易宁更年颗粒制备工艺、质量控制及初步药效学研究

1、易宁更年颗粒制备工艺、质量控制及初步药效学研究更年期 (Menopause)通常是指卵巢功能旺盛状态逐渐衰退直至完全消失的一个过渡时期 , 而更年期综合征 (Menopausal syndrome, MPS) 则是大多数妇女在更年期随着月经周期、 激素水平等的变化所导致的一系列以自主神经系统功能紊乱为主 , 且伴有神经心理症状的一组症候群。 在此期间 , 随着性激素水平的变化大多数妇女都会伴有不同程度的疾病, 如：月经失调、抑郁、情绪波动大、乳腺癌、烦躁失眠、性器官性功能减弱、免疫功能下降等一系列综合征。并且随着社会发展节奏和人口老龄化的提高, 越来越多的人们受到更年期综合征疾病的影响。本研究

2、中的易宁更年方为一经验方, 由女贞子、墨旱莲、哈蟆油、当归和川芎五味药材组成, 具有补肾益精、 滋阴养血、行气开郁的功效 , 用于女性进入围绝经期或卵巢功能下降导致的一系列症状。且该方一直以汤剂用于临床, 治疗妇女围绝经期综合征具有很好的疗效。由于其存在服用不便 , 剂量不准 , 质量不稳定等不足而导致不能进一步推广。本研究选用的颗粒剂服用、储运、携带方便, 服用量减少 , 且质量稳定 , 适合机械化生产。因此 , 拟根据药材主要有效成分对处方药物进行提取, 浓缩 , 制成颗粒剂 , 建立其质量标准并进行药效学初步研究。目的结合传统中医药理论和现代化实验技术优化易宁更年颗粒(YiningGen

3、gnian Granules,YNGN)的制备工艺；建立易宁更年颗粒的质量标准；观察成品的初步稳定性； 建立小鼠免疫低下模型评价工艺改变前后药效学的差异：为该制剂的工艺优化以及进一步的临床研究提供可靠的理论依据。方法1. 易宁更年颗粒工艺优化本研究根据药材的主要功效成分, 选取高效液相色谱法 (HPLC法)测定特女贞苷含量 , 以特女贞苷含量和浸膏得率为综合评价指标, 通过正交试验筛选墨早莲和女贞子药材浸泡时间、加水量、提取时间与提取次数； 根据当归和川芎挥发油的提取量考察加水量、 粒度、提取时间对水蒸气蒸馏提取工艺的影响：为保持挥发油的性质采用环糊精进行包合, 并根据包合前后挥发油利用率筛选

4、包合工艺的环糊精和挥发油的加入比例、包合温度和包合时间；最后将药液合并,浓缩 , 干燥 , 选择合适的辅料将得到的各中间体进行合并制粒, 并根据相关规定对颗粒休止角、 堆密度、临界相对湿度等进行验证；采用免疫低下模型小鼠对工艺改变前后的免疫功能药效学进行初步比较。2. 易宁更年颗粒质量标准根据中国药典 2010 版一部要求 , 采用薄层色谱法 (TLC) 进行女贞子、当归和墨早莲进行定性鉴别。同上根据中国药典2010版一部要求 , 采用 HPLC法进行哈蟆油定性鉴别和特女贞苷的含量测定。哈蟆油定性鉴别色谱条件分别为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(AgilentHC-C18柱) ；水为流动相；

5、检测波长为 215nm。色谱柱：流速：0.7ml/min 。检测时间 30min。理论板数按 1- 甲基海因峰计算应不低于2000。特女贞苷含量测定色谱条件为： 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(AgilentHC-C18柱), 以甲醇 - 水(35 ：65) 为流动相 , 检测波长为 224nm,流速为 1.0ml/min,检测时间 30min, 柱温为 30。初步稳定性：取模拟市售包装的成品制剂在室温条件下放置三个月 , 分别取 0 个月、 1 个月、 2 个月、 3 个月这四个时间点 , 在相同的色谱条件下进行含量测定。根据中国药典 2010 版检查颗粒剂的一般考察项目：如性状、粒度、水分

6、、溶化性、装量差异、重金属和砷盐等。3. 易宁更年颗粒初步药效学选用昆明种雌性小鼠 , 采用前三天连续腹腔注射环磷酰胺(80mg/kg)(CY), 后每周强化注射一次的方法建立小鼠免疫低下模型。试验动物分组及给药剂量分别为：模型组 ( 等体积的溶剂 ) 、易宁更年颗粒高剂量组 ( 含生药材 9.6 g/kg) 、中剂量组 ( 含生药材 6.4 g/kg) 、低剂量组 ( 含生药材 3.2 g/kg)、原工艺汤剂组 ( 含生药材 6.4 g/kg)和阳性对照组 (3.3 g/kg),造模的同时开始灌胃给药 , 每天一次 , 连续给药 15 天 (d) 后, 分别观察原工艺汤剂组、模型组、阳性药物

