靳三针疗法对窒息脑瘫幼鼠神经干细胞增殖与分化的实验研究

1、靳三针疗法对窒息脑瘫幼鼠神经干细胞增殖与分化的实验研究 11-02-25 11:39:00 编辑：studa20 作者：刘乡,柴铁劬,孙娟,张瑞 孟令杰,赵丹,周健洪,陈东风【摘要】 【目的】观察靳三针疗法对脑瘫大鼠神经干细胞(NSCs)增殖与分化的影响。【方法】选用SD新生大鼠,随机分为假手术组、模型组、靳三针疗法治疗组(治疗组,针刺百会、颞针、曲池、内关、足三里、涌泉),模型组与治疗组均采用结扎单侧颈总动脉法复制脑瘫大鼠模型,其中治疗组于手术后24 h开始针刺,共14 d。各组于造模后15 d处死大鼠制备脑组织提取液。另取健康SD新生大鼠,取大脑海马部位,分离、扩增NSCs,采用免疫细胞化

2、学法检测NSCs 特征性标记Nestin与Brdu表达,以鉴定培养的细胞及体外分化能力。培养细胞分为正常对照组,低、高浓度组(分别加入100、300 L/mL的治疗组脑组织提取液),培养1、3、5 d后,采用免疫细胞化学法和免疫荧光法检测各组神经元样细胞和星形胶质样细胞的特征性标志物神经丝蛋白(NF)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,观察各组NSCs分化情况。采用流式细胞术检测各组NF、GFAP阳性细胞数,观察脑组织提取液促进NF、GFAP表达的时效和量效关系。【结果】扩增后的细胞球Nestin与Brdu均呈阳性,证实体外培养的细胞为NSCs ,并处于分裂增殖旺盛期。细胞培养1、3、5 d

3、后,NF、GFAP 染色均呈阳性,且正常对照组阳性细胞少,低、高浓度组明显增多,呈浓度依赖性,表明NSCs 已分化为神经元细胞和星形胶质细胞。同一时间段内低、高浓度组NF、GFAP阳性细胞数均较正常对照组显著增高(P005 或P001),高浓度组在培养1、3、5 d后,NF、GFAP阳性细胞数也显著增高(P005 或P001),表明治疗组脑组织提取液可促进NF、GFAP表达,且呈一定的量效和时效关系。 【结论】靳三针疗法治疗脑瘫可能是通过促进NSCs的增殖和定向分化,从而达到修复脑损伤的目的。 【关键词】 靳三针疗法/治疗应用;脑性瘫痪/针灸疗法;神经干细胞/病理学;细胞培养脑性瘫痪(cere

4、bral palsy, CP)是小儿先天性或围产期所发生的脑功能障碍性综合征,以中枢性运动障碍及姿势异常为主,常伴发智力低下、癫痫、语言障碍、视听异常等多重残障,是继脊髓灰质炎被控制后近代最常见的儿童致残性疾病1 。目前国内外多种CP康复手段虽有一定疗效,但仍无明显突破。“靳三针疗法”是著名针灸学家靳瑞教授经多年临床实践,汲取古代针灸配穴理论而创造的具有独特理、法、方、穴、术的针灸疗法,对CP患儿多种症状改善有良好的临床效果2-3。神经干细胞(neural stem cells ,NSCs)是脑内具有自我复制能力和多向分化潜能的细胞团,在脑损伤后可以被激活并增殖、迁移及分化,使损伤造成的形态与

5、功能上的缺失得以部分恢复4。因此,通过某些干预治疗措施诱导、增强自体神经干细胞的增殖,调节其定向分化,以促进自身修复，这已成为治疗脑瘫新的研究热点。本实验采用“靳三针”针刺后的窒息脑瘫幼鼠模型脑组织提取液进行神经干细胞培养,观察该法对神经干细胞增殖与分化的影响,现报道如下。1材料与方法11主要试剂及仪器DHanks液、LDMEM、1 mol/L胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)由GIBCOL 公司提供，链霉亲和素生物素复合物(SABC)、二氨基联苯胺(DAB)染色试剂盒由武汉博士德公司提供，神经丝蛋白(neurofilament, NF)、神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary ac

6、idic protein,GFAP)、Nestin and Brdu试剂盒由基因公司提供。高速冷冻离心机(美国)，Olympus 显微镜(日本)，BD FACSC alibur全自动流式细胞仪(美国)，超净工作台(苏州净化设备公司)，电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械一厂)。12实验动物及造模5清洁级健康SD新生大鼠18只,由广州中医药大学实验动物中心提供(粤检证字2003A010号)。SD大鼠被随机分为假手术组、模型组、靳三针疗法治疗组(简称治疗组),每组各6只。麻醉状态下结扎大鼠(模型组、治疗组)左侧颈总动脉,2 h后吸入体积分数8%氧和92%氮的混合气体2 h(1 L/min),继续保温1

7、 h后做行为测定,翻身不能、平衡异常、左旋者视为造模成功,以母鼠哺育。假手术组仅分离颈总动脉而不结扎,亦不作低氧处理。13各组处理方法模型组手术后不做任何处理。治疗组于手术后24 h开始针刺。穴位：百会、颞针、曲池、内关、足三里、涌泉。定位方法：参照大鼠穴位图谱研制6,结合人与动物骨度类比,顶骨正中定为百会穴;脑损伤侧外耳道口直上08 cm处模拟颞三针之颞针;桡骨近端关节外侧前方的凹陷中取曲池穴;前肢内侧,离腕关节约3 mm左右,尺桡骨缝间取内关穴;足三里穴(即后三里)在膝关节后外侧,腓骨小头下约5 mm处;后肢掌心前正中取涌泉穴。针刺方法：头部穴位平刺,进针后觉针下沉紧即可,百会、颞针接电针

