蛋白质制备及含量测定(凯氏定氮法)

1、实验六 蛋白质制备及含量测定一微量凯氏（Mirco-Kjeldahl ）定氮法一、实验目的要求1、了解蛋白质提取的一般方法和原理2、了解蛋白质含量测定的常用方法3、学习微量凯氏定氮法的原理4、掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化、蒸储、滴定、含氮量的计算及蛋 白质含量的换算等。二、实验原理1、蛋白质的提取与制备蛋白质的提取与制备方法与生物材料的类型及蛋白质的存在部位 有关。如果 是胞内蛋白，首先必须要进行细胞破碎。细胞破碎的方法与细胞的类型有 关，包 括物理破碎（研磨、超声波等）、化学破碎（化学溶剂处理）、酶法破碎等。如 果是胞外蛋白，可以根据相应蛋白质的性质进行提取分离纯化。如果待提

2、取的蛋白质是具有生物活性的蛋白质如酶，则在样品处理、提取及分离纯化 过程中需注意防止蛋白质的变形失活，如在低温下操作、选择适当的缓冲体系等。2、蛋白质含量测定蛋白质含量测定的方法很多，如：紫外吸收法、双缩胭法、考马斯亮 蓝染色法（Bradford法）、Folin酚法、微量凯氏定氮法等。3、凯氏定氮 生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮 量约为16%,测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯 氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点， 因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方

3、法。 其原理如下：（1）消化：有机物与浓硫酸共热，使有机氮全部转化为无机氮一一硫酸镂。为加 快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步 约需2s3h,视样品的性质而定。天然的含氮有机物（如蛋白质，核酸及氨基酸等）与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二 元素被氧化成二氧化碳和水；蛋白质分解，而有机氮则变成氨（无机氮），并进一步与硫 酸作用生成硫酸镂。此时程称之为“消化”。但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应的沸点，并 加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。甘氨酸的消化过程可表示如下：NH2-CH2 -COOH + 3H2SO4 NHs +

4、 2C6 T + 3s6 T + 4 出 02NH3+H2so4一 （NH4）2S04或 2NH2-CH2COOH +7H2SCU （NFk） 2 S04 + 4CO21 + 6 SO21 + 8H2O（2）加碱蒸储：浓碱可使消化液中的硫酸镂分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸储到一定量、一 定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中的氢离子结合，生成镂根离子。（NH4）2 S04 + 2NaOH NmSCU + 2NHa +2 出 0NH3+ H3BO3- NH4H2BO3或 2NH3+4H3BO3 一 (NH4)2B4O7+5H2O(3)滴定：硼酸吸收氨后，氨与溶液中的氢离子结合，生成镂

5、离子，使溶液中氢离子浓度降低。 然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的当 量数物质的量(相当于待测物中氨的物质的量)计算出待测物中的含氮量，再折算为粗蛋白 含量。NH4H2BO3+ HCI - NH4CI + H3BO3或(NH。2 BQ + 2HCI + 5H2。- 2NH4cl + 4H3BO3滴定时用甲烯 蓝和甲基红混合指示齐I，其指示范围为pH5.25.6,将NH4H2BO3 的绿色滴至原来H3BO3的紫色即为终点。本法适用于0.21.0mg (2.0mg)氮量测定。相对误差应小于2%。图3-1微量凯氏蒸播装置示意图9.1 热源2.烧瓶3.玻璃管4

6、.橡皮管5.玻璃杯6.棒状玻塞7.反应室8.反应室外壳 夹子10.反应室中插管11.冷凝管12.锥形瓶13.石棉网图3-2改进型微量凯氏定氮蒸播装置1水蒸气发生器2.反应室3.水蒸气排气孔4.排水排气孔5 .外源水入口 6.进样口 7.加样漏斗8.冷凝 器9.冷凝器出口 10.自来水入口 11.通气室12.通气室出口 13.通气室出口 14.排水柱15.排水柱入口 16.排水柱入口 17.冷凝水和废水出口三、主要实验试剂和器材1、试剂(1)消化液(过氧化氢：浓硫酸：水二3: 2: 1)(2)硫酸钾一硫酸铜混合物：硫酸钾与硫酸铜(CuSO45H2O)以3: 1 (W/W)的配比 混合研磨成粉末。

