骨骼肌卫星细胞的原代、传代培养和鉴定

1、骨骼肌卫星细胞的原代、传代培养和鉴定 一、骨骼肌卫星细胞简介 骨骼肌卫星细胞最初被人们认为是骨骼肌的定向祖细胞，对骨骼肌的生长和伤后再生起重要作用。1961年，mauro在对青蛙的胫前肌做研究时，利用电子显微镜，从肌膜和基底膜之间发现了骨骼肌卫星细胞。一般情况下，这些细胞处于静止状态，当骨骼肌受损、坏死或负荷过重等应激出现时，卫星细胞就能被激活，开始迁移至受损部位，然后增殖分化形成肌管，从而达到修复肌肉的目的。 二、骨骼肌卫星细胞的原代培养 取sd大鼠一只，使用10%浓度水合氯醛进行腹腔注射麻醉，其计量约为0.4ml/100g。静置大鼠数分钟直至其结膜反射消失，用镊子将其浸泡在75%酒精中消毒

2、2-3分钟后，仰卧位固定，使用采血针吸除血液，提取腓肠肌和比目鱼肌，置入事先消毒并预冷的生理盐水中，然后迅速转移至超净工作台，取冰袋置于操作容器下方。 使用双抗pbs骨骼肌清洗液对获得的肌肉清洗3-4次，快速清除血管、肌筋膜以及脂肪等组织后，将肌肉均匀剪碎至1mm3 大小左右。再次加入骨骼肌清洗液清洗，静置后弃漂浮物。 将适量的ii型胶原酶消化液（0.1%）加入被剪碎的肌肉中，使用37磁力搅拌机让肌肉均匀消化约60分钟，转移至离心管，以1000rpm离心10分钟，吸除上清液。根据沉淀体积加入适量的胰酶细胞消化液，磁力搅拌消化约20分钟，加入细胞种植液终止消化，将此时的肌肉悬液转移至离心管，以1

3、000rpm离心10分钟，吸除上清液，在肌肉沉淀中加入10ml细胞种植液，均匀吹打成细胞悬液。将细胞悬液依次加入200目、400目的细胞筛中过滤纯化。均匀吹打滤液并接种于6孔细胞培养板中，置于培养箱（5%co2，37，100%空气湿度）中培养2小时，细胞进行第一次差速贴壁后，将细胞液转移至新的6孔板中继续在培养箱（5%co2，37，100%空气湿度）里培养2小时。然后将细胞悬液转移至提前用0.001%多聚赖氨酸工作液包被过的6孔板中。在细胞培养箱中培养48小时之后，使用细胞生长液进行首次换液并继续培养。之后每隔2天进行一次换液工作，观察并记录细胞的生长状况。 三、骨骼肌卫星细胞的传代培养 使用

4、倒置相差显微镜观察细胞培养板中已贴壁细胞的覆盖率，若达到80%左右，则可进行传代培养。吸除培养板中的细胞生长液，加入pbs（0.0067m）清洗2次，吸除清洗用的pbs，每孔中加入适量预热至室温的胰酶细胞消化液，静置1-2分钟，并在倒置相差显微镜下观察，如果细胞收缩，细胞间隙增大并出现脱落的情况，立即吸除胰酶细胞消化液，往培养板中加入细胞生长液终止其消化，然后使用一次性吸管均匀吹打培养板底部未脱落的细胞，制成细胞悬液。加入三倍体积的细胞生长液稀释细胞悬液，并分装到新的培养板中，置细胞培养箱（5%co2，37，100%空气湿度）中继续培养备用。 四、骨骼肌卫星细胞的活性检测方法台盼蓝拒染法 正常

5、的细胞的细胞膜结构是完整的，而死亡细胞的细胞膜结构是被破坏的。细胞膜结构一旦被破坏，它的通透性就会发生改变。台盼蓝可以穿透死亡细胞的细胞膜，渗透到细胞内部，从而与解体的dna染色体结合，将死亡的细胞染成蓝色。正常细胞的细胞膜结构相对稳定，台盼蓝无法通过正常细胞的细胞膜，因而正常细胞不会被染色。台盼蓝拒染法可以快速区别正常细胞和死亡细胞，进而计算出细胞活性率。 操作步骤： （1）取第一次传代培养的细胞悬液0.5ml，使用高糖dmem稀释细胞密度至2104个/ml。 （2）将调整好细胞密度的细胞液加入试管，再加入等容积的0.4%台盼蓝染色液，在常温下染色2-3分钟。 （3）用一次性吸管吸取混合染色

6、液10l，注入已消毒并且擦拭干净的细胞计数板。 （4）计数500个细胞，蓝色细胞单个进行计数。 （5）结果分析：死细胞会被染成蓝色，而活细胞因拒染会呈现透明无色状。 （6）细胞活性率=（总细胞数-被染色细胞数）总细胞数 100% 五、骨骼肌卫星细胞的纯度鉴定 （1）准备好有盖玻片的12孔板，盖玻片用多聚赖氨酸包被30分钟，然后取传代至第二代的细胞，以3105 个/孔接种与12孔板内。将细胞培养板置于培养箱（5%co2，37，100%空气湿度）中培养。 （2）将盖玻片取出，用pbs（0.0067m）漂洗3次。 （3）用4%多聚甲醛使细胞固定20分钟，pbs（0.0067m）漂洗3次，每三分钟一次

7、。 （4）将盖玻片放入3%双氧水中室温浸泡30分钟，起到灭活内源性过氧化物的作用，pbs（0.0067m）漂洗3次，每三分钟一次。 （5）滴加5% bsa封闭液，在室温中孵育20分钟，将多余液体甩去。 （6）滴加1：100稀释的横纹肌肌动蛋白抗体（一抗），4过夜，pbs（0.0067m）漂洗3次，每三分钟一次。 （7）滴加生物素化山羊抗小鼠igg（二抗），37孵育20分钟左右，pbs（0.0067m）漂洗3次，每三分钟一次。 （8）滴加复合sabc，37孵育20分钟左右，pbs（0.0067m）漂洗3次，每三分钟一次。 （9）dab显色：在试剂盒中按试剂a、b、c顺序各滴一滴蒸馏水，混合均匀后加至盖玻片，在室温下显色约15分钟，借助显微镜来观察控制反应的时间。显色之后，使用蒸馏水进行冲洗，终止反应。 （10）使用苏木素重复染色后，脱水，透明，封片。在显微镜下观察，并随机选取5个视野拍照并计算纯度。 六、小结及展望 骨骼肌卫星细胞的体外培养具有很高的应用价值，不仅可以在组织工程中发挥作用，而且可以用于基因治疗。骨骼肌卫星细胞的体外培养有如下优势：取材便捷，培养数量可观，增殖和分化能力较强。因此骨骼肌卫星细胞在各类组织工程