酵母细胞固定化技术

1、酵母细胞固定化技术酵母细胞固定化技术实验目的实验目的 了解细胞固定化的原理和方法了解细胞固定化的原理和方法 学习和掌握酵母细胞固定化的方法学习和掌握酵母细胞固定化的方法固定化细胞技术固定化细胞技术：用物理或者化学的手段将游离细胞定位用物理或者化学的手段将游离细胞定位于限定的空间区域，并使其保持催化活于限定的空间区域，并使其保持催化活性，可以反复使用的方法。性，可以反复使用的方法。应用应用：1 1、应用于食品、化学、医药、化学分析、环、应用于食品、化学、医药、化学分析、环 境境保护、能源开发等。保护、能源开发等。2 2、应用于生产各种胞外产物，包括酒精酒类，氨、应用于生产各种胞外产物，包括酒精酒

2、类，氨基酸，有机酸，酶，辅酶，抗生素，甾体转化，基酸，有机酸，酶，辅酶，抗生素，甾体转化，废水处理。废水处理。3 3、用于制造微生物传感器。、用于制造微生物传感器。方法：方法：吸附法吸附法（载体结合法）（载体结合法）原理原理：根据带点的微生物细胞和载体之间的静电，：根据带点的微生物细胞和载体之间的静电，表面张力和粘附力的作用，使细胞固定在表面和内表面张力和粘附力的作用，使细胞固定在表面和内部部优缺点优缺点：简便，活力损失小，但细胞和载体作用：简便，活力损失小，但细胞和载体作用 力小，易脱落力小，易脱落定义定义：将酶（或细胞）：将酶（或细胞） 吸附在载体表面上吸附在载体表面上包埋法：包埋法：定义

3、定义：将酶（或细胞）包埋在多孔的：将酶（或细胞）包埋在多孔的 水不溶性载体水不溶性载体的紧密结构中，使的紧密结构中，使 其处于活化状体其处于活化状体类型类型：a a、凝胶包埋法、凝胶包埋法 b b、半透明包埋法、半透明包埋法原理原理：a a、将细胞包埋在各种凝胶内部的微控中而使细胞固、将细胞包埋在各种凝胶内部的微控中而使细胞固定定 b b、将细胞包埋在各种高分子聚合物制成的小球里、将细胞包埋在各种高分子聚合物制成的小球里优点优点：简单、条件温和、稳定性好、活性高，包埋细胞：简单、条件温和、稳定性好、活性高，包埋细胞容量高，活力持久。容量高，活力持久。（是最常用，最有效的方法）（是最常用，最有效

4、的方法）交联法：交联法：定义定义：将酶（或细胞）相互：将酶（或细胞）相互 连接起来连接起来（化学结合法）（化学结合法）原理原理：利用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的：利用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的 反应基团发生反应，使其彼此交联形成网状结反应基团发生反应，使其彼此交联形成网状结 构的固定化细胞，其结合力是共价键。构的固定化细胞，其结合力是共价键。优缺点优缺点：制备麻烦，活力损失较大，但细胞与载体结合较紧：制备麻烦，活力损失较大，但细胞与载体结合较紧共价结合法共价结合法原理原理：细胞表面上功能团和固相支持物：细胞表面上功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连表面的反应基

5、团之间形成化学共价键连接，从而使细胞固定。接，从而使细胞固定。优缺点优缺点：结合紧密，不易脱落，但制备：结合紧密，不易脱落，但制备 较难，且活力损失较大较难，且活力损失较大载体载体1 1、多糖类：纤维素，琼脂，葡萄糖凝胶，藻酸钙，、多糖类：纤维素，琼脂，葡萄糖凝胶，藻酸钙， K-K-角叉胶等角叉胶等2 2、蛋白质：骨胶原，明胶等、蛋白质：骨胶原，明胶等3 3、无机载体：氧化铅，活性炭，陶瓷，磁铁，、无机载体：氧化铅，活性炭，陶瓷，磁铁， SiOSiO2 2，磷酸钙凝胶等，磷酸钙凝胶等4 4、合成载体：聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，酚醛树脂、合成载体：聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，酚醛树脂5 5、多孔载体：海藻