8、仪,连续波,频率510 Hz,以穴周组织轻微抖动为度,约35 V,持续5 min。曲池、后三里穴用02寸毫针,针1分深左右,亦施电针,参数同上。内关、涌泉速刺微出血,不留针。手术后前7 d仅针四肢部穴位,第8天开始加针头部穴位。每天针刺1次,共14 d。14脑组织提取液的制备5各组于造模后15 d处死,取脑损伤区大脑皮质,按每150 mg脑组织湿质量加1 mL冷冻Tyrode平衡溶液的比例制备匀浆,匀浆液于4冰箱内过夜,次日冷冻离心15 000 r/min共30 min,取上清液过滤除菌,各相同组别之上清液混合,静置备用。15神经干细胞分离、扩增与鉴定另取1只健康SD新生大鼠,在无菌条件下取出

9、其大脑,放入DHanks液中分离出海马,将之剪碎置于离心管中,以1 000 r/min离心5 min,吸去上清液,再加入1 mol/L胰蛋白酶消化10 min,用含体积分数10%胎牛血清的培养基终止消化。随后离心5 min,吸去上清液,加入DMEM/F12的无血清培养基,用吸管吹打成单细胞悬液,过滤,细胞计数。以1105/mL的细胞密度移入培养瓶中培养,每隔3 d半量置换培养基。培养7 d后,机械分离神经球进行传代,并用Brdu检测神经球内细胞的增殖能力,在培养液中加入05 mol/L Brdu处理24 h,然后进行免疫细胞化学染色,以Nestin作为NSCs的特征性标记物对培养的NSCs进行

10、鉴定,检测NSCs的分化能力。16NSCs的分组培养收集培养的第2代神经球,以2105/cm2的细胞密度接种于预先用100 mg/L多聚赖氨酸处理过的24孔培养板各孔中的盖玻片上和6孔培养板中。每块培养板分为正常对照组,低浓度组和高浓度组,每组6孔。正常对照组培养液用DMEM/F12,加体积分数10%胎牛血清配制。低浓度组、高浓度组是在正常对照组培养液的基础上加入治疗组的脑组织提取液,浓度为100 L/mL和300 L/mL。将培养板置饱和湿度、体积分数5%CO2培养箱37培养。每隔3 d半量置换培养液,培养1、3、5 d。24孔培养板细胞做免疫细胞化学染色和免疫荧光检测,6孔培养板细胞做流式

11、细胞仪测定。17检测指标神经干细胞分化检测：在分别培养1、3、5 d后,取出24孔培养板各孔中的盖玻片,用40 g/L多聚甲醛固定30 min,001 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后,检测NF、GFAP表达。171免疫细胞化学染色细胞爬片以新鲜配置的体积分数3%H2O2室温浸泡510 min,以灭活内源性过氧化物酶。滴加正常山羊血清30 min,分别滴加鼠抗NF、GFAP、Nestin and Brdu一抗(12000),恒温下(37)孵育2 h,PBS洗,滴加生物素化山羊抗小鼠IgG室温下30 min,滴加试剂SABC,室温30 min,DAB显色,室温下20 min,脱水、透明,中

12、性树胶封片。染色对照：同一组片中,分别用正常山羊血清和PBS代替NF、GFAP、Nestin and Brdu一抗作孵育,其余步骤同上。172免疫荧光反应细胞爬片用40 g/L多聚甲醛固定15 min,再经体积分数为3%的过氧化氢甲醇溶液中室温浸泡10 min,正常山羊血清封闭20 min,分别加入NF、GFAP一抗在4过夜。与生物素化的二抗37下孵育2030 min,再与链霉亲和素生物素复合物异硫氰酸荧光素(SABCFITC)在37下孵育20 min,碘化丙啶(propidium iodide, PI)复染。173流式细胞仪定量分析NF和GFAP阳性细胞数以胰酶消化离心收集细胞,用PBS洗1

13、次,体积分数70%乙醇固定20 min,离心去乙醇,PBS洗1次,1 mL PBS悬浮细胞分别加NF和GFAP抗体(1200稀释),在4冰箱内孵育过夜,离心去上清,PBS洗1次,加SABCFITC室温下孵育1 h,离心去上清,PBS洗1次,取1 mL PBS悬浮细胞，采用流式细胞仪测定NF和GFAP阳性细胞数。18统计学方法在1020荧光显微镜下,对免疫细胞化学染色的阳性细胞进行计数。每组有6个培养神经干细胞的盖玻片,每个盖玻片上随机选5个计数单位面积,计算细胞总数和阳性细胞数及阳性细胞的百分率。采用SPSS 100统计软件进行数据分析，计量资料以均数标准差(xs)、中位数(M)表示，组间比较采用方差分析(非正态或方差不齐采用秩和检验)，检验水平=005。2结果21体外培养神经干细胞结果在培养最初3 d中,可见少量细胞贴壁生长,培养基中悬浮大量未贴壁的单细胞和小细胞团。小细胞团逐渐增大,第6天即形成含有数10个细胞的圆形细胞球,部分贴壁,部分仍处于悬浮状态。贴壁生长的细胞球有少量细胞向外周迁移,伸出突起彼此交织成网状,形似细胞球周边长出的细长突起,放射状向四周伸展呈神经球样生长的原代培养NSCs形态，见图1(彩图见第315页)。随着培养时间延长,细胞球继续增大,细胞迁移逐渐增多。对不同时间培养获得的神经球进