第六章重组体的筛选与鉴定2008-1

1、转化子和重组子转化子：将导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子重组子：含有重组DNA分子的转化子成为重组子。如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望克隆子选择 (selection) 筛选 (screening)选择：通过外来附加压力（或因素）的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方法。筛选：通过特定的方法，例如核酸杂交以及免疫测定，从被分析的细胞群体或基因文库中，鉴定出真正是所需重组DNA分子的特定克隆过程由于被筛选的大量的菌落和噬菌斑当中，仅有很少的比例含有期望的重组DNA分子，因此需要使用高度敏感和高度特异的筛选方法。 根据所使用克隆载体的特性不同

2、，重组克隆的筛选方法根据所使用克隆载体的特性不同，重组克隆的筛选方法也多种多样。比如，用噬菌体也多种多样。比如，用噬菌体DNA作为载体时就不需要筛作为载体时就不需要筛选，所有正常的噬菌斑都是重组体；当使用选，所有正常的噬菌斑都是重组体；当使用pUC系列载体系列载体时，白色菌落一般都是重组体；如果所用的质粒并不具备时，白色菌落一般都是重组体；如果所用的质粒并不具备明显的鉴别特性，那么我们也可以利用明显的鉴别特性，那么我们也可以利用DNA的酶切分析进的酶切分析进行直接鉴定。比如，从平板上随机挑选行直接鉴定。比如，从平板上随机挑选10个菌落，然后提个菌落，然后提取其中的质粒取其中的质粒DNA分子，并

3、对其进行酶切分析，同样可以分子，并对其进行酶切分析，同样可以准确地选择得到所要的重组克隆，而且同时可以鉴定外源准确地选择得到所要的重组克隆，而且同时可以鉴定外源片段插入的方向，选择得到所要的理想克隆。片段插入的方向，选择得到所要的理想克隆。 有时，我们不仅想知道哪些是重组体克隆，而且想知道有时，我们不仅想知道哪些是重组体克隆，而且想知道重组体克隆中哪些是含有某个基因的克隆（比如在重组体克隆中哪些是含有某个基因的克隆（比如在cDNA文文库的筛选中，我们就需要选择到含有目的基因克隆）。这库的筛选中，我们就需要选择到含有目的基因克隆）。这时我们可以用比较复杂的核酸杂交或免疫化学的方法。时我们可以用比

4、较复杂的核酸杂交或免疫化学的方法。转化率的影像因素1. 载体DNA及DNA重组方面载体自身性质，不同载体的转化效率不同载体分子的空间构象（超螺旋与线性）2. 受体细胞受体细胞除了具备限制重组缺陷性状外，还与所转化载体DNA性质相匹配3. 转化操作方面受体细胞的预处理感受态细胞的制备如：Ca2+诱导的转化细胞与菌龄、氯化钙处理时间（1224h）感受态的保存期、热脉冲时间等4. 转化后重组子的整合与表达遗传学选择法（genetic selection）：主要是根据受体细胞接受了重组DNA分子后所发生的遗传表型变化直接选择重组体的方法。 抗药性、显色、营养缺陷等2. 物理筛选方法：3. 核酸杂交法4

5、. 表达产物分析法筛选的两层含义：将携带有外源插入DNA片段的克隆挑选出来，将携带有外源插入片段的重组体挑选出来PCR方法建立以后，很快应用于基因靶位操作中转化子的筛选。通过在目的突变基因中引人特定的PCR引物顺序，利用PCR方法直接检测转化细胞组份或细胞克隆的DNA结构，以特定扩增DNA片段的有无，鉴别同源重组细胞克隆。Kim和Smithes首先应用PCR方法成功筛选出ES细胞Hprt基因的定点突变克隆。随后，Joyner等应用同样的方法，对小鼠ES细胞的en-2基因进行了定点突变；Zimmer等用PCR方法筛选出同源异型盒基因hoxl.l定 点突变的ES细胞克隆，并得到含该突变的嵌合体小鼠

6、一、抗药性标记及其插入失活选择法一、抗药性标记及其插入失活选择法pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和和Ampr。 Tetr上有插入位点上有插入位点BamH I和和Sal I; Ampr上有插入位点上有插入位点Pst I。1. 原理：原理：（1）四环素：）四环素：（2）氨苄青霉素抗性基因：）氨苄青霉素抗性基因：含含bla基因的菌体产生基因的菌体产生 -内酰胺酶，使氨苄青内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。）（蓝灰色）褪色。抑制细菌生长，但不杀死细

