真空冷冻冷藏保藏菌种

1、真空冷冻干燥保藏冬虫夏草菌种一、微生物菌种保藏一、微生物菌种保藏在一定时间内使菌种不死、不变、不乱在一定时间内使菌种不死、不变、不乱基本要求：基本方法：生活态休眠态培养基传代培养寄主传代培养冷冻干燥斜面、平板液氮、低温冰箱沙土管、冷冻真空干燥 低温冻结保藏是较为传统的，其操作简单，但设备较贵，需长期保持不断电; 液氮保藏法经多年研究被认为是最有效、最安全的，但长期使用液氮需定期添加，并需防止泄漏、操作需谨慎等; 冷冻干燥保藏法是目前研究较多的一种保藏法，其利用升华原理将菌体及保护剂中水分由冰直接转变为蒸气，从而使得菌种处于干燥状态得以保藏。 其特点为: 冻干过程对细胞破坏程度较小，真空镕封污染

2、小，贮藏运输稳定性高，但设备一次性投资高。真空冷冻干燥技术真空冷冻干燥技术是将冷冻技术结合起来的一种综合性技术、亦称真空冷冻升华干燥技术。自20世纪初创立以来，真空冷冻干燥(简称冻干)技术有了很大的完善和发展，从最初的生物制品和医药行业，发展到军需、宇航、石油、地质、海洋、食品等工业领域。尤其在食品工业方面,该技术能够很好地吻合“绿色食品”、“保健食品”、“方便食品”三大发展趋势。二、冷冻干燥的原理及优点真空冷冻干燥是先将湿料冻结到共晶点温度以下,使水分变成固态的冰,然后在较高的真空度下,使冰直接升华为水蒸气,再用真空系统中的水汽凝结器将水蒸气冷凝,从而获得干燥制品的技术。干燥过程是水的物态变

3、化和移动的过程。这种变化和移动发生在低温低压下。因此，真空冷冻干燥的基本原理就是低温低压下传质传热的机理。 图2-1水的三相平衡图 冻干保藏 冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。 冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等的。 大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。培养物的冻干过程培养物的冻干过程冻干菌种的保藏与再生1保藏：冷冻干燥后的培养物在低于5下保藏。较低的保藏温度(-20-70)对于培养物

4、的长期稳定更好。2复苏：(1)在超净工作台中用70酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿中锉一道沟。(2)用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开安瓿。(3)在安瓿中加入0.51ml营养液体培养基，慢慢旋转安瓿，使冻干菌种复水。然后将此转接到一含有再生培养基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板。(4)在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此直接振落入盛有l2ml液体培养基的试管中，轻轻振荡5l0min，然后用此悬液接种适宜的再生培养基。冬虫夏草菌种保藏-操作冷冻真空干燥保藏:将生长旺盛的斜面菌苔转接于液体培养基中， 25 下置于140 r /min 摇瓶培养3 d，得到均匀的菌丝小球。用移

5、液枪取菌丝球于安培管中，用无菌针管注入2 0 ml 所选保护剂，用无菌棉签封口，阶段冷冻，分布于4 冰箱中预冷30 min， 20 冰箱中预冻2 h， 80 冰箱预冻24 h，然后将冻干室隔板取出预冻，再同时迅速置于真空冷冻干燥机内，当冷凝室温度达到 40 时抽真空，于10 Pa 真空压强条件下干燥24 h。当菌种干燥为浅黄色疏松固体时，取出安培管，用酒精喷灯从安培管颈部熔封，于4 冰箱冷藏。冬虫夏草菌种保藏-活化冻干保藏菌种的活化:从4 冰箱中取出安培管，使温度升至室温。用酒精擦拭安培管上部，将安培管口在火焰上烧热，用无菌棉签沾酒精在顶部擦一圈，顶部出现裂纹时，用镊子敲开顶部。取出干粉，将菌种与保护剂的干粉一同置于20 0 ml 无菌水中溶解稀释，用移液枪吸取0.1ml 菌悬液涂布到新鲜平板培养基上培养，观察菌苔萌发、满管时间及长势。对比菌丝得率测定、菌丝生长曲线的绘制、虫草多糖含量的测定、虫草酸含量的测定结论液氮冷冻保藏结果与冻干保