基因文库的构建

1、主要内容 第一节 DNA基因文库 第二节 亚克隆 第三节 克隆DNA序列的体外诱变 第四节 基因编码序列的丙氨酸扫描诱变1DNADNA片段片段的获得的获得载体构建载体构建细菌转化细菌转化重组体重组体的鉴定的鉴定限制性内限制性内切酶消化切酶消化机械切割机械切割双链双链cDNA的合成的合成化学法化学法直接合成直接合成同聚物同聚物加尾加尾粘性末端粘性末端连接连接平末端平末端连接连接加接头造成加接头造成粘性末端粘性末端重组噬菌体重组噬菌体DNA转染转染重组质粒重组质粒的转化的转化体外包装体外包装进行转导进行转导表型鉴定表型鉴定核酸杂交核酸杂交免疫学分析免疫学分析酶切鉴定酶切鉴定大肠杆菌作为寄主进行DN

2、A克隆的实验方案2Eco R1Sal 1Eco R1Sal 1Polylinker Bam H 1Polylinker Bam H 1ABRed+ gam+Sal 1Sal 1 EMBL3AABBam H1Bam H1Red+ gam+Eco R1Eco R1Right arm polylinker oligonucleotideLeft arm polylinker oligonucleotideDigest with Bam H1 and Eco R1ABBam H1Bam H1Eco R1Right armLeft armIsopropanol precipitation polylin

3、ker oligonucleotide not precipitatedTarget high molecular weight genomic DNASau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1OH HOOH HOHOHOHOOH OH OH Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Size fractionation not neccessaryPartial Sau3A1 digest PhosphataseABBam H1Bam H1Right armLeft armSal 1Sal 1Recombinant phage DNA

4、concatemers+Packaging in vitroPlate on P2 lysogen sup+Recombinant (Spi-) phage plaques用载体EMBL3A构建基因组文库3第一节 DNA基因文库 用限制性内切酶酶切整个基因组DNA，把所得到的大量基因组DNA片段与载体连接，然后转化到细胞中去，让宿主菌长成克隆。是某个生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体。 cDNA文库：某个特定物种或器官的所有mRNA的组合。 建立DNA文库的目的：从复杂的基因组中分离基因。4二、 DNA文库的构建（一）、基因组DNA库1、 用克隆载体构建基因组文库Question 1

5、：构建含多少重组子的库能覆盖一个选定的基因组？考虑两个因素：载体的装载能力 目标基因组的大小目标基因组的大小载体装载的平均片段重组子的个数5（一）、基因组DNA库Question2：如何保证目标基因包含在所构建的文库中？考虑两个实际问题： 选择的载体装载量 所用的内切酶对基因组DNA的完全切割频率和不完全切割二、 DNA文库的构建6人类基因组2.8X106Kb置换载体的平均置换片段20Kb重组子的最小数目n1.4X105 考虑取样，酶切等原因，某些基因可能有多个重组子，而某些基因完全不包含。通过概率的统计，人类基因组中某个特异的片段有95概率包含所需要的重组子为 n4.2X105二、 DNA文

6、库的构建72、高容量载体构建基因组克隆 优点：A、所需要的重组子少（即文库中包含的克隆数目较少）。B、目标基因相对比较完整。二、 DNA文库的构建8第二节 亚克隆 概念：对已经获得的目的DNA片段进程重新克隆，目的是对目的DNA进行进一步分析，或进行重组改造等。 过程：1）目的DNA片段和载体制备；2）目的DNA片段与载体相连；3）连接产物的转化；4)重组子的筛选9第二节 亚克隆 对大片段的插入片段进行亚克隆的过程1）首先确定该大片的限制酶酶切图谱2）根据已知的酶谱进行定向克隆3）或鸟枪法进行随机克隆10通过作图标出一个DNA分子上的不同限制性位点。以DNA为例1112按照诱变产生的不同效果分

7、类： 随机诱变：在克隆化的基因序列中随机产生各种诱变。 化学诱变、盒式诱变、随机缺失诱变等 定点诱变：体外特异地改变目的DNA序列中某个碱基的技术称为定点诱变 PCR介导的定点诱变、寡核苷酸介导的诱变（如kunkel法）第三节：克隆DNA序列的体外诱变13第三节：克隆DNA序列的体外诱变一、缺失诱变1、通过从末端或中间删除一些核苷酸序列末端删除部分序列 14末端标记外切酶III处理SI核酸酶处理Klenow 酶，连接酶处理15一、缺失诱变 2、通过酶切图谱完成中间缺失16二、盒式突变1、原理：利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中的相应序列。2、人工合成的突变序列的特征

