第8章可降解塑料的生物合成

1、u第一节第一节 可降解塑料概述可降解塑料概述u第二节第二节 PHAsPHAs的结构、物理化学性质和应用的结构、物理化学性质和应用u第三节第三节 PHAsPHAs的生物合成的生物合成u第四节第四节 PHAsPHAs的发酵生产的发酵生产u第五节第五节 PHAsPHAs的提取技术的提取技术u第六节第六节 PHAsPHAs的生物降解的生物降解u第七节第七节 PHAsPHAs的工业化的工业化第第8 8章章 可降解塑料的生物合成可降解塑料的生物合成第一节第一节 可降解塑料概述可降解塑料概述 石化工业的兴起，使得石油化工合成塑料在人石化工业的兴起，使得石油化工合成塑料在人类生活中扮演着重要的角色，类生活中扮

2、演着重要的角色，7070年代以来，塑料年代以来，塑料工业得到迅猛的发展，无论工业、农业、建筑业、工业得到迅猛的发展，无论工业、农业、建筑业、还是人们的日常生活，无不与塑料密切相关。还是人们的日常生活，无不与塑料密切相关。 但目前所使用的化学合成塑料在自然环境中但目前所使用的化学合成塑料在自然环境中很难分解，也不会被腐蚀，燃烧处理又会产生有很难分解，也不会被腐蚀，燃烧处理又会产生有害气体，越来越多的塑料垃圾却对环境造成巨大害气体，越来越多的塑料垃圾却对环境造成巨大的危害。的危害。 普通塑料是以合成树脂为主的化学合成材料。对环境普通塑料是以合成树脂为主的化学合成材料。对环境污染具有以下特点：污染具

3、有以下特点： 污染范围广，江河湖泊、田野山川无处不有。污染范围广，江河湖泊、田野山川无处不有。 污染物增长量快。污染物增长量快。 据统计，全世界每年对塑料的需求量为据统计，全世界每年对塑料的需求量为1 1亿吨，倾入亿吨，倾入海洋的塑料垃圾达数海洋的塑料垃圾达数1010万吨，陆上的更是难以计数。万吨，陆上的更是难以计数。 1985 1985年我国农用薄膜为年我国农用薄膜为3030万吨，万吨，19901990年为年为5050万吨，万吨，20052005年，中国包装用塑料需求量达到了年，中国包装用塑料需求量达到了500500万吨，按万吨，按30%30%为为难以收集的一次性塑料包装材料和制品计算，则废

4、弃物产难以收集的一次性塑料包装材料和制品计算，则废弃物产生量达生量达150150万吨。万吨。我国可覆盖地膜的面积为我国可覆盖地膜的面积为5 5亿多亩，需求亿多亩，需求量已达到量已达到100100万。万。 处理难。塑料具有耐酸碱、抗氧化、难腐蚀、处理难。塑料具有耐酸碱、抗氧化、难腐蚀、难降解的特性。埋地里处理百年不烂；燃烧时产生大难降解的特性。埋地里处理百年不烂；燃烧时产生大量有毒气体，如量有毒气体，如HClHCl、SOxSOx、COCO等。等。 各种塑料及相近制品在环境中被预期降解的时间各种塑料及相近制品在环境中被预期降解的时间制制 品品 自动售自动售 铝罐铝罐 聚乙烯泡聚乙烯泡 可处置可处置

5、 木制筷子木制筷子 塑料瓶塑料瓶 货机杯货机杯 沫杯沫杯/ /盘盘 尿布尿布 （PET）时间时间/ /a a 20 20 100 100 500 500 20 20 20 20 100100 回收利用难。塑料制品种类多，填料、颜料多样，回收利用难。塑料制品种类多，填料、颜料多样，难以分拣回收再利用。难以分拣回收再利用。 生态环境危害大。地膜降低耕地质量，农作物植株生态环境危害大。地膜降低耕地质量，农作物植株矮小，抗病力差；残膜随风飘动，对周围环境、畜牧业、矮小，抗病力差；残膜随风飘动，对周围环境、畜牧业、养殖业都有很大的影响养殖业都有很大的影响 数量如此巨大的塑料垃圾对生态和环境产数量如此巨大

6、的塑料垃圾对生态和环境产生了严重的影响，由此引发的环境问题将日益生了严重的影响，由此引发的环境问题将日益严重。严重。许多国家已开始用生物可降解塑料代替许多国家已开始用生物可降解塑料代替部分石油化工合成塑料，并陆续颁布了一些法部分石油化工合成塑料，并陆续颁布了一些法规，禁用某些塑料制品。规，禁用某些塑料制品。 如意大利已立法规定自如意大利已立法规定自19911991年起所有包装年起所有包装用塑料都必须生物可降解，我国也开始禁用塑用塑料都必须生物可降解，我国也开始禁用塑料方便餐盒等不可降解的塑料制品。料方便餐盒等不可降解的塑料制品。 当前，生产降解塑料的国家主要有美国、当前，生产降解塑料的国家主要

7、有美国、意大利、德国、加拿大、日本、中国等。意大利、德国、加拿大、日本、中国等。 美国是开发降解塑料的主要国家之一，主要有十美国是开发降解塑料的主要国家之一，主要有十几家单位，如塑料降解研究联合体（几家单位，如塑料降解研究联合体（PDRCPDRC）、生物）、生物/ /环境降解塑料研究会（环境降解塑料研究会（BEOPSBEOPS）等，）等，其宗旨在于进行其宗旨在于进行有关降解材料合成、加工工艺、降解试验、测试技术有关降解材料合成、加工工艺、降解试验、测试技术和方法标准体系的建立。和方法标准体系的建立。 近年日本相继成立了生物降解塑料研究会、生物近年日本相继成立了生物降解塑料研究会、生物降解塑料实

