基因诊断GenediagnosisChinaMedi

1、p480 本章内容提示第一节 基因诊断技术 第二节 基因诊断方法及实例 传统的诊断：表现型传统的诊断：表现型基因型基因型 基基 因因 诊诊 断：基因型断：基因型表现型表现型 （ 逆向诊断）逆向诊断）基因诊断的特征：基因诊断的特征：1 不受材料来源影响不受材料来源影响 外周血、活体穿刺组织、孕妇外周血、血斑等外周血、活体穿刺组织、孕妇外周血、血斑等2 症状前诊断症状前诊断 尤其对于一些延迟显性疾病如尤其对于一些延迟显性疾病如huntingtong舞蹈病舞蹈病3 产前诊断产前诊断 避免患儿出生，提高人口质量避免患儿出生，提高人口质量第一节第一节 基基 因因 诊诊 断断 技技 术术southern印

2、迹杂交印迹杂交基基 因因 诊诊 断断 技技 术术northern印迹杂交印迹杂交基基 因因 诊诊 断断 技技 术术斑斑 点点 杂杂 交交点样点样probe-32p检测检测ab1 2 3 4基基 因因 诊诊 断断 技技 术术荧光原位杂交荧光原位杂交基基 因因 诊诊 断断 技技 术术荧光原位杂交荧光原位杂交基基 因因 诊诊 断断 技技 术术聚合酶链反应聚合酶链反应基基 因因 诊诊 断断 技技 术术聚合酶链反应聚合酶链反应基基 因因 诊诊 断断 技技 术术 多重多重pcr在一个在一个pcr体系中加入数对体系中加入数对pcr引物，覆盖区域不重叠引物，覆盖区域不重叠用于检测同一基因多个外显子的缺失用于检

3、测同一基因多个外显子的缺失e1 e2 e3基基 因因 诊诊 断断 技技 术术 rt-pcr以以mrna为模板，经逆转录酶合成为模板，经逆转录酶合成cdna用于研究基因表达用于研究基因表达使微量使微量mrna迅速扩增，提高迅速扩增，提高mrna检出的灵敏度检出的灵敏度基基 因因 诊诊 断断 技技 术术 pcr-sscp（single strand conformation polymorphism）单链单链dna由于碱基序列不同可引起构象差异，这种由于碱基序列不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链差异将造成相同或相近长度的单链dna电泳迁移率电泳迁移率的不同。据此，可用于的不同。

4、据此，可用于dna中单个碱基的替代、微中单个碱基的替代、微小的缺失或插入的检测。小的缺失或插入的检测。基基 因因 诊诊 断断 技技 术术 - primer - 32p-dntp掺入掺入 pcr扩增扩增 产物产物 变性变性 单链单链dna 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 2 3 4 5 自显影自显影 1为正常为正常 结果分析结果分析 2、4、5为纯合患者为纯合患者 3为杂合子为杂合子 . 基基 因因 诊诊 断断 技技 术术生生 物物 芯芯 片片第二节第二节 基基 因因 诊诊 断断 方方 法及法及实例实例直接诊断直接诊断直接直接检测致病基因的突变检测致病基因的突变 基因突变类型基

5、因突变类型缺失、点突变、重复、插入等缺失、点突变、重复、插入等间接诊断间接诊断应用应用dna多态为遗传标记进行连锁多态为遗传标记进行连锁 分析，确定待测者是否得到带有致病的染色体，分析，确定待测者是否得到带有致病的染色体，从而从而间接间接地作出诊断地作出诊断 dna多态多态rflp、vntr、snpallele ii12kb8kb4kbprobe12kb8kb rflpsouthern blot检测结果检测结果 vntr 大小pcr-vntr检测pcr-vntr三三)单核苷酸多态性（单核苷酸多态性（snp）（single nucleiotide polymorphism）snp：发生在基因组中

6、的单个核苷酸的替代：发生在基因组中的单个核苷酸的替代根据根据snp在基因中的位置，分为：在基因中的位置，分为： 基因编码区基因编码区snp 基因周边基因周边snp 基因间基因间snp在人类基因组中每在人类基因组中每100300个核苷酸就有一个个核苷酸就有一个snp二、基诊断方法及实例二、基诊断方法及实例 直接检测致病基因本身的异常。通常使用基因直接检测致病基因本身的异常。通常使用基因本身或本身或邻近邻近dna序列序列作为探针，进行作为探针，进行southern 杂交杂交，或通过，或通过pcr 扩增产物扩增产物，以检测基因点突变、缺失、插入等异常，以检测基因点突变、缺失、插入等异常及性质。主要适