8、 由两条合成的寡核苷酸组成的,当它们退火时,会按设计要求产生出克隆需要的粘性末端, 由于不存在异源双链的中间体,因此重组质粒全部是突变体。第三节：克隆DNA序列的体外诱变17盒式突变举例1AAGCTTtargetGAATTCTTCGAAtargetCTTAAGHindIIIEco RIA AATTCTTTCGA GAGCTTTAAAGCTTTAAMelt and anneal oligosT4 polynucleotide kinaseGel purify vector DNAMutagenic oligonucleotidesT4 DNA ligaseTransformed into E c

9、oli 优点：快速高效无异源双链的形成无需DNA聚合酶缺点:需要在目标序列的两侧具有限制性内切酶的位点18AGCTGTACXho ISph ICCArg GluIle*Glu Met*Glu AlaVal Ser MetTCGA GAA ATC NNGGAG ATG NNGGAAGCGGTTAGC ATGCTT TAGIIICTC TACIIICTTCGCCAATC盒式突变举例2利用混杂寡聚核苷酸方法的随机突变19第三节：克隆DNA序列的体外诱变三、定点诱变的PCR方法20三、定点诱变的PCR方法 根据靶DNA序列设计一对互补的内侧引物c和b(c和b互补)，他们在相同的位点具有同样的碱基突变；

10、 分别以左侧引物ac和右侧引物bd进行两轮PCR扩增； 除去未参入的多余引物，由于具有重叠序列，故经变性和退火形成异源双链分子 其中只有具3凹陷末端的双链分子可通过TaqDNA聚合酶的及外侧引物a和d的作用下，形成其突变位点是位于靶DNA序列中但远离两端的突变体。第三节：克隆DNA序列的体外诱变21四、引物延伸：单引物法（不依赖PCR反应）1、原理利用一段人工合成的，与互补的序列有一个碱基错配的寡核苷酸片段（720碱基）, 并由该寡核苷酸引导DNA的体外合成。第三节：克隆DNA序列的体外诱变22AGTACGATCTCGAGAGTACGATCTCGAGAGTACGATCAGGCTChemical

11、ly synthesized oligonucleotideSingle-stranded M13 recombinantTCTCGATAGTACGATCTCGAGAGTCCGA(1) DNA polymerase + 4 dNTPs(2) T4 DNA ligase + ATP(1) Screen plaques with 32P-labelled oligonucleotide as hybridization probe;(2) Isolate mutantTransformed E coliWild-typeMutantAnneal(1) 正链DNA的合成 按照体外DNA重组技术,将待

12、突变的DNA片段插入到M13噬菌体上. 然后制备含有目的基因的M13 单链DNA,即”正链”DNA.(2) 突变引物的合成 应用化学方法合成带错配碱基的诱变剂寡核苷酸片段,它在以单链M13DNA作模板的体外DNA合成中是作为引物使用,所以叫做突变引物序列,或”负链” DNA23(3) 异源双链DNA的制备 将突变引物DNA5端磷酸化后,与含目的基因的M13单链DNA混合退火. 结果在待诱变的核苷酸部位及其附近形成一小段具碱基错配的异源双链DNA。在Klenow酶的催化下，引物链以M13单链DNA为模板，直至合成出全长的互补链。再由T4DNA连接酶连接，最终在体外合成出闭环的异源双链M13DNA

13、分子。AGTACGATCTCGAGAGTACGATCTCGAGAGTACGATCAGGCTChemically synthesized oligonucleotideSingle-stranded M13 recombinantTCTCGATAGTACGATCTCGAGAGTCCGA(1) DNA polymerase + 4 dNTPs(2) T4 DNA ligase + ATP(1) Screen plaques with 32P-labelled oligonucleotide as hybridization probe;(2) Isolate mutantTransformed E

14、 coliWild-typeMutantAnneal24AGTACGATCTCGAGAGTACGATCTCGAGAGTACGATCAGGCTChemically synthesized oligonucleotideSingle-stranded M13 recombinantTCTCGATAGTACGATCTCGAGAGTCCGA(1) DNA polymerase + 4 dNTPs(2) T4 DNA ligase + ATP(1) Screen plaques with 32P-labelled oligonucleotide as hybridization probe;(2) Is

15、olate mutantTransformed E coliWild-typeMutantAnneal(4) 转化 这些体外合成的闭环异源双链DNA分子转化大肠杆菌细胞后，产生出同源双链DNA分子。其中有的是原来野生型DNA序列，有的是含突变碱基的序列，因此，转化子细胞会产生两种类型的噬菌体，一种是野生型的，另一种是突变型的。(5) 突变体的筛选2555Primer CPrimer B55Primer APrimer A55PCRPCRPCRPCR33Mix,denature and annealDNA plotmerase3355+3+3PCR with primer B and prime