8、用化检讨委员会，降解塑料实用化检讨委员会，日本通产省已将生物降日本通产省已将生物降解塑料作为继金属材料、无机材料、高分子材料之后解塑料作为继金属材料、无机材料、高分子材料之后的的“第四类新材料第四类新材料”。 欧洲欧洲Bhre-EuraeBhre-Eurae更是对生物降解塑料建立了完善更是对生物降解塑料建立了完善的降解评价体系。的降解评价体系。 生物降解塑料是指在自然环境下通过微生物的生命生物降解塑料是指在自然环境下通过微生物的生命活动能很快降解的高分子材料。活动能很快降解的高分子材料。按其降解特性可分为完按其降解特性可分为完全生物降解塑料和生物破坏性塑料。全生物降解塑料和生物破坏性塑料。按其

9、来源则可分为按其来源则可分为天然高分子材料、微生物合成材料、化学合成材料、掺天然高分子材料、微生物合成材料、化学合成材料、掺混型材料等。混型材料等。 天然高分子型是利用淀粉、纤维素、甲壳质、蛋白天然高分子型是利用淀粉、纤维素、甲壳质、蛋白质等天然高分子材料制备的生物降解材料。质等天然高分子材料制备的生物降解材料。这类物质来这类物质来源丰富，可完全生物降解，而且产物安全无毒性，日益源丰富，可完全生物降解，而且产物安全无毒性，日益受到重视。受到重视。 美国美国Warner-LambertWarner-Lambert公司开发了由公司开发了由70%70%支链淀粉和支链淀粉和30%30%直链淀粉制成的新

10、型树脂，直链淀粉制成的新型树脂，有良好的生物降解性，有良好的生物降解性，可替代农业上使用的各种生物降解材料。可替代农业上使用的各种生物降解材料。 在众多的生物可降解材料中，采用微生物发酵法在众多的生物可降解材料中，采用微生物发酵法生产的聚生产的聚-羟基烷酸（简称羟基烷酸（简称PHAsPHAs），），成为应用环境成为应用环境生物学方面的一个研究的热点。生物学方面的一个研究的热点。其中，其中，-羟基丁酸羟基丁酸（简称（简称PHBPHB）及及3-3-羟基丁酸与羟基丁酸与3-3-羟基戊酸的共聚物羟基戊酸的共聚物 简简称称P(3HB-co-3HV)P(3HB-co-3HV)或或PHBVPHBV是是PHA

11、sPHAs族中研究和应用最广族中研究和应用最广泛的两种多聚体。泛的两种多聚体。 聚聚-羟基烷酸（羟基烷酸（PHAsPHAs）作为一种有光学活性的作为一种有光学活性的聚酯，除具有高分子化合物的基本特性，如质轻、弹聚酯，除具有高分子化合物的基本特性，如质轻、弹性、可塑性、耐磨性、抗射性等外，性、可塑性、耐磨性、抗射性等外，更重要的是它还更重要的是它还具有生物可降解性和生物可相容性。具有生物可降解性和生物可相容性。 已有研究表明，采用已有研究表明，采用PHAsPHAs制作的香波瓶，在自然环境制作的香波瓶，在自然环境中中9 9个月后，可基本上被完全降解，而同样用合成塑料制个月后，可基本上被完全降解，而

12、同样用合成塑料制作的物品，完全降解时间约需作的物品，完全降解时间约需100100年。年。因此，研究和开发因此，研究和开发聚聚-羟基烷酸（羟基烷酸（PHAsPHAs），使之成为同类用途的石化合成，使之成为同类用途的石化合成塑料最有潜在的替代品，可避免或减少塑料废物对环境的塑料最有潜在的替代品，可避免或减少塑料废物对环境的污染，具有深远的环境意义。污染，具有深远的环境意义。第二节第二节 PHAsPHAs的结构、物理化学性质和应用的结构、物理化学性质和应用 O CH CH2 C nORR R为甲基时，单体为为甲基时，单体为-羟基丁（羟基丁（HBHB）；）；R R为乙基时，单体为为乙基时，单体为-羟基

13、戊酸（羟基戊酸（HVHV）；）；R R为丙基时，单体为为丙基时，单体为-羟基己酸（羟基己酸（HCHC）；）；R R为丁基时，单体为为丁基时，单体为-羟基庚酸（羟基庚酸（HHHH）；）； n n为单体的数目。为单体的数目。 R R为甲基时，其聚合物为为甲基时，其聚合物为-羟基丁酸（羟基丁酸（PHBPHB） ， R R为乙为乙基时，其聚合物为基时，其聚合物为-羟基戊酸（羟基戊酸（PHVPHV）；）；其他依次类推。其他依次类推。PHAs的通式可写成：的通式可写成： 多种微生物在一定条件下能在细胞内积累聚多种微生物在一定条件下能在细胞内积累聚-羟羟基烷酸（基烷酸（PHAsPHAs）作为碳源和能源的贮存

14、物。作为碳源和能源的贮存物。 我们采用溶剂法从不同细菌中可以提取这些多聚物，我们采用溶剂法从不同细菌中可以提取这些多聚物，有些多聚物的相对分子质量可高达有些多聚物的相对分子质量可高达2 210106 6。 每个每个PHAPHA颗粒含有数千条多聚体链。这些多聚物的颗粒含有数千条多聚体链。这些多聚物的物理化学性质和机械性能如韧度、脆性、熔点、玻璃态物理化学性质和机械性能如韧度、脆性、熔点、玻璃态温度和抗溶剂性等与单体的组成有极大的关系。温度和抗溶剂性等与单体的组成有极大的关系。 例如例如3-3-羟基丁酸与羟基丁酸与3-3-羟基戊酸的（羟基戊酸的（PHBVPHBV）共聚物中）共聚物中-羟基戊酸组分的

