单核巨噬细胞(RAW264.7)复苏与培养、消化与冻存

1、单核巨噬细胞(RAW 264.7)复苏与培养、消化与冻存1材料与方法1.1 实验材料1.1.1 细胞及中药单体成分：小鼠RAW 264.7单核巨噬细胞株购自上海细胞库；LPS购于sigma公司；1.1.2 主要试剂RPMI-1640培养液：Gbico公司产品胎牛血清：Gbico公司产品DMSO(批号 DZ0231): AMRESCO 公司产品胰蛋白酶：Merck公司产品青霉素-链霉素：Gbico公司MTT、台盼蓝试剂：Sigm心司产品PBS:上海双螺旋生物科技有限公司TNF-a ELISA试齐【J盒：美国eBioscienc公司1.1.3 仪器CO2培养箱：美国Thermo From宓司酶标仪

2、：Biorad公司倒置显微镜：日本olympus公司高速低温冷冻离心机：彳惠国Eppend0f司侧摆摇床：欧瑞实验器材公司培养瓶/培养皿、24孔/48孔/96孔培养板、离心管：美国BD公司1.2 实验方法1.2.1 单核巨噬细胞(RAW 264.7)复苏与培养：实验操作前，先将水浴锅预先 调至37C,无血清的RPMI- 1640培养液于37 C水浴锅内预热，15 ml的离心 管4 C热平衡；用银子将单核巨噬细胞(RAW 264.7)的细胞冻存管从液氮罐 中取出，浸入含37 c水的烧杯内，轻轻晃动冻存管，冻存管内冰核差不多融 化时取出冻存管移至超净工作台内，用酒精棉球擦拭管口；在 15 ml离心

3、管内加入4 ml含10 % FBS及1 %青霉素-链霉素的RPMI- 1640培养液，再将冻存 管内含细胞的悬液吸至该离心管内，盖上管盖，轻轻摇匀和上下颠倒混匀；继 续添加含10 %胎牛血清、1 %青霉素-链霉素的RPMI- 1640培养液至离心管 刻度14 ml处，盖上管盖，轻轻颠倒混匀；离心机设置 4 C, 1000 rpm,离心 5 min后，小心吸出上清液，然后轻弹离心管底部使细胞团分散，加入含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的RPMI- 1640培养液14 ml,盖上管盖，轻轻颠 倒混匀，4 C, 1000 rpm离心5 min,弃上清液，力口 2 ml无血清的RPMI- 1640

4、 培养液混匀，取50 d细胞悬液使用台盼蓝试剂进行活细胞计数；加细胞培养液稀释至所需的细胞浓度，移至培养瓶内培养内置于含5 % CO2培养箱(37 C)中，1-2 d更换细胞培养液1次，呈贴壁生长，2-3 d用0.25 %胰酶消化传代1 次。1.2.2 单核巨噬细胞(RAW 264.7)消化与冻存单核巨噬细胞(RAW 264.7)消化：实验操作前，先将水浴箱预先调至37 C, 将0.25 %胰酶及含10 %胎牛血清、1 %青霉素-链霉素的RPMI-1640培养液 置于37 c水浴箱中水浴备用，将长满单核巨噬细胞(RAW 264.7)的培养瓶中 原培养液弃去，用PBS洗涤3次，再加入1-2 ml

5、 0.25 %胰酶，使瓶底细胞都浸 入胰酶溶液中，于含5% CO2的37 c培养箱中消化3 min；在倒置显微镜下观 察细胞，原贴壁细胞逐渐趋于圆形时，加入 10 ml含10 %胎牛血清、1 %青霉 素-链霉素的RPMI- 1640培养液终止消化；轻轻敲打培养瓶并用吸管将贴壁细胞 吹打成悬液，分别转移至15 ml离心管中，盖上管盖，轻轻颠倒混匀，4 C, 1000 rpm离心5 min,弃上清液，加4 ml含10 %胎牛血清、1 %青霉素-链霉素的 RPMI- 1640培养液混匀，取50 M细胞悬液进行细胞计数，再加适应量的含10 % FBS及1 %青霉素-链霉素的RPMI-1640培养液稀释至细胞密度为1x106个/ml; 再移至培养瓶或24孔板内培养内置于培养箱(5 % CO2, 37C)中培养。单核巨噬细胞(RAW 264.7)冻存：将备好的细胞冻存管做好标记(RAW 264.7、日期、实验室单位)，配置好一定量的细胞冻存液，配置比例为RPMI- 1640 培养液：血清：DMSO = 7: 2: 1;将已经消化下来的细胞悬液 4 C, 1000 rpm 离心5 min,弃上清液，留下细胞，缓慢加入已经配好的细胞冻存液，轻轻混匀；每个细胞冻存管中加入含冻存液的细胞悬液 1.8 ml,盖上