16、r C(a)(b)(c)(d)Primer APrimer A26五、寡核苷酸介导的定点诱变1背景介绍（ Kunkel 法）dut-dUTP 酶缺陷，细胞不能把 dUTP 转化为 dUMP ，因此细胞内 dUTP 的含量大为增加，其中一些 dUTP 可掺入 DNA 中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置。ung -UDG 酶缺陷， UDG 酶尿嘧啶（uracil）-N-糖基化酶（glycosylase）可除去掺入 DNA 中的尿嘧啶残基。 27（五）寡核苷酸介导的定点诱变28 Kunkel 法原理，过程包括： 当含目标 DNA 插入载体并进入 E.coli CJ236 由于该菌体 ung- dut-

17、 突变，合成的 DNA 上含有少量尿嘧啶（取代胸腺嘧啶）。 M13K07 辅助感染下，产生带 U 的单链 DNA 。 与引入诱变的引物复性。29 在 T7DNA polymerase 和 ligase 作用下，以带 U 的单链 DNA 为模板合成一条新链，形成杂合双链（新生链中无U碱基）。 感染 dut+ ung+ E.coliMV1190 后，在细胞分裂过程中，只有新合成的 DNA 链才能起模板作用合成新的并引入了诱变位点的子代双链 DNA 。而有 U 的 DNA 链，在 dut+ 和 ung+ 产物的作用下，尿嘧啶被水解，从而失去作为模板的能力。（突变的新生DNA链与模板链分开）30第四节

18、 实例3:基因编码序列的丙氨酸扫描诱变一、研究目的 对Foy蛋白60个氨基酸的小区域进行突变，获得功能信息 对基因中10个带点氨基酸位点进行突变二、可供利用的资源（略）3132Pvu IPX 和AS1引物Pvu IXma IIIAS1Xma IIIXma IIIAS1体外合成Pvu IPvu IAS1+Pvu I处理AS1Xma IIIXma IIIAS1图解说明详见书P6433Eco R1Sal 1Eco R1Sal 1Polylinker Bam H 1Polylinker Bam H 1ABRed+ gam+Sal 1Sal 1 EMBL3AABBam H1Bam H1Red+ gam+

19、Eco R1Eco R1Right arm polylinker oligonucleotideLeft arm polylinker oligonucleotideDigest with Bam H1 and Eco R1ABBam H1Bam H1Eco R1Right armLeft armIsopropanol precipitation polylinker oligonucleotide not precipitatedTarget high molecular weight genomic DNASau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1OH HOOH HOHOHO

20、HOOH OH OH Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Size fractionation not neccessaryPartial Sau3A1 digest PhosphataseABBam H1Bam H1Right armLeft armSal 1Sal 1Recombinant phage DNA concatemers+Packaging in vitroPlate on P2 lysogen sup+Recombinant (Spi-) phage plaques用载体EMBL3A构建基因组文库34Eco R1Sal 1Eco

21、 R1Sal 1Polylinker Bam H 1Polylinker Bam H 1ABRed+ gam+Sal 1Sal 1 EMBL3AABBam H1Bam H1Red+ gam+Eco R1Eco R1Right arm polylinker oligonucleotideLeft arm polylinker oligonucleotideDigest with Bam H1 and Eco R1ABBam H1Bam H1Eco R1Right armLeft armIsopropanol precipitation polylinker oligonucleotide not

22、 precipitatedTarget high molecular weight genomic DNASau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1OH HOOH HOHOHOHOOH OH OH Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Sau 3A1Size fractionation not neccessaryPartial Sau3A1 digest PhosphataseABBam H1Bam H1Right armLeft armSal 1Sal 1Recombinant phage DNA concatemers+Packaging i

23、n vitroPlate on P2 lysogen sup+Recombinant (Spi-) phage plaques用载体EMBL3A构建基因组文库35Eco R1Sal 1Eco R1Sal 1Polylinker Bam H 1Polylinker Bam H 1ABRed+ gam+Sal 1Sal 1 EMBL3AABBam H1Bam H1Red+ gam+Eco R1Eco R1Right arm polylinker oligonucleotideLeft arm polylinker oligonucleotideDigest with Bam H1 and Eco R1ABBam H1Bam H1Eco R1Right armLeft armIsopropanol precipitation polylinker oligonucleotide not precipitatedTarget high molecular wei