7、组及高、 中、低剂量易宁更年颗粒对免疫低下模型小鼠各项指标的影响。免疫器官脏器指数：给药15d 后, 禁食 12 小时 , 称重 , 处死 , 剥取脏器称重；碳粒廓清功能：末次给药 1h 后、尾静脉注射稀释后的印度墨汁, 于 2 min、10 min 后内眦采血 , 置于 0.1%碳酸钠溶液中 , 于 600nm处测定吸光度。脾淋巴细胞转化试验： 末次给药后无菌取脾 , 调整细胞浓度后于37孵箱孵育 68h 后加入刀豆蛋白4h 后于 490 nm 处测定吸光度；血清溶血素水平：给药7d 后, 用鸡红细胞进行免疫 , 末次给药后 , 眼眶采血、分离血清 , 加入一定量的鸡红细胞和补体进行培育 ,

8、 于 540 nm处测定吸光度： NK细胞活性：无菌取脾 , 调整细胞浓度、加入MTT作为对照进行培育 , 最后于 490 nm 处测定吸光度。结果1.易宁更年颗粒工艺优化墨旱莲和女贞子正交设计水提取优化结果为：称取一定量的女贞子和墨旱莲浸泡0.5 h, 第一次加水量为 10 倍量 , 提取 2h, 第二次加水为 8倍量 , 提取 1 h, 过滤 , 合并两次滤液；当归和川芎挥发油提取和包合优化结果为：将当归和川芎饮片一起合提, 加 5 倍量水提取 5 小时收集挥发油与滤液 , 滤液过滤后与女贞子和墨早莲滤液合并；当归、川芎挥发油包合最佳工艺为：-CD：油为 8：1 时, 在 40下搅拌 3

9、h, 放冷后于 4冰箱静置 24 h, 抽滤 , 干燥；将所有药液进行混合、浓缩、干燥 , 合并挥发油包合物和哈蟆油细粉 , 加入 15%比例的预胶化淀粉作为辅料 , 用 95%的乙醇制粒得到成品。2. 易宁更年颗粒质量标准TLC定性鉴别供试品中女贞子、 墨旱莲、当归的斑点清晰 , 且阴性无干扰 , 具有良好的专属性。哈蟆油的HPLC法鉴别供试品与对照品 1- 甲基海因峰相对应出有峰, 阴性无干扰 , 专属性良好。采用 HPLC法测定易宁更年颗粒中特女贞苷的含量, 结果为每袋含量不少于25 mg。方法学验证结果显示：方法准确、稳定、重现性好, 能够有效地分离供试品中的各成分 , 该方法具有良好

10、的专属性。稳定性考察结果显示： 三个月内薄层鉴别、 颗粒剂常规项目检查、 含量检查指标均符合要求 , 且特女贞苷含量基本保持稳定。颗粒剂常规检查项目结果：休止角小于 30, 堆密度为 0.49, 流动相良好；水分均低于6%；粒度考察不能过一号筛和能过 5 号筛总共不超过15%；融化性检查结果显示其在5 分钟内能很好的溶解 , 并呈混悬状态；吸湿性在 60%以下时较好：装量差异根据成品规格小于7%：重金属和砷盐检测结果显示供试品中砷盐的斑点比标准砷斑浅, 重金属溶液的颜色较标准液浅。3. 易宁更年颗粒初步药效学采用腹腔注射一定剂量环磷酰胺能够有效抑制小鼠的免疫系统功能 , 成功地建立免疫低下小鼠

11、模型：对于选取的免疫低下模型小鼠免疫学功能指标显示： 易宁更年颗粒不同剂量组能够有效地提高免疫低下小鼠的胸腺指数；增强免疫低下小鼠的碳粒廓清功能 , 促进刀豆蛋白 A(ConA)诱导的脾淋巴细胞转化能力 , 提高血清溶血素水平和天然杀伤细胞 (NK 细胞 ) 活性。且在拟定的临床给药 20 倍剂量组优选后的易宁更年颗粒比原汤剂组各免疫学功能指标均提高；较模型组各指标有所提高且具有统计学差异 (P<0.05), 虽然较阳性药物组略低 , 但无统计学差异 (P>0.05) 。结论通过正交试验筛选的易宁更年颗粒制备工艺优化方案较原工艺其主要功效成分特女贞苷含量有明显的增加 , 药效学试验也进一步验证了优选工艺的科学性；所建立的HPLC法准确、稳定、专属性和重现性好；能够作为易宁更年颗粒中特女贞苷含量的测定方法； 质量标准中的定性鉴别具有良好的专属性和重现性；初步药效学研究表明： 通过