15、增加可使熔点从羟基戊酸组分的增加可使熔点从180180o oC C（PHBPHB）降至降至7575o oC C。 多数有关细菌聚多数有关细菌聚-羟基烷酸（羟基烷酸（PHAsPHAs）的物理化学性质的物理化学性质的研究是针对的研究是针对-羟基丁酸（羟基丁酸（PHBPHB）及及3-3-羟基丁酸与羟基丁酸与3-3-羟基羟基戊酸的共聚物（戊酸的共聚物（PHBVPHBV）两种聚合物进行的。两种聚合物进行的。 PHBPHB是高度结晶的晶体，其物理性质以及分子结构上与是高度结晶的晶体，其物理性质以及分子结构上与聚丙烯（聚丙烯（PPPP）很相似，例如熔点、玻璃态温度、结晶度、很相似，例如熔点、玻璃态温度、结晶

16、度、抗张强度等，而抗张强度等，而PHBPHB具有相对密度大、透氧率低和抗紫外线具有相对密度大、透氧率低和抗紫外线照射以及具有光学活性、阻湿性和压电性等优点。照射以及具有光学活性、阻湿性和压电性等优点。 聚聚-羟基烷酸（羟基烷酸（PHAsPHAs）的生物降解性和生物相容性是的生物降解性和生物相容性是许多化学合成塑料所不具备的。许多化学合成塑料所不具备的。PHAsPHAs这类热塑性聚酯能纺这类热塑性聚酯能纺丝、压膜或注塑，在工业上可用作各类包装材料等，在医丝、压膜或注塑，在工业上可用作各类包装材料等，在医药方面的应用由于有生物相容性的特点，可作外科缝线、药方面的应用由于有生物相容性的特点，可作外科

17、缝线、骨骼代用品或骨板，手术后无需取出。骨骼代用品或骨板，手术后无需取出。 研究还发现研究还发现PHBPHB的降解产物的降解产物D(-)-3-D(-)-3-羟基丁酸是所有高等动物中的羟基丁酸是所有高等动物中的一种普遍存在的中间产物，一种普遍存在的中间产物，在原核生物和真核生物中发现的含有在原核生物和真核生物中发现的含有100-100-200200个单体的小分子量个单体的小分子量PHBPHB，具有作为细胞膜离子通道组成的作用，并具有作为细胞膜离子通道组成的作用，并且在人体的血浆中也检测到它的大量存在。且在人体的血浆中也检测到它的大量存在。所以，植入哺乳动物组织所以，植入哺乳动物组织的的-羟基丁酸

18、（羟基丁酸（PHBPHB）不会对机体产生毒性。不会对机体产生毒性。 表表8-2-2 8-2-2 PHAsPHAs的应用的应用 应用范围应用范围 PHAsPHAs的应用的应用 外科缝线、肘钉、拭子等；伤口敷外科缝线、肘钉、拭子等；伤口敷 料；血管替代品；骨骼替代品和骨料；血管替代品；骨骼替代品和骨 医药上医药上 板（由于压电效应能促进骨骼生长）；板（由于压电效应能促进骨骼生长）； 长效药物的生物降解载体长效药物的生物降解载体 长效除莠剂、抗真菌剂、杀虫剂；长效除莠剂、抗真菌剂、杀虫剂； 肥料等的生物降解载体；容器、瓶、肥料等的生物降解载体；容器、瓶、 工业上工业上 袋、薄膜等包装材料；妇女卫生用

19、品、袋、薄膜等包装材料；妇女卫生用品、 尿布等；合成手性化合物的前体原料尿布等；合成手性化合物的前体原料第三节第三节 PHAsPHAs的生物合成的生物合成一、合成一、合成PHAsPHAs的主要微生物的主要微生物二、合成二、合成PHAsPHAs的主要基质的主要基质三、三、 PHAsPHAs的代谢途径与调控的代谢途径与调控一、合成一、合成PHAsPHAs的主要微生物的主要微生物 能产生聚能产生聚-羟基烷酸（羟基烷酸（PHAsPHAs）微生物分布极广，包括微生物分布极广，包括光能和化能自养及异养菌，计光能和化能自养及异养菌，计6565个属中的近个属中的近300300种微生物。种微生物。 目前研究较多

20、的用于合成目前研究较多的用于合成PHAsPHAs的微生物有：产碱杆菌的微生物有：产碱杆菌属，假单胞菌属，甲基营养菌，固氮菌属和红螺菌属等。属，假单胞菌属，甲基营养菌，固氮菌属和红螺菌属等。它们能分别利用不同的碳源产生不同的它们能分别利用不同的碳源产生不同的PHAsPHAs。 在多数情况下微生物能利用糖加丙酸或戊酸产生在多数情况下微生物能利用糖加丙酸或戊酸产生PHBVPHBV的，并可通过改变两者的配比控制共聚物中的，并可通过改变两者的配比控制共聚物中HBHB和和HVHV的比例。的比例。但丙酸或戊酸价格高，且对细菌有毒，因而在培养液中的但丙酸或戊酸价格高，且对细菌有毒，因而在培养液中的浓度必须控制

21、很低，产率及转化率都不高，这些也是生产浓度必须控制很低，产率及转化率都不高，这些也是生产上的不利因素。上的不利因素。 上个世纪上个世纪9090年代以来发现，在分类上属于红球菌年代以来发现，在分类上属于红球菌属、诺卡氏菌属和棒杆菌属中的一些菌能利用葡萄糖属、诺卡氏菌属和棒杆菌属中的一些菌能利用葡萄糖或其他单一碳源产生含或其他单一碳源产生含HBHB和和HVHV的的PHAPHA。 上个世纪末，有人观察到真养产碱杆菌上个世纪末，有人观察到真养产碱杆菌H H1616的异亮的异亮氨酸缺陷型突变株氨酸缺陷型突变株R R8 8能从单一的无关连碳源例如果糖或能从单一的无关连碳源例如果糖或葡萄糖酸等产生葡萄糖酸等

