菌种的传代与保藏

1、一、菌种保藏的意义一、菌种保藏的意义 菌菌 种种培培 养养 基基 保存温保存温 度度 传传 种种 时时 间间 细细 菌菌 一般多用于营养琼脂一般多用于营养琼脂 或根据菌种规定选用或根据菌种规定选用 培养基培养基 46 芽孢杆菌芽孢杆菌36个月，个月， 其它细菌每个月其它细菌每个月 酵母菌酵母菌 一般用麦芽汁琼脂或一般用麦芽汁琼脂或 麦芽汁酵母膏琼脂麦芽汁酵母膏琼脂 46一般一般46个月个月 丝状真丝状真 菌菌 一般用PDA琼脂、蔡 氏琼脂或麦芽汁琼脂 等 46 每每 4 个 月 移 植 一 次个 月 移 植 一 次 （每（每2个月移植一次个月移植一次） （3）特点：）特点： 优点是优点是简便，

2、易于推广；一般不需简便，易于推广；一般不需 要另选择保藏用培养基；对大多数微生物都要另选择保藏用培养基；对大多数微生物都 适用。适用。 缺点是缺点是保藏期较短；传代次数多易保藏期较短；传代次数多易 发生变异及污染。发生变异及污染。 菌菌 种种 菌株数菌株数 保存时间保存时间 （年）（年） 存活率存活率 （%） 细菌细菌 霉菌霉菌 酵母菌酵母菌 放线菌放线菌 87 586 400 380 5 5 2 4 20.9 83.6 88.9 91.3 3. 将沾有少量液体石蜡的接种针浸于将沾有少量液体石蜡的接种针浸于 95%酒精中片刻，再烧灼灭菌，以免直接酒精中片刻，再烧灼灭菌，以免直接 在酒精灯下烧灼

3、时，液体石蜡四溅，引起在酒精灯下烧灼时，液体石蜡四溅，引起 污染。污染。 4. 液体石蜡在菌种管中高出培养基的液体石蜡在菌种管中高出培养基的 高度要严格控制，如太多，会影响菌种交高度要严格控制，如太多，会影响菌种交 换气体，使保藏效果不好；如太少，斜面换气体，使保藏效果不好；如太少，斜面 容易干燥，将缩短保藏期。一般以高出斜容易干燥，将缩短保藏期。一般以高出斜 面面1 为宜。为宜。 5. 制备无菌液体石蜡时，每管装量不制备无菌液体石蜡时，每管装量不 能太多，否则分装到菌种培养基中易造成能太多，否则分装到菌种培养基中易造成 污染。污染。 半固体琼脂培养基（半固体琼脂培养基（0.5%） 液体石蜡保

4、存液体石蜡保存 1 菌种的复苏菌种的复苏 参考流程：参考流程： 把冻干菌种管、灭菌滴管、双碟、镊子、营养肉把冻干菌种管、灭菌滴管、双碟、镊子、营养肉 汤培养基、灭菌生理盐水、营养琼脂斜面数支，移入汤培养基、灭菌生理盐水、营养琼脂斜面数支，移入 接种室或净化工作台。接种室或净化工作台。 先用砂轮将冻干菌种安瓶颈部挫出刻痕先用砂轮将冻干菌种安瓶颈部挫出刻痕,再将冻再将冻 干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75% 乙醇棉乙醇棉 擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种 管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌滴管

5、吸取管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌滴管吸取 灭菌生理盐水，滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷灭菌生理盐水，滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷 而炸裂。而炸裂。 取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开， 放入灭菌双碟内，另取放入灭菌双碟内，另取1支灭菌滴管，在火焰旁支灭菌滴管，在火焰旁 吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌 搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至营养搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至营养 肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已 接种的营养肉

6、汤置接种的营养肉汤置3537培养培养2224 h。 取出培养物，接种至营养琼脂斜面于取出培养物，接种至营养琼脂斜面于3535 3737培养培养222224h24h，取出后仔细观察菌苔形态、，取出后仔细观察菌苔形态、 有无杂菌、涂片、革兰氏染色镜检，呈典型菌落有无杂菌、涂片、革兰氏染色镜检，呈典型菌落 后，转种后，转种3 代即可应用。如发现菌型不典型，可代即可应用。如发现菌型不典型，可 进行平板分离单菌落。进行平板分离单菌落。 方法方法2：菌斜面：菌斜面 营养肉汤营养肉汤 分离平板分离平板 菌斜面菌斜面 如果菌落形态不典型可纯化，按下列方法传代如果菌落形态不典型可纯化，按下列方法传代 （分离菌落

7、）（分离菌落） ： 用接种环取上述菌管（斜面）菌苔少许接种置用接种环取上述菌管（斜面）菌苔少许接种置 营养肉汤中营养肉汤中(已灭菌已灭菌), 置置3537培养培养1824小时后，小时后， 再用接种环取培养好的营养肉汤菌悬液（浓菌液），再用接种环取培养好的营养肉汤菌悬液（浓菌液）， 接种于分离平板，置接种于分离平板，置3537培养培养1824小时，用接小时，用接 种针选典型菌落划线于营养琼脂斜面，置种针选典型菌落划线于营养琼脂斜面，置3537培培 养养1824小时。一般同时接种几支管，其中一支用于小时。一般同时接种几支管，其中一支用于 以后菌种传代或接种到半固体琼脂培养基中，其它以后菌种传代或接

