课题申请书神经元发育与退行性病变的分子细胞遗传机制

1、项目名称：神经元发育与退行性病变的分子细胞遗传机制首席科学家：肖波 四川大学起止年限：2009.1至2013.8依托部门：四川省科技厅 教育部一、研究内容关键科学问题: 神经元的发生和发育是一个多步骤、多因子参与的复杂过程。目前已知，胞外信号（包括生长因子、营养因子、神经活动）在神经元的发生、分化（极化）和神经网络形成过程中发挥着关键作用。这些胞外信号可以激活各种信号通路，从而启动一些对神经元发生、发育起关键作用的转录因子的mrna表达和蛋白质合成。本项目将围绕神经元的发生、极化，突起的形态发生及其退行性病变，从分子、细胞到整体进行系统而深入的研究。我们拟解决的关键科学问题是：揭示与神经细胞发

2、生，极化，突触形成及神经退行性病变相关的重要信号分子（包括小g-蛋白及其偶联激酶）的功能并研究其作用机理，以及环境与遗传表型的关系。主要研究内容:（1）rheb/mtor信号通路在神经元发生、极化、网络化及神经退行性病变中的作用及分子机制：体外研究发现，mtor信号通路对神经元的发生、发育起重要作用，而rheb处于mtor蛋白上游并对其起正调节作用，前期工作发现，rheb1敲除小鼠的大脑发育出现明显异常。我们的初步研究表明小鼠中mtor的激活需要与神经元早期发育密切相关的rheb1。 nestin-cre介导的神经前体细胞敲除rheb1导致小鼠大脑体积和重量均减少约50%。基于上述，我们计划深

3、入研究rheb/mtor信号通路在神经元发生阶段作用和机制。预计本课题将帮助我们阐明rheb1/mtor信号通路在神经元发生作用和机制，为相关疾病的防治提供理论基础。在肿瘤细胞中，我们已知lkb1抑制mtor信号通路。最近研究表明lkb1调节神经元的极化，我们初步结果显示在神经前体中敲除rheb1会导致大脑皮层厚度下降，由此推断rheb/mtor信号通路有可能参与神经元极化调控。由此，我们将研究rheb1/mtor信号通路在神经元极化中的作用和分子机制。预计通过本课题的研究将确定rheb/mtor信号通路是神经元极化所必需的，同时将为进一步揭示rheb调控神经元发生分子机制，为相关疾病防治提供

4、新途径。体外研究表明，抑制mtor会减少神经元树突棘的形成。由于rheb1缺失会导致mtor完全失活，我们推断rheb1的敲除会引起树突和树突棘形成的缺陷。我们初步数据表明rheb1敲除将降低突触后骨架蛋白shank3的表达。shank3是树突发育的必需因子，所以rheb1可能通过提高shank3的表达调节树突生长。我们将通过本课题的研究确定rheb/mtor/shank3信号通路在树突和树突棘形成中的作用和分子机制，并揭示它在行为神经网络形成中的作用。此外， 我们的研究显示，rheb1敲除小鼠脑体积比野生型减小约50%，小脑皮层的厚度及海马体大小也均减少约50%。且rheb1敲除小鼠小脑体积

5、显著减少，其只有五个小脑叶片而正常小脑为七个。上述所有这些发育缺陷可能由于rheb1敲除小鼠神经祖细胞的增殖率减慢和（或）脑发育过程中神经干细胞/祖细胞群的早期损失引起。大量研究表明mtor信号在多个细胞系中具有抑制自噬的作用，我们前期研究发现，rheb1中枢神经系统敲除小鼠所有脑区域中mtor活性被显著抑制。因此，我们推测rheb1敲除小鼠由于缺失mtor信号发生过度自噬，从而导致神经祖细胞增殖率减慢及脑发育过程中神经干细胞/祖细胞群的早期损失，最终导致其脑发育异常。本课题的研究将确定rheb1/mtor通路介导的自噬抑制在维持神经祖细胞生存和增殖中的功能及rheb1/mtor信号异常是否引

6、起线粒体自噬异常从而导致神经祖细胞受损。（2）与铁离子代谢相关基因在神经元发生、极化和网络化中的作用及分子机制：研究结果表明，铁离子与神经元的发育密切相关，但其分子机理尚不清楚。为深入研究铁离子和铁转运蛋白在脑神经发育中的分子机理，我们将在神经前体细胞中敲除铁离子运输基因包括铁转运蛋白受体（transferrin receptor，tfr）、二价金属转运体（dmt1）和运铁素（ferroportin，fpn或slc40a1)。 铁转运蛋白受体主要摄取转铁蛋白结合铁（transferrin-bound iron，tf-fe），二价金属转运体主要摄取非转铁蛋白结合铁（non-transferrin

7、-bound iron，ntbi），而运铁素在机体内唯一具有从细胞内泵出铁离子的蛋白。这三个基因涵盖了细胞摄取和泵出铁离子的主要通路。通过本课题的研究我们将确定铁离子转运在神经元发生过程中的作用和机理，为防治铁离子代谢失调引起的神经性疾病奠定基础。并且体外试验已经表明numb调节神经元的极化。铁离子、转铁蛋白与内吞调节蛋白numb共同参与内吞功能，但在脊椎动物中还未有遗传学证据证明这些分子介导的内吞调节神经元的极化。本课题将以这些基因敲除小鼠为模型，运用多种前沿生物学技术阐明中枢神经系统神经元摄取、泵出铁离子的通路和内吞调节蛋白numb/numblike在神经元极化中的作用及分子机制。课题的研