6、酸盐、多孔载体：海藻酸盐实验中以海藻酸盐，角叉胶和聚丙烯酰胺最为常用实验中以海藻酸盐，角叉胶和聚丙烯酰胺最为常用海藻酸盐海藻酸盐优点：优点：1 1、具有化学稳定性好、具有化学稳定性好 2 2、无毒、无毒 3 3、包埋效率高且价格低廉、包埋效率高且价格低廉缺点：包埋时，凝胶颗粒容易破损，软化等，缺点：包埋时，凝胶颗粒容易破损，软化等， 稳定性和机械强度较差，不利于固定化稳定性和机械强度较差，不利于固定化 细胞的多次利用细胞的多次利用本次实验内容本次实验内容 本次实验采用以本次实验采用以海藻酸盐海藻酸盐为例，运用为例，运用包包埋法埋法介绍酵母细胞的固定化方法。介绍酵母细胞的固定化方法。实验材料与试

7、剂实验材料与试剂 菌种：酿酒酵母菌种：酿酒酵母 培养基：培养基：2%2%蔗糖培养基蔗糖培养基 试剂：含试剂：含10%10%葡萄糖溶液的葡萄糖溶液的0.05mol/LCaCI0.05mol/LCaCI2 2溶液，海藻酸钠，无菌水溶液，海藻酸钠，无菌水 器材：小烧杯，平皿，试管，无菌的锥形器材：小烧杯，平皿，试管，无菌的锥形瓶，无菌吸管瓶，无菌吸管实验流程实验流程第一阶段：酵母细胞的活化第一阶段：酵母细胞的活化第二阶段：细胞固定化第二阶段：细胞固定化第三阶段：固定化酵母的发酵第三阶段：固定化酵母的发酵第四阶段：酒精的检验第四阶段：酒精的检验酵母细胞的活化酵母细胞的活化在缺水的状态下，微生物处于休眠

8、状态，在缺水的状态下，微生物处于休眠状态，活化就是要让处于休眠状态的微生物重新活化就是要让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态，酵母细胞所需要的恢复正常的生活状态，酵母细胞所需要的活化时间较短，一般需要活化时间较短，一般需要0.5-1h0.5-1h。细胞固定化细胞固定化1 1、称取海藻酸钠、称取海藻酸钠0.4g0.4g置于无菌烧杯中，加无菌水少许置于无菌烧杯中，加无菌水少许调成糊状，再加够调成糊状，再加够10ml10ml水，适当加热溶解。水，适当加热溶解。2 2、将溶好的海藻酸钠溶液冷却到、将溶好的海藻酸钠溶液冷却到4545左右，加入预热左右，加入预热至至3535左右的酵母细胞液，混合均

9、匀，用无菌的吸左右的酵母细胞液，混合均匀，用无菌的吸管吸取混合液，逐滴加入预先盛有管吸取混合液，逐滴加入预先盛有100ml100ml含含10%10%葡萄葡萄糖的糖的0.05mol/LCaCI0.05mol/LCaCI2 2溶液，使其成为凝胶珠，静置溶液，使其成为凝胶珠，静置30min30min。3 3、待凝胶珠在溶解中浸泡、待凝胶珠在溶解中浸泡30min30min后后, ,用无菌水洗涤三次用无菌水洗涤三次后加入后加入2%2%蔗糖培养基中，置蔗糖培养基中，置2525下发酵下发酵7-9d7-9d，发酵，发酵结束后测定其酒精的含量。结束后测定其酒精的含量。酒精的检测酒精的检测 方法：用蒸馏法蒸馏出乙

10、醇水容易，再用方法：用蒸馏法蒸馏出乙醇水容易，再用酒精计测量其究竟度数。酒精计测量其究竟度数。注意事项注意事项 加入海藻酸钠是操作中最重要的一环，涉及加入海藻酸钠是操作中最重要的一环，涉及到实验的成败，浓度过高：难以形成凝胶珠；到实验的成败，浓度过高：难以形成凝胶珠；太低，形成的凝胶珠所包埋的酵母数量少，太低，形成的凝胶珠所包埋的酵母数量少，影响实验效果。影响实验效果。 刚形成的凝胶珠应在刚形成的凝胶珠应在CaClCaCl2 2溶液中浸泡一段溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。时间，以便形成稳定的结构。 检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下来方法：来方法：1 1、用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手、用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，看有