8、种到半固体琼脂培养基中，其它 用做工作菌种。用做工作菌种。 l金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌甘露醇氯化钠琼脂培养基甘露醇氯化钠琼脂培养基 l金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有黄色环金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有黄色环 l沙门菌沙门菌SS琼脂平板琼脂平板 l无色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落无色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落 菌种菌种 菌种菌种工作菌种培养工作菌种培养 基基 菌悬液菌悬液对照菌液对照菌液 大肠杆菌大肠杆菌营养琼脂斜面营养琼脂斜面营养肉汤营养肉汤 0.9%氯化钠溶氯化钠溶 液液 沙门菌沙门菌营养琼脂斜面营养琼脂斜面营养肉汤营养肉汤 0.9%氯化钠溶氯化钠溶 液液 金黄色葡

9、萄球金黄色葡萄球 菌菌 营养琼脂斜面营养琼脂斜面营养肉汤营养肉汤 0.9%氯化钠溶氯化钠溶 液液 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌营养琼脂斜面营养琼脂斜面营养肉汤营养肉汤 0.9%氯化钠溶氯化钠溶 液液 生孢梭菌生孢梭菌 硫乙醇酸盐流体硫乙醇酸盐流体 培养基培养基 硫乙醇酸盐流体硫乙醇酸盐流体 培养基培养基 0.9%氯化钠溶氯化钠溶 液液 白色念珠菌白色念珠菌真菌琼脂斜面真菌琼脂斜面真菌培养基真菌培养基 0.9%氯化钠溶氯化钠溶 液液 由于验证试验中包括黑曲霉菌，在转由于验证试验中包括黑曲霉菌，在转 种或洗菌时应注意关闭无菌室或超净工种或洗菌时应注意关闭无菌室或超净工 作台的抽风机并在酒精灯火焰旁操作

10、，作台的抽风机并在酒精灯火焰旁操作， 以免菌孢子飞扬。从事微生物检查的工以免菌孢子飞扬。从事微生物检查的工 作人员也应该注意个人防护，避免由操作人员也应该注意个人防护，避免由操 作不当而导致的生物危险。除生物危险作不当而导致的生物危险。除生物危险 外，还应加强微生物检查的安全管理。外，还应加强微生物检查的安全管理。 大肠杆菌斜面 藤黄微球菌斜面 黑曲霉改良马丁琼脂斜面不同培养时间的生长形态 l 将上述液体石蜡加将上述液体石蜡加 入培养好的菌种试管入培养好的菌种试管 内，液体石蜡液面以内，液体石蜡液面以 高出培养基最上端高出培养基最上端 1 为宜，将试管直立，为宜，将试管直立， 放入放入4冰箱中

11、保藏。冰箱中保藏。 l适用范围：适用于保适用范围：适用于保 藏部分霉菌，酵母菌藏部分霉菌，酵母菌 和放线菌，对细菌保和放线菌，对细菌保 藏效果较差。藏效果较差。 标准菌种保藏管 1 菌种的复苏菌种的复苏 参考流程：参考流程： 把冻干菌种管、灭菌滴管、双碟、镊子、营养肉把冻干菌种管、灭菌滴管、双碟、镊子、营养肉 汤培养基、灭菌生理盐水、营养琼脂斜面数支，移入汤培养基、灭菌生理盐水、营养琼脂斜面数支，移入 接种室或净化工作台。接种室或净化工作台。 先用砂轮将冻干菌种安瓶颈部挫出刻痕先用砂轮将冻干菌种安瓶颈部挫出刻痕,再将冻再将冻 干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干

12、，用75% 乙醇棉乙醇棉 擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种 管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌滴管吸取管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌滴管吸取 灭菌生理盐水，滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷灭菌生理盐水，滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷 而炸裂。而炸裂。 2 菌种的传代与保存 方法（方法（1）：）： 菌斜面菌斜面 菌斜面（保存）菌斜面（保存） 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜 再使用。标签上著名菌名及接种日期。至冰箱取出再使用。标签上著名菌名及接种日期。至冰箱取出 的菌种斜

13、面，应在室温放置约的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡分钟，待温度平衡 后再移入接种室或超净工作台。后再移入接种室或超净工作台。 点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近 火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，秒， 随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通 过过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手用无名次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手用无名 指、小指及掌部夹住管塞，拨开管塞，将接种环伸指、小指及掌部夹住管塞，拨开管塞，将接种环伸 人管内先在近

14、壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移人管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移 至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒，并将至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒，并将 菌种管口移至火焰旁。菌种管口移至火焰旁。 显微镜检查 l将菌种作革兰氏色，在显微镜下观察将菌种作革兰氏色，在显微镜下观察 l制片步骤：涂片干燥固定染色镜检制片步骤：涂片干燥固定染色镜检 l革兰氏染色步骤：初染媒染脱色复染革兰氏染色步骤：初染媒染脱色复染 l制好片后先用低倍镜再用油镜观察制好片后先用低倍镜再用油镜观察 l革兰氏色阳性菌为紫色革兰氏色阳性菌为紫色 l革兰氏色阴性菌为红色革兰氏色阴性菌为红色 细菌涂片制作 1.涂片：取清洁玻片一张，取涂片：取清洁玻片一张，取12环生理环生理 盐水在玻片上，灭菌接种环后，取少许