7、(3) 30%氢氧化钠溶液(4) 2%硼酸(5)混合指示剂(田氏指示剂)的配制：方法一：取50mL0.1%甲烯蓝无水醇溶液与200mL0.1%甲基红无水乙醇溶液混合 配成， 贮于棕色瓶备用，这种指示剂酸性时为紫色，碱性时为绿色，变色范围窄且灵敏。或方法二:0.1%澳甲酚绿乙醇溶液10mL与0.1%甲基红乙醇溶液2mL混和即成。本指示剂的变色范围为pH 5.2 5.4 5.6紫红色灰色绿色(6) 0.0100 mol L1HCI(7)硼酸一指示剂混合液：取100mL2%硼酸溶液，滴加混合指示剂贮备液，摇匀后溶液呈现紫红色即可。(约加1mL左右混合指示剂)2、待测样品市售面粉3、主要器材（1）分析

8、天平（2）凯氏烧瓶100mL （X 2）（3）容量瓶（50mL）（4）刻度吸管（1mL、2mL）（5） 凯氏定氮蒸偏装置（6） 微量滴定管（3mL、5mL,可读至0.02mL）（7）锥形瓶（50-100mL）四' 操作方法1、样品处理 液体样品（如血清）可以直接消化，而固体样品中的含氮量是1 00克该物质 （干重中所含氮的克数）来表示（%）o因此在定氮前，应将固体样品中的水份除掉。一般 样品干燥的温度都采用105C,因为非游离的水都不能在100C以下烘干。在称量瓶中称入一定量的面粉样品，然后置105c的烘箱内干燥4小时。用地烟将 称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干

9、样品。每 干燥1小时 后，称量一次，直到两次称量的数量不变，即达恒重（土 0.0002g） o精确称取0.1g左右的干燥面粉作为本次实验的样品。2、消化取2个100毫升的凯氏烧瓶，向第一号烧瓶内加0.1g面粉样品。注意，加样品时应 直接送至烧瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶颈上，向2号烧瓶加入0.1毫升蒸 储水作空白对 照。在每个烧瓶内加入硫酸钾一硫酸铜混合物约0.2g,消化液（浓硫酸）5mL,玻璃珠1 粒，摇匀。将烧瓶约60度角固定在铁架上，每个瓶口放一小漏斗，在 通风厨内的电炉上 消化。在消化开始时，应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸 开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，使

10、瓶内液体微微沸腾，大约维持23h继 续消化（待消化液变成褐色后，为了加速完成消化，可将烧瓶取下，稍冷，将30%过 氧化氢溶液12滴加到烧瓶底部消化液中，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成透 明淡蓝绿色，消化即告完成）。直至消化液呈透明绿色为止。消 化完毕，待烧瓶内容物冷 却后，加蒸储水10毫升（注意慢加，边加边摇）。冷却后将瓶内容物转入50毫升的容量 瓶中，并用蒸储水洗烧瓶数次，溶液一并倒入 容量瓶，最后定容至刻度摇匀，做上记号备 用。注意事项（1）小心加样，切勿使样品沾污凯氏烧瓶口部、颈部。（2）消化时，须斜放凯氏烧瓶（45°左右）。火力先小后大，避免黑色消化物溅 到瓶口、 瓶颈壁

11、上。本次实验 消化液已经制备好，备用。从蒸储开始做。3、蒸储（1）凯氏定氮装置的安装：首先固定主体（蒸汽发生器和反应室），高度适合于 热源加 热；然后用橡皮管将各相应部位连接，放上自由夹；最后长橡皮管连接自来水和出水 o（2）蒸储器的洗涤：仪器应先经一般洗涤，再经水蒸气洗涤。洗涤方法：蒸气发生器 中加入一定量水（以排水高度为宜）加热烧开（注意：热源切勿靠近橡皮管，防止将橡 皮管烧化）。向反应室中加入蒸储水，水即自动 吸出（虹吸）；或移开蒸汽发生器的热源 片刻；或打开自由夹，使得冷水进入蒸汽发生器，都可使反应室中的水自动吸出（如 果几种措施都无效，检查装置本身是否有问题如存在裂痕等）。反复清洗3