8、究将确定tfr、dmt1、fpn、numb和numblike信号通路是否是神经元极化所必需的，同时将为进一步揭示它们调控神经元极化的分子机制，为相关疾病的防治提供新的途径。如前所述，铁离子、转铁蛋白与内吞蛋白numb共同参与细胞的内吞过程。而在神经元中，内吞功能对树突发育、树突棘形成和可塑性产生都非常重要，但是铁离子的内吞转运和numb在这些过程中的作用还不清楚。为此，我们将研究确定tfr、dmt1、fpn、numb和numblike信号通路是否是神经元树突、树突棘形成所必需的，为进一步揭示tfr、dmt1、fpn、numb和numblike信号通路调控神经树突、树突棘形成的分子机制打下基础。

9、（3）研究gs在神经元极化中的作用及分子机制：我们的前期工作表明异三聚体g蛋白的亚基gsa调节神经前体细胞的不对称性分裂和细胞极性，emx1-cre介导的在大脑的神经前体细胞中敲除gsa导致大脑的重量减轻50%和产后月内死亡。虽然我们已在gsa介导对神经前体细胞不对称细胞分裂的调控方面取得显著进展（被资助），最近体外和遗传学研究提示gsa还有可能参与神经元极化的调节，但其中的机理尚待研究。通过本课题的研究将确定gsa信号通路是神经元极化所必需的，并进一步揭示gsa信号通路调控神经元极化分子机制。（4）bdnf在神经元网络化中的作用及分子机制：bdnf几乎在神经元的各个发育阶段都具有重要功能。其

10、基因突变val66met导致它在神经元内活性诱导分泌缺陷，因而造成精神疾病，但是具体的分子机制还不清楚。 为此我们建立了bdnfmet转基因小鼠模型。 此模型真实反映bdnfmet相关精神疾病的行为特点。预计本课题的研究将确定bdnfmet在树突和树突棘形成中作用和分子机制，及对神经传递的调节，进一步深化理解bdnfmet诱导精神疾病的发生病理及环境因素对bdnfmet精神疾病的影响，发现治疗bdnfmet诱导精神疾病的介入方式。（5）线粒体自噬在神经元发育和退行性病变中的功能及调节机制：线粒体自噬是细胞控制线粒体数量和清除受损线粒体的唯一途径。线粒体自噬不足会导致受损线粒体的积累，引起细胞凋

11、亡；而线粒体自噬过量会导致atp水平下降，引起细胞的自噬性死亡。由于神经元对线粒体的正常运行具有特别高的要求，它们必须具备精细的线粒体自噬调节机制，以将它控制在适当水平。在本课题中，我们将运用细胞筛选方法分离线粒体自噬的促进因子和抑制因子，通过研究它们的生化功能，揭示线粒体自噬特有的调节方式。进一步通过研究它们在神经元发育和退行性病变过程中的作用和变化，阐明线粒体自噬在神经系统中的功能和调节机制，为发展相关神经疾病的新一代防治方法提供理论基础。二、预期目标总体目标：确定在神经细胞发生发育及退变过程中起重要作用的信号分子，阐明在该过程中胞外信号如何通过细胞内信号传导发生作用，为防治神经精神性疾病

12、提供理论依据，并为相关疾病研究建立动物模型。 五年预期目标：1、 对神经细胞发生，极化，突触形成，及神经退行性病变的机理研究有所突破，明确rheb/mtor通路在神经元发育及退行性病变中的作用和机理，确定是否可通过干预mtor通路治疗神经精神疾病。2、 利用制备的条件性基因敲除小鼠建立一系列特异小鼠模型，确定信号蛋白的不对称分布和膜蛋白内吞在神经元发育和退行性病变中作用及机理。3、 明确变性蛋白、老化线粒体的清除与退行性病变的关系，建立以干预线粒体自噬活力为基础的神经精神疾病治疗方法。4、 建立和完善小鼠遗传学，活体影象等公用技术平台。5、 研究成果将在国际高水平杂志上发表，预期发表影响因子i

13、f10的10-15篇。6、将在今后5年内培养出4-5名领军型人才，研究生50-100名。三、研究方案总体研究方案项目拟以神经元为研究核心，分别围绕神经元的发生与极化，神经突起的形态发生，以及神经元退行性病变的分子机制等问题，从分子、细胞乃至整个机体的层次进行系统而深入的研究。我们希望通过构建一系列神经细胞特异性基因敲除小鼠，结合多种现代生物学前沿技术，如高分辨荧光染色影像分析、基因工程报告小鼠、免疫共沉淀、rna干扰等，阐明上述问题的分子机制，为进一步的研究和临床治疗打下坚实基础。本课题立意新颖，技术先进，重点突出，内容具体，具有极大的理论研究意义和实际应用价值。技术路线如右图所示：本项目的特

14、色与创新性：1 立题新颖：我们的研究将首次揭示胞内调控因子，如gs、rheb和fe，在神经元分化发育过程中的作用和机制。本项目的研究内容处于当代生命科学的前沿，国内外均未见类似的研究报道。2 技术先进：我们将大量采用目前世界上先进的生物学研究手段，如条件性基因敲除和报告基因技术（如rosa26-gfp），荧光标记和成像（如catfish）等，着重在体内研究基因在神经元发生和发育中的作用。3 取得重大突破的可能性大：参与本项目的科学家积累了大量前期工作的基础，在cell ，nature，science，nature genetics，nature neuroscience，neuron，mole