22、产生PHBVPHBV。以果糖为碳源时，共聚物占细以果糖为碳源时，共聚物占细胞干重的胞干重的47%47%。 这些发现不仅给这些发现不仅给PHAPHA生物合成和调节机制的研究增生物合成和调节机制的研究增加了新的内容，而且对探索从廉价的单一碳源生产加了新的内容，而且对探索从廉价的单一碳源生产PHBVPHBV方面开辟了一条新的途径。方面开辟了一条新的途径。 选择工业生产选择工业生产PHAsPHAs的菌种可以考虑以下几个因素，主要包括的菌种可以考虑以下几个因素，主要包括细菌能利用廉价碳源的能力、生长速率、多聚物合成速率和能在细菌能利用廉价碳源的能力、生长速率、多聚物合成速率和能在细胞内最大积累多聚物的程

23、度。细胞内最大积累多聚物的程度。 如英国如英国ICIICI公司分别对固氮菌、甲基营养菌和真氧产碱杆菌进公司分别对固氮菌、甲基营养菌和真氧产碱杆菌进行了考察：行了考察： 首先，放弃了固氮菌、首先，放弃了固氮菌、因为这类菌还会产生多糖，从而降低因为这类菌还会产生多糖，从而降低了了-羟基丁酸（羟基丁酸（PHBPHB）的产率。的产率。 其次，否定了甲基营养菌，其次，否定了甲基营养菌，这类菌的这类菌的PHBPHB产率不高，胞内产率不高，胞内PHBPHB含量仅为含量仅为65%65%左右。左右。 第三，舍去了甲醇，第三，舍去了甲醇，虽然甲醇的价格低，但转化系数也低，虽然甲醇的价格低，但转化系数也低， 经考察

24、，最终选择了真养产碱杆菌作为经考察，最终选择了真养产碱杆菌作为PHAsPHAs的生产菌株，因的生产菌株，因为该菌株生长快、易培养、胞内为该菌株生长快、易培养、胞内PHBPHB含量高、聚合物的分子量大以含量高、聚合物的分子量大以及能利用各种较经济的碳源。及能利用各种较经济的碳源。二、合成二、合成PHAsPHAs的主要基质的主要基质 1.1.糖质碳源糖质碳源 可用来工业化生产可用来工业化生产PHAPHA的糖质碳源有葡萄糖、蔗糖、的糖质碳源有葡萄糖、蔗糖、糖蜜、淀粉等。糖蜜、淀粉等。 （1 1）葡萄糖）葡萄糖 真养产碱杆菌野生株真养产碱杆菌野生株H H1616利用果糖积累利用果糖积累PHBPHB，其

25、利用葡萄糖的变异株已用于工业生产其利用葡萄糖的变异株已用于工业生产PHBPHB。 如凯姆等人采用细胞密度培养的方法，通过在线葡如凯姆等人采用细胞密度培养的方法，通过在线葡萄糖浓度的控制，首先使菌体平衡生长至萄糖浓度的控制，首先使菌体平衡生长至7070g/Lg/L，再让其再让其积累积累PHBPHB，50h50h细胞浓度达细胞浓度达164164g/Lg/L，干细胞中干细胞中PHBPHB含含76%76%，发酵液中含量为发酵液中含量为121121g/Lg/L，PHBPHB的生产强度为的生产强度为2.422.42g/g/（ Lh Lh ），），是目前世界上已报道的最高记录。是目前世界上已报道的最高记录。

26、 （2 2）蔗糖及糖蜜）蔗糖及糖蜜 肥大产碱杆菌能利用蔗糖积累肥大产碱杆菌能利用蔗糖积累-羟基丁酸（羟基丁酸（PHBPHB），），采用分批采用分批补料培养的方法积累的补料培养的方法积累的PHBPHB量达量达60 60 g/Lg/L以上，目前已中试生产的水以上，目前已中试生产的水平为平为1515m m3 3反应器每周生产反应器每周生产1 1tPHBtPHB。该菌的特点是生长较快，能利用廉该菌的特点是生长较快，能利用廉价的甜菜或甘蔗糖蜜，并且细胞生长与价的甜菜或甘蔗糖蜜，并且细胞生长与PHBPHB的积累同步。的积累同步。 但是，使用糖蜜作基质还很有争议。但是，使用糖蜜作基质还很有争议。培格认为，用

27、甜菜糖蜜作培格认为，用甜菜糖蜜作基质其价格是葡萄糖的基质其价格是葡萄糖的1/21/2，而而ICIICI公司认为糖本身虽然价格较低，公司认为糖本身虽然价格较低，但杂质多，增加了但杂质多，增加了PHBPHB积累的难度，为了提高积累的难度，为了提高PHBPHB含量，糖蜜原料需含量，糖蜜原料需精制，这就增加了成本。精制，这就增加了成本。另外，使用糖蜜还会给后提取增加困难另外，使用糖蜜还会给后提取增加困难（如粘度大，需脱色等），糖蜜系季节性产品，储运不易，再有糖（如粘度大，需脱色等），糖蜜系季节性产品，储运不易，再有糖蜜含糖量较低（通常含糖蜜含糖量较低（通常含糖50%50%以下），如用来作细胞的高密度培

