灭菌工艺验证

1、1 湿热灭菌工艺的微生物学验证知识湿热灭菌工艺的微生物学验证知识 2 概念与方式概念与方式 n基础概念基础概念 n灭菌工艺灭菌工艺 n无菌无菌 n药品达到无菌要求的两种方式药品达到无菌要求的两种方式 n无菌生产工艺无菌生产工艺 n最终灭菌最终灭菌 3 两种生产方式的比较两种生产方式的比较 n无菌生产工艺的局限无菌生产工艺的局限 n通常的无菌保证水平（通常的无菌保证水平（10-3至至10-6） n影响因素较多影响因素较多 n最终灭菌工艺的优点最终灭菌工艺的优点 n赋予产品更高的无菌保证水平赋予产品更高的无菌保证水平 n生产中可变因素少，出现偏差的概率低生产中可变因素少，出现偏差的概率低 n几乎能

2、杀灭产品中的所有微生物几乎能杀灭产品中的所有微生物 4 制药工艺中常用的灭制药工艺中常用的灭/除菌方式除菌方式 n热力灭菌热力灭菌 n湿热灭菌湿热灭菌 （118-134）-蒸汽、过热水蒸汽、过热水 n干热灭菌（干热灭菌（160-320 ）-热空气热空气 n气体灭气体灭-环氧乙烷环氧乙烷 n离子辐射灭菌离子辐射灭菌-辐射和电子束辐射辐射和电子束辐射 n过滤除菌法过滤除菌法-过滤名义孔径小于等于过滤名义孔径小于等于0.2m 5 热力灭菌的基本原理热力灭菌的基本原理 n湿热灭菌湿热灭菌导致细胞内关键性蛋白质导致细胞内关键性蛋白质 和酶发生热变性或凝固和酶发生热变性或凝固.湿度对该破坏湿度对该破坏 性

3、过程起促进作用性过程起促进作用. n干热灭菌干热灭菌-使微生物氧化而不是蛋白使微生物氧化而不是蛋白 质变性质变性. 6 细菌细胞结构细菌细胞结构 n细胞质膜细胞质膜 n细胞壁细胞壁 n荚膜荚膜 n异染颗粒异染颗粒 n线毛线毛 n鞭毛鞭毛 n色素体色素体 n脂质颗粒脂质颗粒 n中体中体 n核糖体核糖体 n拟核拟核 n模隔壁模隔壁 7 湿热灭菌的热力学基础湿热灭菌的热力学基础 水-蒸汽系统处在饱和状态时的性质 温度压力Bar焓（内部热量）J/g 水hLh*蒸汽hV 1001.01341922562675 1151.69248322162699 1201.98750422022706 1212.02

4、650821992707 1252.32252521882713 饱和蒸汽表 h = hV-hL，凝结或汽化潜热，1 Atmosphere = 1.013 bar = 14.71 psia 8 热力灭菌设备热力灭菌设备 n过热水灭菌釜过热水灭菌釜 n干热灭菌釜干热灭菌釜 n蒸汽灭菌釜蒸汽灭菌釜 9 湿热灭菌工艺研发与确认湿热灭菌工艺研发与确认 灭菌工艺的验证 工艺研发阶段工艺确认阶段 方法设计装载类型工艺类型工艺开发性能确认连续控制 非产品特异 性灭菌工艺 (过度杀灭 法) 产品特异性 灭菌工艺 蒸汽不可透 过型物品 (液体型) 蒸汽可透过 型物品 饱和蒸汽型 预真空式 重力式 空气超压型 蒸

5、汽/空气 混和方式 过热水方 式 确定参数 升温阶段 保温阶段 降温阶段 物理学方法 温度分布 热穿透 生物学方法 日常放行 工艺评估 系统适用 性 再确认 变更控制 10 最终灭菌产品无菌的标准最终灭菌产品无菌的标准 .无菌检查结果合格-存在局限性 批检不合格率、实际污染率和取样量之间的相互关系 取样量 实际污染率 0.1151015 100.010.090.400.660.80 200.020.180.650.890.96 50 0.050.340.920.99 1000.090.630.99 3000.260.95 30000.95 11 最终灭菌产品无菌的标准最终灭菌产品无菌的标准 n