15、culler cell，development，genes development等世界顶级杂志上发表论文26篇，影响因子达520，被引用次数达6000多次。该项目应用先进的技术手段，在大量前期工作基础上，研究神经元的发生、极化、树突形成及退变的分子机制等神经发育生物学的重大问题。项目所需关键条件性基因敲除小鼠和cre小鼠已制备（如下图），因此，取得重大突破的可能性极大。4 神经系统发生发育的基础研究与临床疾病紧密相关。神经元生理功能和调节的失调将导致神经元退行性病变，如老年性痴呆症和帕金森氏病，我们对相关机制的阐明将有利于寻找新的药物靶点，开发新的神经元保护药物，从而为治疗神经疑难疾病发现新

16、途径。课题设置: 1) 神经元发生的分子机制：重点研究rheb/mtor信号通路和铁离子在神经元发生中的作用和机制；2) 神经元极化的分子机制：重点研究g-蛋白信号通路（gsa,rheb）和铁离子在神经元极化中的作用和机制；3) 神经元突起形态发生的分子机制：着重研究生长因子bdnf、rheb和铁离子在神经元突起形态发生的作用和机制；4) 神经元退行性病变的分子机制：侧重研究线粒体自噬和rheb/mtor信号在神经元退行性病变中的作用和机制。各课题既重点突出、内容具体、责任明确, 又互相合作、相互促进。各课题之间将在资源、技术和人才三方面充分实现共享，我们将共同利用多品系的基因敲除小鼠进行各课

17、题相关基因功能的研究，节约大量的人力和经费，并且互相学习先进实验技术和交换专业人才，提高科研效率。课题设置具体如下：课题一：神经元发生的分子机制负责人：肖波, 44岁, 教授，博士生导师，四川大学预算经费：占20主要内容 我们将利用基因敲除小鼠深入研究rheb/mtor信号通路调节神经元发生的分子细胞机制（包括神经干细胞的自我更新、增殖和分化）以及铁离子转运调控在神经元发生中的作用和分子细胞机制。预期目标 确定rheb/mtor信号通路和铁离子转运在体内神经元发生中的作用和调节机制，为相关疾病的防治提供理论基础。预计发表sci if>10的科学论文2-3篇。 在今后5年内培养出1-2名领

18、军型人才，研究生15-20名。课题二：神经元极化的分子机制负责人：沈颖，37岁，教授，博士生导师，浙江大学。预算经费：占30%主要内容我们将利用大脑神经元特异的基因敲除技术研究参与铁离子运输的转铁蛋白受体、泵铁蛋白(ferroportin)、决定细胞极性的内吞分子numb/numblike、氨基酸感受信号通路蛋白rheb1和感受外源因子的信号分子gs在神经元极化中的作用和分子机制。预期目标确定g蛋白（gs和rheb）和铁离子在体内神经元极化的作用和分子机制，为神经再生、神经、精神疾病的研究和新药的开发提供指导。预期发表影响因子if10的3-5篇，在今后5年内培养出1-2名领军型人才，研究生20

19、-30名。课题三：神经突起形态发生的分子机制负责人：陈哲宇，33岁，教授，博士生导师，山东大学预算经费：占30%主要内容 我们计划结合分子生物学、光学成像、电生理学技术阐明铁离子代谢、numb/numblike介导的内吞噬、bdnfmet、rheb/mtor信号通路在树突形态发生中的作用和分子机制，探究树突发育和神经环路形成的分子机制以及某些发育性神经疾病的机理。预期目标 确定bdnfmet、rheb1/mtor、shank3和铁离子在神经突起形态发生中的分子机制，为神经、精神疾病的研究和新药开发提供指导。预计发表sci if>10的科学论文3-5篇，在今后5年内培养出1-2名领军型人才

20、，研究生20-30名。课题四：神经元退行性病变的分子机制负责人：姜长安，37岁，教授，博士生导师，四川大学预算经费：占20%主要内容我们将侧重研究线粒体自噬和rheb/mtor信号在神经元退行性病变中的作用和机制。运用细胞筛选方法分离线粒体自噬的相关因子，揭示线粒体自噬特有的调节方式，进而研究它们在神经元发育和退行性病变过程中的作用和变化，阐明线粒体自噬在神经系统中的功能和调节机制，为发展相关神经疾病的新一代防治方法提供理论基础。预期目标确定线粒体自噬和rheb1/mtor信号通路与神经退行性病变的相互关系及相关机制，为神经、精神疾病的研究和新药开发提供指导。预计发表sci if>10的

21、科学论文2-3篇，在今后5年内培养出1-2名领军型人才，研究生15-20名。四、年度计划研究内容预期目标第一年1.建立和验证多个神经细胞特异性mtor上游分子rheb1、rheb2及下游分子shank3敲除小鼠品系。2.初步分析rheb/mtor信号对大脑皮层、海马神经元和小脑蒲肯野细胞发生、极化和网络化的影响。3.探讨rheb/mtor信号异常与神经祖细胞损伤的关系。 4.建立和验证tfr和fpn等铁离子代谢相关基因的中枢神经系统敲除模型 。5.初步分析上述基因敲除小鼠是否出现中枢神经系能发育异常。6.制备并验证多个神经细胞特异性gs敲除小鼠品系，包括gsf/f-exml-cre、 gsf/

22、f-nex-cre, gsf/f-nestin-cre和gsf/f-nestin-creer。7.利用膜片钳技术检测专一的钾钠离子通道，为研究gs在神经元极化中的定向运输打下基础。8.建立和验证多个bdnf转基因小鼠品系，包括bdnfmet´thy1-egfp，bdnfwt´thy-egfp。9.研究bdnf及其受体trkb在神经元活性调控突起形态发生中的作用。10.建立线粒体自噬速度的萤光测定方法。11.建立线粒体自噬调节因子的细胞筛选方法。12.研究已知的ad、pd相关突变对线粒体自噬的影响。1.完成神经细胞发育不同阶段rheb 1敲除小鼠的制备及验证，如rheb1f/