7、菌。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。（3）环丝氨酸：）环丝氨酸：如果在如果在Tetr上插入外源上插入外源DNA，导致四，导致四环素抗性基因失活，可用环素抗性基因失活，可用四环素加环四环素加环丝氨酸丝氨酸平板培养基选择重组克隆。平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。反而被环丝氨酸杀死。（1）四环素抗性插入失活）四环素抗性插入失活

8、无环丝氨酸培养基无环丝氨酸培养基如果如果Ampr上插入外源上插入外源DNA，导致氨苄，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素青霉素指示液选择。指示液选择。 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 乳糖乳糖半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖Xgal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝+深蓝色深蓝色1. 原理：原理：载体载体上有一段上有一段假阳性：假阳性： 如果插入的外源如果插入的外源DNA正好是正好是3的倍数或没有终的倍数或没有终止密码；（不破坏止密码；（不破坏 肽）。肽）。Xgal分解成兰色产物。分解成兰色产物。利用插入的外源基因的利用插入的外源基因的表达产物表达产物特性进行直特性进行直

9、接选择。（只在特定条件下）。接选择。（只在特定条件下）。转化进来的外源基因产物能够弥补受转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。体菌株的突变型缺陷。一、原理：一、原理：1.弥补缺陷弥补缺陷his- -his+ +受体菌：受体菌：外源基因：外源基因：在不含组氨酸的在不含组氨酸的培养基中生长培养基中生长小鼠的二氢叶酸还原酶（小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧）对三甲氧苄二氨嘧啶苄二氨嘧啶(抑制大肠杆菌生长抑制大肠杆菌生长)有抗性。有抗性。DHFR载体载体连接连接转化受转化受体菌体菌三甲氧苄二氨嘧三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板啶培养基平板含含DHFR的克隆才能生长的克隆才能生长例：例：

10、使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。降解利用有插入片段的重组载体的分子量比利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。野生型载体分子量大。一、直接电泳检测法一、直接电泳检测法从转化后的菌体克隆从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、中分离质粒，电泳、比较其分子量。比较其分子量。分子量分子量 Marker载体载体重组克隆重组克隆1. 原理：原理：根据已知的外源根据已知的外源DNA序列的限制性酶切序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。带数和长度）。或用

11、合适的内切酶切下插入片断，再用或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。否符合预计的结果。酶切前酶切前酶切后酶切后插入片断插入片断载体载体ABA或或B用EcoRI和Hind分别切割同一来源的染色体DNA,并进行克隆,在前者的克隆 中筛选到A基因,但在后者的克隆中未筛选到A基因,请说明原因. 1. 原理原理PCR能在模板序列上扩增出预期能在模板序列上扩增出预期DNA片断。片断。2. 过程过程（1）从重组克隆中提取质粒（或）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。）。（2）用外源）用外源DNA插入片断引物作插入片断引物作PCR

12、。（3）电泳）电泳PCR产物。产物。（4）检查是否有）检查是否有PCR产物。产物。（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。产物的长度是否与外源基因一致。1. 核酸核酸杂交杂交一、原理：一、原理：重组克隆与探针杂交。重组克隆与探针杂交。3. 识别标记识别标记32P 或或 125I 。（1）放射性同位素）放射性同位素2. 检测用的探针检测用的探针与外源与外源DNA插入片断互补的序列。插入片断互补的序列。（2）非放射性标记）非放射性标记荧光素荧光素用用DNA（或（或RNA）探针检测）探针检测DNA样品。样品。1. Southern blotting从宿主细胞中提取从宿主细胞中提取DNA（或质粒（或

13、质粒载体），再用探针杂交。载体），再用探针杂交。只有带有插入片断的重组载体才能只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。与探针杂交，在底片上曝光显示。酶切前酶切前酶切后酶切后插入片断插入片断载体载体特点：特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。可以直接找出阳性菌落。DNA-RNA杂交。杂交。1）原理：）原理：2）选择过程）选择过程在在70%甲酰胺中，把甲酰胺中，把DNA双链变性，复双链变性，复性的时候，性的时候，DNA-RNA杂交分子比杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见一种双链更稳定。电镜下可见一种R-环环形结构。形结构