6、通过物理通过物理/生物学方法证明，单位产生物学方法证明，单位产 品内微生物存在的概率不超过百万品内微生物存在的概率不超过百万 分之一分之一(即批产品的污染概率不超过即批产品的污染概率不超过 百万分之一百万分之一). 可实现参数放行可实现参数放行 12 影响灭菌效果的因素影响灭菌效果的因素 n物理化学条件物理化学条件 .环境因子环境因子 .芽孢是否处于被包裹状态芽孢是否处于被包裹状态 n湿度湿度 n微生物的热致死特性微生物的热致死特性 13 适于湿热灭菌工艺验证的微生物适于湿热灭菌工艺验证的微生物 菌种名称D121 值范围(min) 嗜热脂肪芽孢杆菌 Geobacillus stearother

7、mophilus 1.5-3.0 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 0.3-0.7 凝结芽孢杆菌 Bacillus coagulans 0.4-0.8 梭状芽孢杆菌 Clostridum sporogenes 0.4-1.0 14 实现无菌要求的标准手段实现无菌要求的标准手段 n热稳定性产品热稳定性产品(过度杀灭过度杀灭) 美国美国 产品灭菌工艺的产品灭菌工艺的F0值不低于值不低于12分钟分钟; 欧盟欧盟 12115分钟分钟 n热敏感性产品热敏感性产品 控制产品在灭菌前的带菌量控制产品在灭菌前的带菌量 产品灭菌工艺的产品灭菌工艺的F0值不低于值不低于8分钟分钟. 15 药典要求

8、药典要求 nEP 对过度杀灭法的工艺要求：对过度杀灭法的工艺要求： 对溶液的灭菌条件至少为对溶液的灭菌条件至少为121oC 15 分钟；分钟； 也可采用其它组合条件，但灭菌效果须与上也可采用其它组合条件，但灭菌效果须与上 述相等效。述相等效。 目标：无菌保证值（目标：无菌保证值（SAL，污染概率的负对数），污染概率的负对数） 大于等于大于等于12。 16 药典要求药典要求 nUSP 对过度杀灭法的工艺要求：对过度杀灭法的工艺要求： 对溶液的灭菌条件需达到对溶液的灭菌条件需达到12D ，至少为，至少为12 分分 钟。钟。 n设计目的：设计目的： 使使D121=1分钟，数量为分钟，数量为106的微

9、生物经过灭的微生物经过灭 菌后达到菌后达到SAL= 10-6。 17 灭菌程序的开发与设计灭菌程序的开发与设计 n根据灭菌前带菌量进行设计根据灭菌前带菌量进行设计 基于对灭菌前产品所含微生物的耐热特性和数量以及产品的基于对灭菌前产品所含微生物的耐热特性和数量以及产品的 热稳定性热稳定性 灭菌后产品的污染概率须小于灭菌后产品的污染概率须小于10-6。 n过度杀灭法过度杀灭法 基于工艺程序能杀灭更加耐热微生物，并且再加上基于工艺程序能杀灭更加耐热微生物，并且再加上 一定的安全系数；一定的安全系数； 理论上对生物指示剂孢子的杀灭能力达到理论上对生物指示剂孢子的杀灭能力达到10-12。 n将两者相结合

10、将两者相结合 兼顾产品的热稳定性和无菌要求。兼顾产品的热稳定性和无菌要求。 18 灭菌程序的效力测定灭菌程序的效力测定 n生物学手段（生物学手段（FBiological） 用特定的生物指示剂作为标准微生物制剂用特定的生物指示剂作为标准微生物制剂 数据直接反映灭菌效果数据直接反映灭菌效果 有时可取代物理手段的不足有时可取代物理手段的不足(如探头无法放入安瓿瓶如探头无法放入安瓿瓶) 局限性：较难进行统计学分析局限性：较难进行统计学分析 n物理物理/数学手段（数学手段（FPhysical） 用灭菌值用灭菌值F0作为评价标准作为评价标准 精确测定热分布和热穿透状况精确测定热分布和热穿透状况 便于准确计