23、f-nestin-cre, rheb1f/f-synapsin1-cre, rheb1f/f-camkii-cre, rheb1f/f-synapsin1-cre rosa26-egfp为研究rheb1在神经系统发育不同时期的作用打下基础。2.完成rheb1/rheb2双基因敲除小鼠的制备及验证，为确定rheb1/rheb2在神经元发生中是否功能重叠打下基础。3.完成shank3中枢神经系统特异性敲除小鼠的制备及验证。4.建立和完善与研究神经系统发育相关的解剖学，免疫组化及体内成像等实验技术，包括catfish技术，以研究与学习和记忆相关的神经网络。5.初步分析rheb1、rheb2敲除小鼠脑

24、组织结构是否异常，皮层、海马神经元及小脑蒲肯野细胞发育是否异常。6.初步分析神经细胞敲除rheb1后是否能够形成稳定的神经网络。7.初步分析rheb1中枢神经系统敲除小鼠神经祖细胞死亡和（或）增殖是否异常，并检测其自噬活性及线粒体形态是否异常。8.完成tfr和fpn等铁离子代谢相关基因的中枢神经系统敲除模型的制备及验证，包括tfrf/f-nestin-cre和fpnf/f-nestin-cre，为研究铁离子代谢在神经元发生、极化、网络化和死亡/退变中的作用打下基础。9.建立和完善与研究神经系统发育相关的解剖学，免疫组化及体内成像等实验技术，检测上述基因敲除小鼠是否出现中枢神经系能发育异常。10

25、.完成多个神经细胞特异性gs敲除小鼠品系的制备及验证，包括gsf/f-nex-cre, gsf/f-nestin-cre和 gsf/f-nestin-creer，为研究gs在神经元极化中有作用和分子机制打下基础。11.建立并完善膜片钳技术测定轴突和树突专一的钾钠通道，并利用此技术初步研究gs在神经元极化中的作用。12.多个bdnf转基因小鼠系的制备和验证，包括bdnfmet´thy1-egfp，bdnfwt´thy-egfp，为研究bdnf在神经突起形态发生中的作用和分子机制打下基础。13.确定bdnf及其受体trkb在神经元活性调控突起生长中的作用，以及bdnfmet突变

26、是否干扰了此过程及其机制。14.建立线粒体自噬速度的萤光测定方法，并确定能明显提高或降低线粒体自噬速度的ad、pd相关突变。15.建立线粒体自噬调节因子的细胞筛选系统，包括果蝇的tom20-dendra2稳定细胞株和rnai库，并通过早期测试，确定大通量筛选的可行性。第二年1.确定rheb1、rheb2、shank3是否与大脑皮层、海马神经元和小脑蒲肯野细胞发生、极化、网络化及死亡相关。2.探索rheb/mtor信号异常引起神经祖细胞损失的细胞机制。3.确定tfr和fpn中枢神经系统敲除小鼠是否与神经元的发生、极化和网络化相关。4.确定tfr和fpn中枢神经系统敲除小鼠是否出现早期神经细胞异常

27、死亡和退变。5.确定gsf/f-emxl-cre，gsf/f-nex-cre, gsf/f-nestin-cre和gsf/f-nestin-creer基因敲除小鼠是否出现大脑发育和神经元极化异常。6.探讨gs与神经细胞极化分子如par3，par6，lkb1或numb等的转运和定位的关系。7.通过转基因小鼠观察bdnfmet变异导致的神经元树突发生异常有无脑区的特异性，是否有不同脑区间的神经环路改变及其相应的行为学异常。8.研究bdnf及其受体trkb参与活性调控神经突起形态发生的分子细胞学机制。9.完成线粒体自噬调节因子的筛选，并在体外培养的细胞中验证所筛选出的果蝇基因及其哺乳类同源基因具有线

28、粒体自噬的调节功能。10.研究ad、pd相关突变是否通过改变线粒体通透性骤变孔（mptp）的开关来引发或抑制它们的自噬，并进一步探讨它们影响mptp的生化机制。完成上述研究内容，以此为基础进行后三年研究方向的调整，争取在神经细胞发育过程的两个事件进行重点突破，如大脑皮层神经元或小脑蒲肯野细胞极化和神经突起形态发生与大脑或小脑正常结构功能形成的关系及其分子机制。1.明确rheb1、rheb2敲除是否引起大脑皮层、海马神经元和小脑蒲肯野细胞的发生和极化异常。2.确定 rheb1、rheb2中枢神经系统敲除小鼠大脑皮层、海马神经元树突和轴突的发育是否受阻、网络化是否异常。3.在单细胞水平确定rheb

29、1是否影响神经元极化分子的表达和空间定位。4.确定shank3中枢神经系统敲除小鼠脑体积及组织结构是否异常。5.进一步确定rheb1缺失的神经祖细胞是否具有线粒体功能障碍。6.确定rheb1缺失的引起的神经祖细胞损失是否于由过度自噬和（或）线粒体功能障碍。7.提供多方面证据证明tfr或fpn敲除神经元的发生、极化或网络化出现异常，如在大体水平和组织学水平脑形态结构是否异常，为进一步利用nestin-creer小鼠在神经前体细胞里定时定量地敲除floxed-tfr或fpn,并用报告小鼠rosaegfp标记基因敲除的细胞提供依据。8.从多方面证明tfr或fpn中枢神经系统敲除小鼠是否出现早期神经细