28、养以下），如用来作细胞的高密度培养还需补加纯糖，这也会影响成本，还需补加纯糖，这也会影响成本，所以从使用糖蜜的总效益综合考所以从使用糖蜜的总效益综合考虑，尽管糖蜜本身廉价，用于实际生产上仍有许多困难需要克服。虑，尽管糖蜜本身廉价，用于实际生产上仍有许多困难需要克服。 2 2. .甲醇甲醇 甲醇是最便宜的基质之一，但由于甲醇菌积累甲醇是最便宜的基质之一，但由于甲醇菌积累PHBPHB含量不高，加大了含量不高，加大了PHBPHB回收过程的成本，而且回收过程的成本，而且PHBPHB的分的分子量较小，故子量较小，故ICIICI公司放弃了这条路线。公司放弃了这条路线。 但由于甲醇价格低，仍然吸引人们寻求新

29、的菌种和但由于甲醇价格低，仍然吸引人们寻求新的菌种和开发更有效的培养方法。开发更有效的培养方法。 凯姆等使用嗜有机甲基杆菌，在微机辅助的自动补凯姆等使用嗜有机甲基杆菌，在微机辅助的自动补料分批培养系统中，在限钾的条件下（料分批培养系统中，在限钾的条件下（2525mg/Lmg/L）大大量生产量生产PHBPHB，甲醇浓度维持在甲醇浓度维持在2-32-3g/Lg/L时不抑制细胞的生时不抑制细胞的生长，培养长，培养7070h h细胞浓度高达细胞浓度高达250250g/Lg/L，是当今高密度培养是当今高密度培养产产PHBPHB细胞浓度的最高记录。细胞浓度的最高记录。 3 3气体气体H H2 2/CO/C

30、O2 2/O/O2 2 真养产碱杆菌等一些爆鸣气细菌能利用真养产碱杆菌等一些爆鸣气细菌能利用H H2 2/CO/CO2 2/O/O2 2产生产生-羟基丁酸（羟基丁酸（PHBPHB），），其中其中H H2 2作为能源，作为能源，COCO2 2是碳源。是碳源。 H H2 2是一种干净的可再生资源。通过同化是一种干净的可再生资源。通过同化COCO2 2生产生物降生产生物降解塑料，可以同时解决温室效应及废弃的非降解塑料的危害解塑料，可以同时解决温室效应及废弃的非降解塑料的危害等两个严重的环境污染问题。等两个严重的环境污染问题。但在技术上要解决混合气体爆但在技术上要解决混合气体爆鸣的安全问题和气体的循环

31、利用问题。鸣的安全问题和气体的循环利用问题。 控制基质气相中氧的浓度低于气体爆炸的下限（控制基质气相中氧的浓度低于气体爆炸的下限（6.9%6.9%）是安全的，而循环气体的闭路培养体系能有效地利用气体。是安全的，而循环气体的闭路培养体系能有效地利用气体。 田中等人研究了真养产碱杆菌利用田中等人研究了真养产碱杆菌利用H H2 2/CO/CO2 2/O/O2 2 的高密度的高密度培养产培养产PHBPHB的最新结果是，在限氧条件下培养的最新结果是，在限氧条件下培养4040h h，细胞浓度细胞浓度和和PHBPHB浓度分别达到浓度分别达到91.391.3g/Lg/L和和61.961.9g/Lg/L。 4

32、4烷烃及其衍生物烷烃及其衍生物 假单胞菌能利用中等链长的烷烃或其衍生物醇、假单胞菌能利用中等链长的烷烃或其衍生物醇、酸等产生中等链长羟基烷酸的共聚物（酸等产生中等链长羟基烷酸的共聚物（PHAPHAMCLMCL），），而共而共聚物中单体的组成与基质碳架的长度有关。聚物中单体的组成与基质碳架的长度有关。 以辛烷作基质连续培养食油假单胞菌，通过优化以辛烷作基质连续培养食油假单胞菌，通过优化培养基和增加氧的转移率，稳定态细胞浓度增至培养基和增加氧的转移率，稳定态细胞浓度增至11.611.6 g/Lg/L，用传氧很有效的反应器作分批补料培养，用传氧很有效的反应器作分批补料培养，3838h h细胞浓度为细

33、胞浓度为37.1 37.1 g/Lg/L， PHA PHA占细胞干重的占细胞干重的33%33%。 如通纯氧以适应细胞对氧的需要、用辛酸分批补如通纯氧以适应细胞对氧的需要、用辛酸分批补料培养料培养4545h h，细胞浓度为细胞浓度为41.8 41.8 g/Lg/L， PHA PHA占细胞干重的占细胞干重的37.1%37.1%。三、三、PHAsPHAs 的代谢途径与调控的代谢途径与调控 研究表明，许多微生物在碳源过量而其他某种营养成分，如研究表明，许多微生物在碳源过量而其他某种营养成分，如氮、磷、镁或氧不足时，能在细胞内大量积累聚氮、磷、镁或氧不足时，能在细胞内大量积累聚-羟基烷酸羟基烷酸，以以作

34、为碳源和能源的贮存物。作为碳源和能源的贮存物。 当限制性营养物再次被提供时，当限制性营养物再次被提供时，PHAsPHAs 能被细胞内酶降解后作能被细胞内酶降解后作为碳源和能源利用。为碳源和能源利用。 细胞中积累的细胞中积累的PHAsPHAs以单个粒子的形态存在，不同微生物细胞以单个粒子的形态存在，不同微生物细胞含有的颗粒数量及颗粒大小不同。含有的颗粒数量及颗粒大小不同。 在真养产碱杆菌中，每个细胞含有在真养产碱杆菌中，每个细胞含有8 8 1010个颗粒，每个颗粒直个颗粒，每个颗粒直径大小为径大小为0.20.2 0.50.5 m m。 在电子显微镜中观察到这些内含物具有高度的折光性，颗粒在电子显