12、s5次。检验是否洗涤干净：将一只盛有5mL 2%硼酸液和1 2滴指示剂的锥形瓶 置于冷 凝管下端，使冷凝管管口插入液体中，蒸僧数分钟，如硼酸液颜色不变，表明仪器已洗 净。否则继续洗涤直至洗净为止。（3）滴定标准样品：标准硫酸铁溶液先用标准硫酸铁溶液（0.3毫克氮/毫升）试验23次。蒸播器洗净后，开放水龙头，使水进 入蒸汽发生器，水放至球部即可。取3个50毫升的锥形瓶，各准确加入10毫升硼酸（内加有混合指示剂）。用表面皿复加样：用吸量管吸取1mL标准硫酸铁溶液，细心地由加样漏斗倾入反应室，再用蒸僧水1毫升 清洗漏斗。取一个盛有硼酸一混合指示剂的锥形瓶，置于冷凝管下端，使冷凝器管口下端浸没在 硼酸

13、溶液液面下，用量筒从漏斗加入30%氢氧化钠8mL,随即将自由夹夹紧，并往漏斗加入少量蒸 僧水封闭。蒸僧：用酒精灯加热（应用挡风板将灯围拢，维持火力恒定），沸腾不可高于虹吸管口以免整 齐发生器溶液从虹吸管倒吸，待第一滴蒸储液从冷凝柱下端滴下时起，继续蒸播5分钟，然后将锥形瓶放低，使导管离开液面再蒸2分钟，并用少量蒸僧水冷凝管口外壁，蒸僧完毕， 取下锥形瓶，随即将蒸僧器洗净。（3）样品消化液及空白的蒸储取50mL锥形瓶数个，各加5mL 2%硼酸溶液和1 2滴指示剂，用表面皿 覆盖 备用。用吸量管分别吸取5mL/10mL样品消化液按上述操作步骤进行蒸储。a.首先关闭冷凝水，打开自由夹2,使蒸汽发生器

14、与大气相通。将锥形瓶放 在冷凝器 下端，浸没于液面下。b.移取5mL/10mL样品消化液小心加入反应室。将准备好的30%氢氧化钠8mL力口 入，关闭自由夹1,加水封。c.关闭自由夹2,打开冷凝水（不要过猛）d.加热蒸汽发生器，开始蒸储。当观察到锥形瓶中由紫色一绿色（2-3min）,蒸储 3min。放低锥形瓶，继续蒸储1 min,用少量蒸储水洗涤冷凝管下端外侧。取下锥形瓶，以 表面皿覆盖。以备滴定。蒸储完毕，应立即洗涤反应室，方法同前，清洗3s5次。继续进行10mL空白消化 液蒸储。蒸编全部结束后，将反应室清洗干净，废水排出。（4）滴定：蒸镭完毕，分别用0.0100mol-L-1标准盐酸溶液滴定

15、样品消化液蒸 储的锥 形瓶内溶液和空白消化液蒸僧的锥形瓶内溶液至绿色变为淡紫色，记录所用盐酸的量，分 别为V1和V2。注意事项（1）必须仔细检查凯氏定氮仪的各个连接处，保证不漏气。（2）凯氏定氮仪必须事先反复清洗，保证洁净。（3）蒸储时，小心加入消化液。加样时最好将火力拧小或撤去或将蒸汽发生器与大气 相通，避免加入的消化样液发生倒吸。蒸僧时，切忌火力不稳，否则也将发生倒吸现象。（4）蒸馈后应及时清洗定氮仪。（5）凯氏法的优点是适用范围广，可用于动植物的各种组织，器官及食品等成 组复杂样 品的测定，只要细心操作都能得到精确的结果。其缺点是操作比较复杂，含有大量碱性氨 基酸的蛋白质测定结果偏高。（6）普通实验室中的空气中常含有少量的氨、C02,会影响结果，所以操作应在单独洁净的房间中进行，并尽可能快地对硼酸吸收液进行滴定。（7）微量滴定管的使用：清洗干净，用HCI标准溶液润洗；滴定时，小心操作，切勿 滴定过快，尤其是滴定空白样时，因为HCI消耗量可能很小。五、实验结果与分析chci （V1 V2）X 0.014X 100 消化液总量样品的总氮量（克氮%）=X%w测定时用量若测定的样品含氮量部分只是蛋白质，（如血清）贝样品的总蛋白含量（克蛋白%）二总氮量X 6.25若样品中除有蛋白外，尚有其他含氮物质，则样品蛋白质含量的测定要更复杂一些。 首先需向样品中加入三氯乙酸（