免疫组织化学染色检测到-辅肌动蛋白和特异性结蛋白等肌系细胞标志物，证实HAECs体外诱导下也可表现出心肌细胞的特性。多项研究发现1316，HAECs表达神经元特异性标记物MAP-2、神经胶质标记物GFAP和神经干细胞标志物