35、微镜中观察到这些内含物具有高度的折光性，颗粒外面包裹着一层膜，该膜没有生物膜那样的典型双层结构，膜中外面包裹着一层膜，该膜没有生物膜那样的典型双层结构，膜中含有含有PHAsPHAs合成酶的降解酶系统。合成酶的降解酶系统。 PHAPHAs s除在微生物饥饿条件下作为碳源和能源外，还除在微生物饥饿条件下作为碳源和能源外，还为微生物在其他环境压力条件下（如渗透压、脱水或紫为微生物在其他环境压力条件下（如渗透压、脱水或紫外线照射）的生存起着重要的作用。外线照射）的生存起着重要的作用。 一般说来，在恶劣环境下含有一般说来，在恶劣环境下含有PHAPHAs s的细胞微生物比的细胞微生物比不含不含PHAPHA

36、s s的细胞具有更高的存活率。的细胞具有更高的存活率。 最近研究发现，最近研究发现，PHAPHAs s除了作为细胞内贮物的生理作除了作为细胞内贮物的生理作用外，还是细胞膜的结构化合物。用外，还是细胞膜的结构化合物。 不同微生物合成不同微生物合成PHAPHAs s的途径不同，基质不同，其合的途径不同，基质不同，其合成途径也有差异，这是微生物代谢多样性的一种表现。成途径也有差异，这是微生物代谢多样性的一种表现。 在不同微生物中，利用不同基质合成在不同微生物中，利用不同基质合成PHAPHA的主要途径包括：的主要途径包括： （1 1）真养产碱杆菌及多数细菌利用糖作为基质合成）真养产碱杆菌及多数细菌利用

37、糖作为基质合成PHB;PHB; （2 2）深红红螺菌利用糖作为基质合成深红红螺菌利用糖作为基质合成PHB;PHB; （3 3）食油假单胞菌等利用中链烃、醇及酸合成具有与基）食油假单胞菌等利用中链烃、醇及酸合成具有与基质链长有关的质链长有关的HAHA单位的单位的PHAPHA； （4 4）一株产碱杆菌利用长链偶碳数脂肪酸合成一株产碱杆菌利用长链偶碳数脂肪酸合成PHB;PHB; （5 5）铜绿假单胞菌等利用糖质碳源合成具有中链）铜绿假单胞菌等利用糖质碳源合成具有中链HAHA单位单位的的PHA;PHA; （6 6）真养产碱杆菌等利用糖加丙酸合成真养产碱杆菌等利用糖加丙酸合成PHBVPHBV。 在真养产

38、碱杆菌以及许多微生物中，在真养产碱杆菌以及许多微生物中，PHB PHB 是从已酰是从已酰CoACoA通过三步反应合成。通过三步反应合成。 一是由生物合成的一是由生物合成的-酮基硫酯酶催化两个已酰酮基硫酯酶催化两个已酰CoACoA的的cccc结合；结合； 二是由依赖二是由依赖NADPHNADPH的已酰已酰的已酰已酰CoACoA还原酶催化产生还原酶催化产生D(-)3-D(-)3-羟基丁酰羟基丁酰CoACoA ； 三是由三是由PHBPHB聚合酶将聚合酶将D(-)3-D(-)3-羟基丁酰羟基丁酰CoACoA连接到连接到PHBPHB 正在增长的链上。正在增长的链上。第四节第四节 PHAsPHAs的发酵生

39、产的发酵生产一、一、 PHAsPHAs的流加发酵的流加发酵二、二、 PHBPHB发酵过程中理论产率的计算发酵过程中理论产率的计算一、一、 PHAsPHAs的流加发酵的流加发酵 阻碍聚阻碍聚-羟基烷酸（羟基烷酸（PHAsPHAs）实现大规模工业化生产的实现大规模工业化生产的主要障碍是生产成本问题。影响主要障碍是生产成本问题。影响PHAsPHAs生产成本的主要因素生产成本的主要因素有菌种、原料、操作方式以及提取方法等。有菌种、原料、操作方式以及提取方法等。 所以，降低所以，降低PHAsPHAs的生产成本主要考虑以下几点：的生产成本主要考虑以下几点： 其一，采用廉价基质（如其一，采用廉价基质（如CO

40、CO2 2、H H2 2和和O O2 2或甲醇、乙醇、或甲醇、乙醇、葡萄糖及来自农业废物的有机酸等）和提高最终产物对基葡萄糖及来自农业废物的有机酸等）和提高最终产物对基质的产率系数，以降低发酵原材料的成本。质的产率系数，以降低发酵原材料的成本。 其二，提高生产强度（如选育高产菌株，采用合适的其二，提高生产强度（如选育高产菌株，采用合适的发酵生产方式等），以降低操作成本。发酵生产方式等），以降低操作成本。 其三，改进提取、纯化技术（如不采用价格昂贵的有其三，改进提取、纯化技术（如不采用价格昂贵的有机溶剂、简化操作等），以降低提取成本。机溶剂、简化操作等），以降低提取成本。 除上述除上述3 3点外

41、，还应采用适宜的发酵生产方式，这点外，还应采用适宜的发酵生产方式，这是提高聚合物的生产率和改进其质量的关键。是提高聚合物的生产率和改进其质量的关键。 现代发酵工业中，绝大多数的培养均采用纯种液体现代发酵工业中，绝大多数的培养均采用纯种液体培养方法，液体培养的操作方法主要有间歇（分批）培培养方法，液体培养的操作方法主要有间歇（分批）培养、连续培养和流加培养养、连续培养和流加培养3 3种。种。 细胞的分批培养是一种间歇培养方式。在培养时，细胞的分批培养是一种间歇培养方式。在培养时，培养系统除了需不断进行通气和加入酸碱溶液以及排出培养系统除了需不断进行通气和加入酸碱溶液以及排出废气外，与外界没有其他