7、用于已知基因异常疾病的诊断。及性质。主要适用于已知基因异常疾病的诊断。直接直接基因诊断及实例基因诊断及实例直接基因诊断直接基因诊断 直接直接 等位基因特异性寡核苷酸探针（等位基因特异性寡核苷酸探针（aso）（allele-specific-oligonucleotide ）斑点杂交结果：斑点杂交结果： 正常探针 突变探针突变突变直接直接突变突变直接直接bamhibamhi 2 2 1 1 2 2 10 kb14 kbprobe 1） 地中海贫血的基因诊断地中海贫血的基因诊断 基因不同程度的缺失可引基因不同程度的缺失可引起不同类型的起不同类型的 地中海贫血。地中海贫血。直接基因诊断直接基因诊断

8、缺失缺失直接直接southern blot 检测结果：检测结果： / /- /- - - /- - - - / - - 正常正常 缺缺1 缺缺2 缺缺3 缺缺414kb10kb缺失缺失直接直接pst1pst1pst1缺失缺失直接直接l al 4.4kb3.7kb缺失缺失直接直接3） dmd的基因诊断的基因诊断dmd属属xrdmd基因是最大的基因，有基因是最大的基因，有79个外显子个外显子dmd基因突变主要以基因突变主要以缺失缺失为主，可涉及基因的不同部位为主，可涉及基因的不同部位e1 e2 e3缺失缺失直接直接病例外显子 1 2 3 4 5 6 7 8pm34350136476052bp535

9、113缺失缺失直接直接二）间接基因诊断方法及实例二）间接基因诊断方法及实例 当当致病基因致病基因虽然已知，但其虽然已知，但其异常性质未知异常性质未知时，时，或疾病或疾病genegene本身尚未知本身尚未知时，主要通过时，主要通过genegene和和dnadna多态的连锁分析多态的连锁分析间接地间接地作出诊断。作出诊断。 连锁分析基于连锁分析基于遗传标记遗传标记与与gene在染色体上连在染色体上连锁，锁， 通过对受检者及其家系进行连锁分析，分析通过对受检者及其家系进行连锁分析，分析子代获得某种子代获得某种遗传标记遗传标记与与疾病疾病的关系，间接推断受的关系，间接推断受检检子代是否获得带有致病基因

10、的染色体子代是否获得带有致病基因的染色体，间接地判，间接地判断并做出诊断。断并做出诊断。 遗传标记是基因组中的遗传标记是基因组中的dna 多态多态 如：如：rflp，vntr 等。等。间接基因诊断间接基因诊断遗传标记相关基因表型分析间接基因诊断间接基因诊断 pah基因两侧基因两侧有有msp1酶切酶切位点位点,用该酶用该酶消化可产生消化可产生23kb、19kb 两种等位片段，两种等位片段，以以pahcdna为探针与为探针与pku家系成员外周家系成员外周血血dna杂交。杂交。间接基因诊断间接基因诊断l患者为19kb片段的纯合子,说明患者缺陷的pah基因与19kb片段连锁l其父、母亲缺陷的pah基因

11、与19kb片段连锁，其23kb片段与正常pah基因连锁。lii2为为23kb 和19kb片段的杂合子，为表型正常的致病基因携带者。间接基因诊断间接基因诊断间接基因诊断间接基因诊断 以以3hvr为探针，与为探针，与pvuii酶切后的家系有关成酶切后的家系有关成员的基因组员的基因组dna进行进行southern blot 基因组基因组dnapvuii酶切酶切dna片段片段变性变性转膜转膜探针探针变性变性杂交杂交结果分析结果分析间接基因诊断间接基因诊断 1 2 1 2 3 4 5 5.7kb 3.4kb 2.3kb 间接基因诊断间接基因诊断结果分析结果分析 患者（患者（i1、ii1和和ii2）有）有

12、3.4kb片段，片段，说明致病基因与说明致病基因与3.4kb片段连锁，并按孟片段连锁，并按孟德尔方式遗传。德尔方式遗传。ii5不含不含3.4kb片段，产前片段，产前诊断正常。诊断正常。间接基因诊断间接基因诊断3 甲型血友病甲型血友病诊断（诊断（pcrrflp） 甲型血友病的基因诊断：已知甲型血友病xr，获得家系成员基因组dna 。p1p2142bp99bp43bpbcl ibcl i -bcl i +间接基因诊断间接基因诊断间接基因诊断间接基因诊断 142bp99bp1 2123iii 1间接基因诊断间接基因诊断间接基因诊断间接基因诊断单体型分析单体型分析l有时用一种酶和一个探针不能提供可供分有时用一种酶和一个探针不能提供可供分析的信息，需采用一种以上的酶结合几个析的信息，需采用一种以上的酶结合几个基因探针杂交分析基因探针杂交分析。l根据同一条染色体上限制性位点的丢失或根据同一条染色体上限制性位点的丢失或获得而出现的获得而出现的一组一组多态位点所构成的多态位点所构成的不同不同片段长度的组合类型片段长度的组合类型进行分析，该分析方进行分析，该分析方法称法称单体型分析单体型分析（haplotyping)间接基因诊断间接基因诊断 举例：举例：pku家系家系hind 酶切：酶切： 患儿患儿4.2/4.0kb杂合体杂合体 父母父母4.2