11、算不同灭菌条件下的灭菌效果便于准确计算不同灭菌条件下的灭菌效果 测量数据便于统计学分析测量数据便于统计学分析 19 灭菌工艺验证灭菌工艺验证 n确认（确认（IQ、OQ） 灭菌设备的运行符合设计要求灭菌设备的运行符合设计要求 n验证（验证（PQ） 产品灭菌程序的有效性和重现性产品灭菌程序的有效性和重现性 n评估评估 灭菌时产品可能发生的变化给灭菌效果带来灭菌时产品可能发生的变化给灭菌效果带来 的影响的影响 20 灭菌工艺验证灭菌工艺验证-IQ/OQ n检查设备构造、控制检查设备构造、控制/监测系统、运行系统、安全系统及所监测系统、运行系统、安全系统及所 有零部件均与采购要求相同；有零部件均与采购

12、要求相同； n控制控制/监测仪表的校验，包括程序控制器、温度、压力和时监测仪表的校验，包括程序控制器、温度、压力和时 间控制设备，以及计时器、记录测量仪等；间控制设备，以及计时器、记录测量仪等； n试车试车空载热分布试验空载热分布试验 温度探头温度探头10-20支；探头精确度支；探头精确度0.5 oC; 须有探头与腔室原探头并列放置须有探头与腔室原探头并列放置; 检测报警和安全系统的可靠性检测报警和安全系统的可靠性; 真空系统的可靠性真空系统的可靠性(产生的效率、维持时间等产生的效率、维持时间等); 灭菌温度下，各点间最大温差（腔室内的）灭菌温度下，各点间最大温差（腔室内的） = 2 oC；同

13、一点的最大温；同一点的最大温 差差1.0 oC; 重复试验至少重复试验至少3次以证明重现性次以证明重现性 21 灭菌工艺验证灭菌工艺验证PQ (一一) n每种装载方式下的热穿透试验每种装载方式下的热穿透试验 证明特定灭菌程序杀灭微生物的均一性和有效性证明特定灭菌程序杀灭微生物的均一性和有效性; 重复性试验证明灭菌程序的重现性和稳定性重复性试验证明灭菌程序的重现性和稳定性; 证明灭菌程序对被灭菌物品的相容性证明灭菌程序对被灭菌物品的相容性. n容器内部产品的热穿透试验容器内部产品的热穿透试验 证明在每种装载方式下各点的均一性、程序的重现证明在每种装载方式下各点的均一性、程序的重现 性性 证明最冷

14、点处所获得的灭菌效果符合既定要求。证明最冷点处所获得的灭菌效果符合既定要求。 22 灭菌工艺验证灭菌工艺验证PQ (二二) n生物指示剂试验生物指示剂试验 结果与热穿透试验保持一致结果与热穿透试验保持一致 所有测试点均应确保所有测试点均应确保SAL 不低于不低于6 试验次数足以符合统计学要求（至少重复试验次数足以符合统计学要求（至少重复3 次试验，指示剂数量次试验，指示剂数量10 20 支支/次）。次）。 23 再验证和变更管理再验证和变更管理 n再验证再验证 进行再验证的条件进行再验证的条件 设备、产品、工艺有重大改变，或设备有重大维修设备、产品、工艺有重大改变，或设备有重大维修 定期的常规

15、再验证（一次定期的常规再验证（一次/12-24 月）月） 验证方法验证方法 通常与初次通常与初次PQ 方案相同方案相同。 n变更管理变更管理 有相关有相关SOP 来评价变更对工艺的潜在影响来评价变更对工艺的潜在影响 根据变更评估结果确定再验证的范围根据变更评估结果确定再验证的范围 24 无菌的影响因素无菌的影响因素 nNt = N0 -NR PNSU = N0 -DR Nt 灭菌后微生物残存量；灭菌后微生物残存量； PNSU -非无菌品概率；非无菌品概率； N0 -灭菌前微生物含量；灭菌前微生物含量； N0 -灭菌前产品的污染灭菌前产品的污染 水平；水平； NR -灭菌时的杀灭量。灭菌时的杀灭