42、的物料交换。在分批培养中，废气外，与外界没有其他的物料交换。在分批培养中，细胞浓度、基质浓度和产物浓度均不断发生变化。细胞浓度、基质浓度和产物浓度均不断发生变化。 连续培养的方法是将新鲜的培养基连续地加入有连续培养的方法是将新鲜的培养基连续地加入有均匀培养液的反应器中，同时排出发酵液，使培养环境均匀培养液的反应器中，同时排出发酵液，使培养环境如底物浓度、产物浓度、细胞浓度、比生长速率等可不如底物浓度、产物浓度、细胞浓度、比生长速率等可不随时间变化而变化，保持培养的稳定状态。随时间变化而变化，保持培养的稳定状态。在连续培养在连续培养中，任何一种营养成分都可以用作限制性底物。中，任何一种营养成分都

43、可以用作限制性底物。 所谓流加培养，又称半连续发酵，是指在培养过所谓流加培养，又称半连续发酵，是指在培养过程中不断向反应器内加入培养基，但不同时取出培养液程中不断向反应器内加入培养基，但不同时取出培养液的培养方法。的培养方法。它是一种介于分批培养和连续培养之间的它是一种介于分批培养和连续培养之间的培养方法。兼有两者的优点，而又克服了两者的缺点。培养方法。兼有两者的优点，而又克服了两者的缺点。和传统的分批培养相比，流加培养可以解除底物抑制、和传统的分批培养相比，流加培养可以解除底物抑制、葡萄糖效应、代谢阻遏等；与连续培养相比，流加培养葡萄糖效应、代谢阻遏等；与连续培养相比，流加培养的染菌可能性小

44、，也不易产生菌种老化变异等。的染菌可能性小，也不易产生菌种老化变异等。 所谓限制性底物，是指在培养微生物的营养物质中，所谓限制性底物，是指在培养微生物的营养物质中，对微生物的生长起到限制作用的营养物。对微生物的生长起到限制作用的营养物。 由于许多微生物只有在氮、磷或氧等缺乏而碳源过由于许多微生物只有在氮、磷或氧等缺乏而碳源过量的不平衡生长条件下才能大量积累量的不平衡生长条件下才能大量积累PHAsPHAs，所以在所以在PHAsPHAs的发酵生产中，一般可将发酵过程分成两个阶段来进行的发酵生产中，一般可将发酵过程分成两个阶段来进行控制：控制： 第一阶段为菌体细胞的形成阶段，在此阶段微生物第一阶段为

45、菌体细胞的形成阶段，在此阶段微生物利用基质形成大量菌体，而多聚体利用基质形成大量菌体，而多聚体PHAsPHAs的积累量很少；的积累量很少； 第二阶段为多聚体形成阶段，在此阶段第二阶段为多聚体形成阶段，在此阶段PHAsPHAs大量形大量形成而菌体细胞基本上不繁殖。成而菌体细胞基本上不繁殖。 在简单分批培养过程中，当菌体生长进行到一定浓在简单分批培养过程中，当菌体生长进行到一定浓度时，培养基中一种或几种营养物质的浓度可能成为度时，培养基中一种或几种营养物质的浓度可能成为菌体细胞进一步繁殖的限制因素，菌体细胞进一步繁殖的限制因素，而简单地增加该种而简单地增加该种营养物质的初始浓度不可能导致菌体生长量

46、的相应增营养物质的初始浓度不可能导致菌体生长量的相应增加，相反某些成分在较高浓度时对细胞会产生毒害作加，相反某些成分在较高浓度时对细胞会产生毒害作用，用，另一些还可能形成沉淀，因而采用分批发酵法不另一些还可能形成沉淀，因而采用分批发酵法不能获得很高的细胞干重以及高的产物浓度和生产强度。能获得很高的细胞干重以及高的产物浓度和生产强度。 而采用流加发酵法进行而采用流加发酵法进行PHAsPHAs的生产时，就可以在的生产时，就可以在某些必需的营养成分成为生长限制因素之前，对其进某些必需的营养成分成为生长限制因素之前，对其进行定量流加，延长细胞的对数生长期，从而可获得较行定量流加，延长细胞的对数生长期，

47、从而可获得较高的菌体浓度。高的菌体浓度。 （一）（一） 采用流加培养法生产采用流加培养法生产PHBPHB 在实际应用中，通常选择限制培养基中的氮源作为在实际应用中，通常选择限制培养基中的氮源作为流加控制的手段，因为微生物的生长对氮源的依赖比对流加控制的手段，因为微生物的生长对氮源的依赖比对其他离子更强，微生物对氮源的同化作用也比其他离子其他离子更强，微生物对氮源的同化作用也比其他离子更快。更快。 研究发现，在流加培养过程中，控制恰当的碳氮比研究发现，在流加培养过程中，控制恰当的碳氮比相当重要。为什么？相当重要。为什么？ 在在PHBPHB 合成阶段开始时，采用较低的碳氮比可以保合成阶段开始时，采

48、用较低的碳氮比可以保持细胞具有较高的持细胞具有较高的PHBPHB合成能力，合成能力，随着胞内随着胞内PHBPHB 含量的增含量的增加，微生物细胞的加，微生物细胞的PHBPHB合成能力下降，这时可逐渐增加培合成能力下降，这时可逐渐增加培养基中的碳氮比。养基中的碳氮比。 在流加培养过程中，可以通过在线检测尾气中在流加培养过程中，可以通过在线检测尾气中COCO2 2浓度，来间接估计胞内浓度，来间接估计胞内PHBPHB含量，达到适时控制培养含量，达到适时控制培养过程中碳氮比的目的。过程中碳氮比的目的。 真氧产碱杆菌真氧产碱杆菌A.eutrophusA.eutrophus是到目前为止对其动是到目前为止对