30、胞异常死亡或退变。9.确定gsf/f-emxl-cre，gsf/f-nex-cre, gsf/f-nestin-cre和gsf/f-nestin-creer基因敲除小鼠大脑结构功能是否异常，轴突、树突的长度和形态功能是否有缺陷。10.确定gsf/f-emxl-cre，gsf/f-nex-cre, gsf/f-nestin-cre基因敲除小鼠大脑神经元中细胞极化分子，如par3，par6，lkb1或numb等的转运和定位是否异常。11.明确bdnfmet小鼠神经元树突和树突棘是否具有形态缺陷，这种缺陷存在哪些脑区，是否有相对应的小鼠行为学改变？12.明确bdnf及其受体trkb参与活性调控神经突

31、起生长的机制及其胞内信号通路。13.完成线粒体自噬调节因子的筛选，通过验证，估计可获得10个调节因子。14.确定能改变mptp通透性的ad、pd相关突变，阐明它们的作用机制。第三年1.探讨rheb或shank3影响神经元发育、极性的形成及大脑和小脑皮质结构功能的分子或细胞机制。2.利用带有报告基因的rheb1敲除小鼠（rheb1f/f-synapsin1-cre rosa26-egfp），观察rheb1敲除神经元是否同样有效的参与形成稳定的神经网络及其功能是否异常。3.确定rheb/mtor信号异常引起神经祖细胞过度自噬与线粒体功能障碍的关系。4.利用rosaegfp报告基因敲除小鼠，制备在神

32、经前体细胞里定时定量地敲除floxed-tfr或fpn的小鼠，并探讨tfr、fpn、numb和numblike在极化过程中的神经元定位与突起分化、生长的关系。5.探讨上述蛋白在神经元内极化与分子的定向运输中的作用。6.筛选tfr、fpn、numb和numblike相互作用蛋白。7.验证gs是否通过调控其下游分子pka进而调节神经元的极化。8.筛选在神经元极化过程中gs的结合蛋白。9.蛋白质组学分析bdnf和trkb胞内运输、bdnfmet聚积的分子基础。10.利用电生理技术探讨bdnfmet对神经突触传递的影响。11.在培养的细胞中研究所筛选出的线粒体自噬调节因子的作用机制。12.利用体外培养

33、的突变神经元，研究不同线粒体调节因子的缺失导致神经元发育异常或退行性病变的分子机制。1.从多方面提供证据确定rheb1或shank3通过调控神经前体细胞增殖、分裂方式，在时间或空间上影响大脑皮层、海马和小脑神经元发生和生长。2.初步揭示rheb/mtor信号通路调节大脑皮层、海马神经元和小脑蒲肯野细胞极化的分子机制。3.证实rheb1或shank3通过影响大脑皮层、海马神经元树突或轴突发生和生长（与神经活动相关的）从而影响大脑和小脑正常结构功能，包括形成稳定的神经网络。4.利用rheb1f/f-synapsin1-cre rosa26-egfp小鼠，确定rheb1敲除神经元与野生型神经元是否同

34、样有效地参与神经网络化的形成。5.明确rheb1敲除小鼠是通过以下何种机制引起轴突和树突缺陷：a）神经元树突或轴突极性形成障碍；b)轴突和树突生长不良。6.确定rheb1缺失引起的神经祖细胞线粒体功能障碍是其形成过程受损还是过度自噬。 7.确定敲除tfr、fpn、numb或numblike是否引起极化过程中的神经元定位或突起分化、生长的异常。8.确定上述蛋白是否引起神经元内极化或分子的定向运输的异常。9.筛选tfr、fpn、numb或numblike相互作用蛋白并通过体内外实验验证其相互作用。10.确定gs是否通过下游信号分子pka调节神经元极化。11.筛选并验证在神经元极化过程中激活gs的结

35、合蛋白。12.验证并鉴定在bdnf和trkb胞内运输以及bdnfmet聚积中起重要作用的分子，进一步研究这些分子在神经元突起生长中的作用。13.体外培养野生型和bdnfmet小鼠的海马、小脑神经元，记录突触受体电流的关键数据，初步调查bdnfmet小鼠的突触传递是否异常。14.阐明2-3个线粒体自噬调节因子的作用机制。第四年在第3年工作基础上就3至4个内容进行重点突破，如：1.探讨rheb1或shank3影响与神经活动相关的树突或轴突的发生和生长，从而影响形成稳定的神经网络的分子机理。2.重点突破rheb1或shank3影响神经元极性的形成和大脑、小脑正常结构功能的分子机理。3.进一步明确rh

36、eb/mtor信号通过调节自噬对线粒体功能的影响。4.利用tfr、fpn、numb和numblike敲除小鼠研究调控极化过程中的神经元定位与突起分化、生长的机制。5.利用tfr、fpn、numb和numblike敲除小鼠研究上述蛋白在神经元内极化与分子的定向运输中的作用机制。6.初步验证2-3个tfr、fpn、numb或numblike相互作用蛋白是否与神经元发生和极化及突起生成有关。7.从gs的结合蛋白中筛选并鉴定在神经元极化过程中激活gs的外源信号和受体。8.探讨上述受体与神经元极化的关系。9.探讨环境因素对bdnfmet相关精神疾病的影响。10.利用电生理技术进一步明确bdnfmet对神