16、量。 DR -灭菌时的杀灭水平。灭菌时的杀灭水平。 25 热力灭菌的基本规律热力灭菌的基本规律 n在一定温度下微生物数量的对数在一定温度下微生物数量的对数 值与灭菌时间的线性关系值与灭菌时间的线性关系 微生物数量的对数值随灭菌时间的增加而减少微生物数量的对数值随灭菌时间的增加而减少 26 耐热参数耐热参数D 值的定义值的定义 nD 值指一定温度下，将微生物杀灭值指一定温度下，将微生物杀灭90（即（即 下降一个对数单位）所需要的时间（下降一个对数单位）所需要的时间（Time for decimal reduction） 27 D T值的影响因素值的影响因素 n.挑战微生物的种类挑战微生物的种类

17、n.挑战微生物的贮存条件挑战微生物的贮存条件 n.挑战微生物的恢复生长和培养条件挑战微生物的恢复生长和培养条件 n.灭菌釜的灭菌工艺温度灭菌釜的灭菌工艺温度 n.DT值测定开始前的起始温度值测定开始前的起始温度 n.悬浮液和恢复生长用培养基种类悬浮液和恢复生长用培养基种类 n.灭菌结束后的放置温度与时间灭菌结束后的放置温度与时间 n.蒸汽的饱和度蒸汽的饱和度 n.原始包装材料原始包装材料 28 耐热参数耐热参数Z 值的定义值的定义 nZ 值是指当某种微生物的值是指当某种微生物的D值下降（或上升）值下降（或上升） 一个对数（一个对数（log ）单位时，其温度应升高）单位时，其温度应升高 （或降低

18、）的度数。（或降低）的度数。 29 灭菌率的概念灭菌率的概念 n灭菌率灭菌率(L值值)系指在某温度下灭菌系指在某温度下灭菌1分钟所分钟所 相应的标准灭菌时间相应的标准灭菌时间(分钟分钟)，即，即F0和和FT的的 比值比值(LF0/FT)。当。当Z10时，不同温度下时，不同温度下 的的L值是不同的。值是不同的。 30 商购生物指示剂的确认商购生物指示剂的确认 n1. 进行形态学和纯度确认进行形态学和纯度确认(至少鉴别至菌属至少鉴别至菌属) n2. 芽孢计数复核芽孢计数复核 -蒸汽灭菌工艺用蒸汽灭菌工艺用BI，95-100下暴热预处理下暴热预处理15 分分 钟钟 -环氧乙烷和干热灭菌工艺用环氧乙烷

19、和干热灭菌工艺用BI，80-85下暴热预下暴热预 处理处理10 分钟分钟 -预处理后迅速转移至冰水浴内预处理后迅速转移至冰水浴内 -合格标准：合格标准：Log( 实测值实测值)在在0.3-1.48Log( 标示值标示值) 之间之间 3. D值复核值复核(视实验室能力而定视实验室能力而定) 31 F0的定义及其意义的定义及其意义 nF0是指在某特定温度下所产生的灭菌效果与在是指在某特定温度下所产生的灭菌效果与在121.1oC 下相等效时所需要的灭菌时间（分钟）下相等效时所需要的灭菌时间（分钟）. n121.1 oC 或或250 oF表示表示100 KPa 饱和蒸汽的温度饱和蒸汽的温度, 为为 标准灭菌温度；标准灭菌温度； nF 0值用于评价热（湿值用于评价热（湿/干热）灭菌工艺的对微生物的杀灭干热）灭菌工艺的对微生物的杀灭 效果效果. nF0值可用来比较不同温度下的灭菌效果值可用来