14、。用外源基因的用外源基因的mRNA与重组载体杂交。与重组载体杂交。缺点：需要电镜！缺点：需要电镜！用用DNA（或（或RNA）探针检测探针检测RNA样样品。品。主要检测插入片主要检测插入片断是否被转录。断是否被转录。从宿主细胞中提从宿主细胞中提取取RNA，再用探，再用探针杂交。针杂交。 在某些情况西下,如待测的重组克隆子既无任何可供选择的基因表型特征,又无理想的核酸杂交探针时,可以考虑采用免疫化学检测法.抗体检测法免疫沉淀检测法利用抗体作为利用抗体作为“探针探针”来检测转入受体菌来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。并且表达出相应的蛋白质的外源基因。根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二

15、抗）根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：的性质可分为几种作用方式：1. 抗体与产物的结合方式抗体与产物的结合方式对表达产物的检测。对表达产物的检测。蛋白蛋白蛋白蛋白“杂交杂交” 待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗125I 标记的二标记的二 抗结合蛋白抗结合蛋白固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗125I标记的二抗标记的二抗固相支固相支持滤膜持滤膜待待测基因测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗固相支固相支持滤膜持滤膜固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗 二抗二抗125I 标记的二抗标记的二抗 结合

16、蛋白结合蛋白125I标记的二抗标记的二抗质粒基因质粒基因A插入基因插入基因B表达表达质粒蛋白质粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B融合蛋白融合蛋白检测融合蛋白。检测融合蛋白。既检测外源基因产物又检测载体基因产物。既检测外源基因产物又检测载体基因产物。固相支固相支 持滤膜持滤膜抗抗A抗体抗体125I标记的标记的 抗抗B抗体抗体质粒蛋白质粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B质粒蛋白质粒蛋白A外源蛋白外源蛋白B固相支固相支 持滤膜持滤膜抗抗A抗体抗体发光，底片曝光发光，底片曝光1. 原理原理检测目的基因相对应的标记抗体。检测目的基因相对应的标记抗体。免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体

17、和抗原以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是：当细胞在非变性条件下被当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀的抗体免疫沉淀X，那么与那么与X在体内结合的蛋白质在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于常用于测定两种目标蛋白

18、质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。2. 优缺点优缺点其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； （3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。对

19、于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。 灵敏度不高灵敏度不高, 实用性差实用性差Enzyme-linked immunosorbant assay1. 原理：原理：一抗（一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。与目标分子的特异结合。 二抗（二抗（secondary antibody）：）： 与一抗的特异性结合。与一抗的特异性结合。 酶连（酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶二抗上携带一种酶能催化一种反应将无能催化一种反应将无色的底物转变为有色

20、的物质（或发光），再色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。从而推测目标分子的含量。待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗酶酶 待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗 二抗二抗无色的底物无色的底物有色的产物有色的产物比色观察比色观察酶酶 19（1）固定样品）固定样品将待测样品加入将待测样品加入96孔微量滴定板孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后）的孔中，干燥后就被固定在就被固定在孔底孔底。孔底孔底加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。加入一抗，反应后冲洗

21、掉未结合的抗体。一抗一抗加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。抗冲洗掉。二抗只识别一抗。二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。酶、脲酶等）。二抗二抗加入无色的底物，被二抗上所带的酶催加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。化反应转变成有色物质（或发光）。在特殊的分光光度仪（在特殊的分光光度仪（酶标仪酶标仪）上比色，打）上比色，打印出结果。印出结果。有效，但准确性稍差（有效，但准确性稍差（主要取决于一抗主要取决于一抗的特异性的特异性）。）。 必须与其他方法一起

22、综合考虑。必须与其他方法一起综合考虑。最好用单克隆抗体（最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）1.1.原理：原理：在蛋白质凝胶电泳以后，用在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫转膜和免疫的方的方法检测胶上的蛋白质泳带。法检测胶上的蛋白质泳带。（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质蛋白质维持线性状态维持线性状态，并与蛋白质，并与蛋白质结合，使蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷带上负电荷。 SDS:（SDS-PAGE）：）：（Polyacrylamide gel electrophoresis）在电场的作用下