37、经突触传递的影响。11.利用不同的cre小鼠品系在神经元发育不同的阶段敲除以上线粒体自噬调节因子，分析它们的缺失是否引起神经元的发育异常或退行性病变。12.探讨ad、pd相关突变与新筛选出的线粒体自噬调节因子之间的相互关系。备注：对rheb/mtor信号通路在神经细胞发生，极化，网络化与神经细胞死亡和退变中的作用研究有显著突破。1.初步揭示rheb1或shank3导致神经活动相关的树突或轴突的发生和生长异常，从而影响形成稳定的神经网络的分子机理。2.确定rheb1敲除小鼠中调节轴突和树突生长的关键信号通路是否异常。3.进一步确定缺失rheb1或shank3影响神经元的极性形成并引起大脑和小脑的

38、结构功能异常的分子机理。4.从生化实验方面进一步明确rheb1缺失引起的过度自噬是否与线粒体功能障碍直接相关。5.确定tfr、fpn、numb或numblike调控极化过程中的神经元定位与突起分化、生长的机制。6.确定上述蛋白在神经元内极化与分子的定向运输中的作用机制。7.通过体内外实验确定与神经元发生和极化及突起生成有关的tfr、fpn、numb或numblike相互作用蛋白。8.从gs的结合蛋白中筛选并鉴定1-2个在神经元极化过程中激活gs的外源信号和受体。9.确定上述受体在神经元极化中的作用。10.从神经解剖结构、电生理、行为学三个角度进行研究，明确不同环境（丰富环境及应激环境）对bdn

39、fmet遗传的影响。11.明确bdnfmet小鼠海马和小脑神经元的兴奋型突触后电流的频率和幅度，以及ampa受体动力学特性和单元电导值是否出现异常。12.确定线粒体自噬在神经元发育过程中的作用和调节机制。13.确定线粒体自噬异常导致神经元退行性死亡的分子机制。14.确定ad、pd相关突变是否通过影响新筛选出的调节因子来改变细胞内的线粒体自噬水平，并进一步阐明它们的作用机制。第五年1.进一步完善第四年的研究内容。2.着重在生化机理方面有所突破，如，探讨rheb/mtor信号是否影响与神经细胞极化、神经突起的形成、网络化相关的基因转录与蛋白质合成；初步揭示rheb/mtor对自噬在神经元发育与退行

40、性病变中的功能调控的分子机制，切实做到表型/功能分析与机理有机结合。3.着重在与神经元发生相关的铁离子代谢生化机理方面有所突破。4.着重在gs与神经元极化的机理中取得突破。5.着重在bdnf和其受体trkb调控神经突起形态和功能的分子机制研究中取得突破。6.着重在线粒体自噬的调节机制及ad、pd相关突变对它的影响方面取得突破。7.着重在线粒体自噬调节神经元发育和防止神经元退行性病变方面取得突破。1.全面完成计划研究内容。2.rheb/mtor信号在神经元发生、发育中的功能研究方面，总结发表论文约10篇，其中影响因子10分以上论文3-4篇。3.铁离子代谢在神经元发生、发育功能研究方面，总结发表论

41、文约5篇，其中影响因子10分以上论文3篇。4.gs与神经元极化的机理研究方面，总结发表论文约5篇，其中影响因子10分以上论文3篇。5.bdnf在神经突起形态中的功能研究方面，总结发表论文约6篇，其中影响因子10分以上论文2篇。6.线粒体自噬的调节机制及其在神经退行性疾病中的变化方面发表论文6篇，其中影响因子10分以上论文2篇。7.线粒体自噬在神经元中的功能方面发表论文3篇，其中影响因子10分以上论文2篇。登记序号： 项目编号：中医药、中西医结合科研项目课题设计书课题名称：痛痹颗粒对骨关节炎细胞凋亡和增殖的机理研究申报单位： 江苏省中医院课题负责人： 朱萱萱计划年限：邮政编码： 210029 联

42、系电话： 8661714130306申报日期：江苏省中医药局制填写提纲一、立项依据：与选题直接相关的国内外现状、水平和发展趋势；选题的理论和实践依据；研究目的、意义；本研究达到的科学技术水平，预期社会经济效益和应用推广前景。二、科研假说或技术构思，主要研究内容、关键技术、目标（达到的主要技术指标或技术经济指标），技术特征及创新之处，开发项目应说明开发规模。三、研究试验方法及技术路线（工艺路线）。四、现有工作条件和基础：开展本项研究的技术优势，现有的主要仪器设备及应用合格实验动物的基本条件等；已有工作基础，预试验情况。五、计划进度：根据总的研究期限、年度计划进度，分别列出具体的目标和进度的考核指

43、标。六、参加（协作）单位意见及具体分工（附协议书）。七、经费概算（包括其他部门的拨款、贷款、自筹记忆取得的自主）和核算依据，以及分年度使用计划。填写说明一、内容填写自备附页，用纸大小和封页一致，字迹清楚，装订整齐后按申报要求上报。二、填写提纲所列内容，要全面详细、如实填写。三、封面上“登记序号”“项目编号”请勿填写。1、 立项依据1.1 研究目的、意义骨关节炎（osteoarthritis，oa）又称退行性关节病，以关节软骨发生弥漫性龟裂、纤维化和脱失及因骨组织增生性变化为特征的一组临床征候群，是多见于中年以后的慢性进行性关节疾患。该病发病率随年龄增长而升高，据调查，在美国目前2亿多人口中，就