23、线性在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极胺凝胶介质中向正极移动，移动，移动的速率主移动的速率主要取决于其分子量大要取决于其分子量大小（链的长短）小（链的长短），从，从而把不同分子量的肽而把不同分子量的肽链分开。链分开。电泳电泳buffer电泳电泳buffer点样点样电泳方向电泳方向已知分子量的蛋白质已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。白质提供分子量估计。商品化供应商品化供应Da道尔顿道尔顿( (质量单位质量单位, , 等于等于一氧原子质量的十六分一氧原子质量的十六分之一。之一。 一克约

24、为一克约为6 610102323道尔顿道尔顿DaltonSDS PAGE考马斯亮蓝：考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出灵敏度底、只能检出0.3-1g/带，但可带，但可褪色回收。褪色回收。 硝酸银：硝酸银： 灵敏度高、可检出灵敏度高、可检出2-5ng/带。带。2）转到膜上进行染色。）转到膜上进行染色。1）直接染色）直接染色电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、膜、中性尼龙膜等）。中性尼龙膜等）。 Western（转膜）（转膜）胶里的蛋白质带在电胶里的蛋白质带在电场的作用下场的作用下横向横向转移转移到正极一

25、侧的膜上。到正极一侧的膜上。膜膜胶胶蛋白蛋白原理与原理与ELISA相同。相同。待测蛋白待测蛋白硝酸纤硝酸纤 维素膜维素膜一抗一抗 二抗二抗辣根过氧辣根过氧 化物酶化物酶底物底物产物，产物， 并发出光并发出光PAGE胶胶待测蛋白待测蛋白底片曝光底片曝光辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶：HRPO1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。膜上的蛋白结合。2）洗去未结合的一抗。）洗去未结合的一抗。3）用二抗与一抗结合（）用二抗与一抗结合（二抗上带有二抗上带有HRPO）。）。4）清洗掉未结合的二抗。）清洗掉未结合的二抗。5）用）用HRPO的底物浸泡膜。的底

26、物浸泡膜。6）暗室里曝光，冲洗胶片。）暗室里曝光，冲洗胶片。Immuno Blotting多克隆抗体多克隆抗体Blotting的的结果结果单抗单抗blotting结果结果转译筛选法有两种:杂交选择转译（hybrid selected translation,HART)杂交抑制转译(hybrid arreated translation,HRT)。转译筛选法的突出优点是将克隆的DNA同所编码的蛋白质产物之间的关系对应起来。借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。上外源基因的转录，来筛选其产物是

27、否符合预期。一、无细胞翻译系统一、无细胞翻译系统无细胞系统无细胞系统 cell-free system 指保留蛋白质生物合指保留蛋白质生物合成能力的细胞抽取物。成能力的细胞抽取物。无细胞系统要包含以下成分：核糖体、各种tRNA、各种氨酰-tRNA合成酶、蛋白质合成需要的起始因子和延伸因子以及终止释放因子、GTP、ATP、20种基本的氨基酸。常见的无细胞翻译系统有：大肠杆菌无细胞翻译系统、兔网织红细胞无细胞翻译系统、麦胚无细胞翻译系统和某些肿瘤细胞制备成的无细胞翻译系统。 适用于适用于mRNA转录丰度高的外源基因。转录丰度高的外源基因。mRNA无细胞翻译系统无细胞翻译系统35S标记的标记的 甲硫

28、氨酸甲硫氨酸翻译翻译35S标记的肽链标记的肽链PAGE电泳电泳放射自显影放射自显影比较放射性比较放射性 带纹的位置带纹的位置载体载体+外源外源DNA转录转录与预期的产物与预期的产物分子量相符？分子量相符？mRNA一旦与一旦与DNA杂交成杂交成RNA-DNA双链双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。抑制）。单链单链mRNA核糖体核糖体 小亚基小亚基核糖体核糖体 大亚基大亚基能翻译能翻译mRNADNA核糖体核糖体 小亚基小亚基核糖体核糖体 大亚基大亚基不能翻译不能翻译1. 原理原理1. 原理：原理：在高甲酰胺溶液中载体上克隆的在高甲酰胺溶液中载体上克隆

29、的cDNA与它的与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的放出与它对应的mRNA，进行体外转录。，进行体外转录。 研究其转录产物的性质是否是预期的基研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物（如分子量、免疫源性等）。因产物（如分子量、免疫源性等）。硝酸纤硝酸纤 维素滤膜维素滤膜载体和插载体和插 入的入的cDNA总总mRNAcDNA基因的基因的 mRNA杂交杂交洗脱洗脱cDNA基因的基因的 mRNA体外翻译体外翻译cDNA编编码的蛋白码的蛋白电泳电泳凝胶放射自显影凝胶放射自显影cDNA编编 码的蛋白码的蛋白硝酸纤硝酸纤 维素滤膜维素滤膜载体和插载体和插 入的入的cDN

30、A硝酸纤硝酸纤 维素滤膜维素滤膜载体和插载体和插 入的入的cDNA收集收集35S标记的氨基酸标记的氨基酸专门设计检测能同专门设计检测能同DNA特异结合的蛋特异结合的蛋白质因子。白质因子。待测蛋白质待测蛋白质硝硝 酸酸 纤纤 维维 素素 滤滤 膜膜能与蛋白质结能与蛋白质结 合的合的DNA序列序列放射性标记放射性标记待测蛋白质待测蛋白质硝硝 酸酸 纤纤 维维 素素 滤滤 膜膜能与蛋白质结能与蛋白质结 合的合的DNA序列序列放射性标记放射性标记真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。提供甲基。二氢叶酸二氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸二氢叶酸还原酶（二氢叶酸还原酶（dihyd

31、rofolate reductase，DHFR）1. 胸苷激酶（胸苷激酶（thymidine kinase, tk）（1）TK选择原理选择原理四氢叶酸的必要性四氢叶酸的必要性DHFR氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似物。物。 能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断断dATP、dCTP和和dTTP的合成：的合成：dUMP dATP TTP dCTP 氨甲喋啉氨甲喋啉 抑制抑制 抑制抑制 TK+ +细胞细胞能产生胸苷酸激酶，所以可以利能产生胸苷酸激酶，所以可以利用培养基中的胸苷（用培养基中的胸苷（T）合成）合成TTP，存活。，存活。Ttk次黄嘌

32、呤次黄嘌呤的补救作用的补救作用细胞可以利用次黄嘌呤合成细胞可以利用次黄嘌呤合成dATP和和dCTP。dUMP dATP TTP dCTP 次黄嘌呤次黄嘌呤 补救补救 氨甲喋啉氨甲喋啉 抑制抑制 抑制抑制 HAT培养基：培养基：Tk- - 细胞株。细胞株。TK基因。基因。 宿主细胞宿主细胞 载体标记载体标记含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。的培养基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine）只有转入只有转入TK基因的细胞才能生存。基因的细胞才能生存。20真核细胞核苷酸的合成需要真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸四氢叶酸提提供甲基。供甲基。

33、（1） 选择原理选择原理二氢叶酸还原酶的必要性二氢叶酸还原酶的必要性dUMPdATPTTPdCTP四氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸二氢叶酸二氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸DHFR+ +细胞能产生二氢叶酸还原酶，所细胞能产生二氢叶酸还原酶，所以能合成四氢叶酸。以能合成四氢叶酸。能在能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存的培养基中生存不需要补救！不需要补救！DHFR- - 细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能合成四氢叶酸。以不能合成四氢叶酸。需要补救！需要补救！不能在无不能在无

34、胸腺嘧啶和次黄嘌呤胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存。的培养基中生存。dUMPdATPTTPdATP次黄嘌呤次黄嘌呤补救补救胸苷胸苷补救补救无四氢叶酸提供甲基，无四氢叶酸提供甲基，dNTP合成受阻合成受阻时，时，胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救:DHFR- -细胞株（不能在细胞株（不能在无核苷酸无核苷酸的培的培养基中生长）。养基中生长）。 宿主细胞宿主细胞透析除去血清中的内源性核苷酸，以透析除去血清中的内源性核苷酸，以免补救。免补救。 无核苷酸的培养基无核苷酸的培养基需要需要胸腺嘧啶和次黄嘌呤胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救！补救！ 氨甲喋呤氨甲喋呤“加压加压” 添加少量氨甲喋啉抑制添加少量氨甲喋啉抑制内源性内源性DHFR的的补救作用，可提高选择。补救作用，可提高选择。DHFR+ +基因。基因。 载体标记载体标记只有转入只有转入DHFR+ +基因的细胞才能生存。基因的细胞才能生存。DHFR- -DHFR- -DHFR+ +DHFR+ +livedie无核苷酸的培养基无核苷酸的培养基是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，使细菌的蛋白质合成不能正常进行