44、有骨关节炎4500万，发病率占总人口的20%，在老年人中所占比例更高，50岁以上人群中，oa的患病率仅次于心血管疾病，位居第二位。在我国，根据流行病学调查显示，5564岁的人群中发病率达40%，而65岁以上人群的患病率达60%90%。随着计划生育政策的长久实施及经济发展，我国已进入老龄化社会，oa的发病率还将越来越高，这不仅严重危害人民的生活、健康，对社会也将造成很大负担。同时世界其他国家也面临着同样的问题，因而oa引起了国际、国内医学界的相当重视。近年来对oa的研究颇多，在发病机制、检测手段以及治疗方法上均取得较大进步，但总的来说还缺乏令人满意的突破性进展。西药治疗oa的主要手段是非甾体药，

45、但存在副作用大、作用单一及有较多禁忌症等缺点。虽然中药治疗oa也取得了一些经验，但对其具体的作用机制有深入研究的却很少，因此在中医理论的指导下，运用现代科学技术，对疗效确切的中药复方进行深入的机理研究，使中药治疗oa的疗效在国际先进行列中占一席之地，是摆在我们面前非常重要的课题。1.2 国内外现状水平和发展趋势近十年来，国内外对oa进行了较深入地研究，大致归纳如下：1.2.1 流行病学研究已广泛开展在近100种不同类型的关节疾病中，oa是影响人类健康最常见的关节疾患之一，没有明显的种族和地域差异，本病的患病率随年龄增加而增高，故随着人类平均寿命的延长，患病率也有增高的趋势。felson等报道7

46、0岁以下人群膝oa患病率为7%（男6.4%，女11.4%），80岁以上为11.2%（男5.4%，女15.8%）；而放射学膝oa70岁以上为27.4%（男30.4%，女25.1%），80岁以上为43.7%。butter等报道，44岁以下、4559岁、60岁以上人群中，放射血oa 患病率各为6.2%、21.6%和42.0%。国内陈顺乐等队13541名钢铁工人的调查结果显示，症状性oa患病率2.2%；无症状性oa患病率53%，其中3039、4049、5059岁患病率各为11%、27%和62%。汕头大学医学院统计551例，结果40岁以下、4049、5059和60岁以上各占12.2%、17.4%、26.

47、1%和44.3%。另外不同关节oa易感性不同。美国在卫生统计中心调查结果，oa患病率以手最高，以下依次为足、膝、髋。国内陈顺乐等调查结果oa是颈椎最多，以下依次为腰椎、膝、手和腕。本病性别差异在脊柱差别不大，但手、膝、髋oa均以女性较多，且女性骨关节炎的遗传易感性较男性高。在framingham的研究中，felaon等发现女性体重减少11磅，骨关节炎形成的风险相应减少50%。 saase等调查结果，膝oa患病率男、女峰值分别为24.7%和54.6%。根据1994年统计，在美国，骨关节炎的消耗为155亿美元，约为类风湿关节炎的3倍，其中一半以上消耗缘于工作丧失。在我国虽未作全国大范围的普查，但随

48、着老龄化社会进程的不断加快，oa的发病率会越来越高，这必将给家庭、社会带来沉重负担。1.2.2 病因、发病机制有了巨大突破目前基础研究认为软骨的损伤与退变是oa的根本，随着分子生物学免疫学的发展，近年来众多学者对oa关节软骨退行性改变的原因从不同角度进行了大量研究，其发病机制仍未完全明了，又提出了许多学说，如软骨下骨内高压学说：由于骨血液动力学的改变，在骨髓腔容积不变的前提下增加内容物引起压力增高，即表现为骨内压力增高。骨内高压持续增高存在下关节滑液ph值下降，成分改变，干扰并破坏了软骨细胞的正常代谢导致细胞变性坏死，胶原纤维解聚，蛋白多糖分解，软骨下骨破坏、修复，最终产生骨性关节炎。自由基学

49、说：认为自由基对软骨细胞dna和pg的合成具有抑制作用。自由基作用软骨细胞后，引发膜脂质过氧化，使脂质过氧化代谢产物丙二醛增多，丙二醛可与dna发生交联，自由基也可直接攻击软骨细胞dna即合成dna所需的酶，使dna链断裂、碱基损伤从而影响了dna的合成，也造成前列腺（pg）合成障碍。骨关节炎时，滑膜、滑液、血管翳内常有中性白细胞、巨嗜细胞浸润，其表面受免疫复合物、补体等作用能释放大量o2-和h2o2；细胞因子学说：细胞因子对骨关节炎的发生、发展起了重要作用，如白细胞介素-1（il-1）、白细胞介素-6(il-6)、肿瘤坏死因子（tnf）等在oa中水平明显增高。il-1具有刺激软骨细胞分泌一氧

50、化氮、前列腺e和il-6的作用，引起滑膜炎症和疼痛，同时il-1也是软骨基质降解的主要驱动因子；软骨酶降解学说：oa软骨细胞的基质降解酶类的合成与分泌率明显增加，并与关节炎的严重程度密切相关。参与降解基质大分子的降解酶类可以增加达到几倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白。基质金属蛋白酶，尤其是基质溶素和胶原酶，参与关节软骨的降解过程，这些酶类可以降解细胞外基质的所有成分，与循环系统中的纤维蛋白溶酶和局部合成的纤溶酶原一起，快速降解软骨。在滑膜细胞和软骨细胞产生的il-1和tnf的作用下，软骨细胞以酶原的形式分泌大量的基质金属蛋白酶，而对金属蛋白酶组织抑制剂无影响，使二者失衡从而增加对

51、软骨主要成分型胶原和蛋白聚糖合成的抑制作用，使软骨进行性破坏；一氧化氮学说：no是一种细胞间信使分子，可介导许多生物学现象。nos可催化重要炎性介质no的产生，oa患者血清、滑液中no含量明显高于正常。no可通过抑制软骨细胞增殖，促进软骨细胞凋亡，改变蛋白多糖和胶原蛋白的合成与分泌功能，同时使软骨细胞分泌透明质酸减少，滑膜粘蛋白解聚，抑制软骨细胞合成软骨基质，促进软骨细胞糖酵解，使软骨破坏。细胞凋亡学说：细胞凋亡是细胞死亡的形式之一，许多正常组织均可发现凋亡，但凋亡亢进与不足则会引起相关疾病，在骨关节炎患者软骨中软骨细胞的凋亡有异常表现，且凋亡细胞数目与骨关节炎严重程度明显相关。凋亡小体存在于

52、软骨细胞小孔或间隙内，其产生的焦磷酸盐能从溶液中沉积钙，有ntpph（nucleosid triphosphate pyrophos phohydrolase）和碱性磷酸酶作用,造成余下软骨细胞修复过程失败，而逐渐发展成关节软骨的完全丢失。oa软骨细胞凋亡主要通过两种相互独立的途径完成，一种是同滑膜炎症无关的途径,由no介导;另一种是同滑膜炎症相关的途径,由fas介导。典型的oa不存在明显的炎症反应,此时软骨细胞凋亡以no途径为主;当产生炎症反应时,则通过as途径加剧软骨细胞凋亡和关节破坏。no通过两种方式造成组织及细胞损伤。一是高浓度的no能抑制多种与线粒体呼吸传递系统及柠檬酸循环有关的酶,

53、从而抑制线粒体呼吸,造成组织损伤;二是no与超氧化阴离子2-反应,生成氧化亚硝基阴离子onoo-,在酸性条件下(如病理条件)迅速分解为oh-和no2自由基,这两种自由基具有很强的细胞毒性,可造成组织细胞损伤。在oa患者中,受损区软骨细胞的凋亡比例明显高于未受损区。fas表达的结果与其相符,oa受损区的fas表达远高于未受损区,提示fas表达可诱导软骨细胞凋亡。除no途径和fas途径外,还有一些因素可导致软骨细胞凋亡、关节破坏,如il-1、il-8、tnf-、pge2、aggrecan g1区等。1.2.3 治疗方面有了不少新方法目前中西医治疗oa的药物较多，西药治疗oa主要有三大类，第一类为快

54、作用药，即非甾体药，特点是发挥作用快，但副作用较大，对胃肠、肝肾、血小板均有较大影响，oa多为老年人，长期服用此类药尤其不能耐受，且部分药物价格不菲，而且由于过分的镇痛，导致病人失去警惕过分运动，以致出现“消炎痛髋”，从长期疗效来看反而不佳，最新观点认为乙酰氨基酚应作为治疗oa的首选药，但尚有一定争议，且同样存在上述副作用；第二类为慢作用药，发挥作用慢，疗效不确切，价格昂贵，临床上尚未广泛运用；第三类为软骨保护剂，尚未问世。关节清理术、膝关节置换术，适应症较少，费用高，创伤大，病人难以接受。中哦药治疗oa的研究取得了可喜的进步，但中药治疗仍存在较多共性的问题：多属临床经验，无对照组，特别是西药

55、对照组观察，处方不固定。缺乏用客观的最新的国际公认的、量化的临床观察指标及疗效判断标准为手段来寻找治疗oa的中药。未针对oa发病机制进行临床及动物试验从生化、免疫、病理、细胞分子水平来探讨中药的药物作用机理。缺乏高效的、作用综合、副作用小的新药。中医认为oa属痹症中的痹、痛痹、骨痹，认为其病因与年老体衰、长期劳损、外感风寒湿邪有关，明确指出肝肾亏虚、气血不足、筋骨失养为oa的发病基础，而寒湿、痰瘀为病理因素及病理产物。周尊谦等人在传统中医理论基础上，阐述了膝oa骨内高压血瘀证氧自由基之间的密切关系；谢林等论述了膝oa与血瘀证之间的内在联系，旨在为运用活血化淤药治疗oa提供理论依据。治疗方面从古

56、到今绝大部分医家皆针对其病因病机采用益肝肾、强筋骨、补气血治其本；散寒通络、化痰胜湿治其标。独活寄生汤是用于治疗风寒湿痹、关节疼痛和脑血管后遗症的传统固防，具有补肝肾、活血通络之功，临床常见本方加减治疗oa，疗效比较肯定。朱健儿以本方加味治疗262例，总有效率94.7%。单文龙等用本方加减治疗骨关节炎24例，有效率为87.5%。陆智报道用本方加减治疗104例，总有效率91.3%。1.2.4 实验研究方面有了较大的进展随着对oa发病机理的不断深入认识，对oa的实验研究方面也开始了向多层次多角度的方向发展。动物实验不再只局限于微循环和一般抗炎、镇痛试验，现已使用针对oa的动物实验，并采用相关的指标

57、进行检测。目前实验研究内容主要有以下几个方面，研究最多的是oa的血液流变学、氧自由基及一氧化氮含量等，这些试验一般均可通过建立骨关节炎的模型来完成，也可通过使用其它相似的模型检测相关指标来进行，如可建立急性血淤模型来检查血液流变学指标，使用老龄动物通过检测体内sod及mda含量推断药物的抗氧自由基的能力等。在no对oa影响的实验中，一般采用硝酸还原酶法来测定no含量，运用pt-pcr技术测定nos基因表达。il-1、il-6、tnf等细胞因子、软骨降解酶尤其是基质金属蛋白酶、诱导关节滑膜炎症的物质如纤溶酶原/纤溶酶原激活物和前列腺素pge2、软骨细胞的细胞凋亡及增殖情况、性激素水平等也越来越多地被