49、其动力学和代谢途径研究得较为透彻的、也是唯一已用于力学和代谢途径研究得较为透彻的、也是唯一已用于工业过程来生产多聚体的一类微生物，工业过程来生产多聚体的一类微生物，此菌能利用多此菌能利用多种基质如葡萄糖、果糖、乙酸、丁酸或种基质如葡萄糖、果糖、乙酸、丁酸或H H2 2、O O2 2和和COCO2 2的的混合气体等来合成混合气体等来合成PHBPHB。 通过对真氧产碱杆菌其生长过程的动力学研究发现，通过对真氧产碱杆菌其生长过程的动力学研究发现，在菌体生长阶段和在菌体生长阶段和PHBPHB形成阶段之间存在一短暂的过度形成阶段之间存在一短暂的过度阶段，阶段，此过程阶段在氮源耗尽的同时形成，仅维持不到此

50、过程阶段在氮源耗尽的同时形成，仅维持不到一个世代时间，此时，残留菌体和蛋白质的形成速率降一个世代时间，此时，残留菌体和蛋白质的形成速率降为零，并且它们的含量在随后的时间内保持恒定，为零，并且它们的含量在随后的时间内保持恒定，而而PHBPHB的形成速率迅速达到最大值，随后逐渐下降至最终的形成速率迅速达到最大值，随后逐渐下降至最终为零。为零。 很明显，在以氮源为限制条件的很明显，在以氮源为限制条件的PHBPHB形成过程中，形成过程中，限量添加氮源能促进限量添加氮源能促进PHBPHB的积累，的积累，这些结果与前面提到这些结果与前面提到的用甲基营养菌合成的用甲基营养菌合成PHBPHB的情况相一致，的情

51、况相一致，在在PHBPHB形成阶段形成阶段维持很低浓度的氮源时，维持很低浓度的氮源时， PHBPHB的形成速率比不加氮源的的形成速率比不加氮源的情况要高。情况要高。（二）（二） 采用流加培养法生产共聚物采用流加培养法生产共聚物P P（HB-co-HVHB-co-HV） 由由3-3-羟基丁酸和羟基丁酸和3-3-羟基戊酸聚合而成的共聚物羟基戊酸聚合而成的共聚物P P（HB-co-HVHB-co-HV） 是瓦尔恩等人在是瓦尔恩等人在19741974年从活性污泥的絮凝年从活性污泥的絮凝物中分离出的第一个共聚物，也是目前最具工业前景和物中分离出的第一个共聚物，也是目前最具工业前景和吸引力的共聚物。吸引力

52、的共聚物。 在共聚物在共聚物P P（HB-co-HVHB-co-HV）的生产过程中，流加发酵操的生产过程中，流加发酵操作比分批发酵具有明显优势。为什么？作比分批发酵具有明显优势。为什么？ 丙酸或戊酸是生产共聚物丙酸或戊酸是生产共聚物P P（HB-co-HVHB-co-HV） 所必需的所必需的基质，由于这些有机酸对菌体细胞具有一定的毒性，采基质，由于这些有机酸对菌体细胞具有一定的毒性，采用流加培养法，用流加培养法，可避免由于培养基中有机酸的积累而使可避免由于培养基中有机酸的积累而使细胞活力受到损害，从而达到提高细胞活力受到损害，从而达到提高P P（HB-co-HVHB-co-HV） 产率产率的目

53、的。的目的。 除除3-3-羟基丁酸外，现在已知有羟基丁酸外，现在已知有4040多种不同的脂肪酸可多种不同的脂肪酸可作为作为PHAsPHAs的组成成分。的组成成分。 最近的研究发现，大多数能积累最近的研究发现，大多数能积累PHBPHB的微生物也具有的微生物也具有积累共聚物积累共聚物P P（HB-co-HVHB-co-HV）的能力，的能力，而且各种微生物从有而且各种微生物从有机酸合成共聚物机酸合成共聚物P P（HB-co-HVHB-co-HV）的途径和对有机酸的耐受的途径和对有机酸的耐受能力也各不相同。能力也各不相同。 由于所用的合成共聚物的基质（如丙酸或戊酸）价由于所用的合成共聚物的基质（如丙酸

54、或戊酸）价格相对较昂贵，格相对较昂贵，如果丙酸在代谢过程中转向产能或形成如果丙酸在代谢过程中转向产能或形成乙酰乙酰CoACoA，进而形成进而形成HBHB单体，将会使共聚物中单体，将会使共聚物中HVHV单体的含单体的含量下降而导致生产成本的增加。量下降而导致生产成本的增加。 除丙酸和戊酸能被作为生产共聚物除丙酸和戊酸能被作为生产共聚物P P（HB-co-HVHB-co-HV）的基质外，的基质外，最近得到的由真氧产碱杆菌最近得到的由真氧产碱杆菌A.eutrophusA.eutrophus 异亮氨酸缺陷型突变株自发转变成的光养株异亮氨酸缺陷型突变株自发转变成的光养株R R3 3，能从单能从单一的如葡

55、萄糖或果糖等无关联碳源产生共聚物一的如葡萄糖或果糖等无关联碳源产生共聚物P P（HB-HB-co-HVco-HV）。）。 例如以果糖为碳源时，共聚物占细胞干重的例如以果糖为碳源时，共聚物占细胞干重的47%47%， HVHV单体含量单体含量7%7%，这些发现，一方面给这些发现，一方面给PHAsPHAs生物合成和生物合成和调节机制的研究增加了新的内容，调节机制的研究增加了新的内容，同时，也开辟了一同时，也开辟了一条探索从廉价的单一碳源生产共聚物条探索从廉价的单一碳源生产共聚物P P（HB-co-HVHB-co-HV）的的新路。新路。 （三）流加培养条件对多聚体相对分子质量分布的影响（三）流加培养条

56、件对多聚体相对分子质量分布的影响 多聚体的相对分子质量常常影响其质量和生物降解的多聚体的相对分子质量常常影响其质量和生物降解的速率。速率。 一般平均相对分子质量大且相对分子质量分布范围窄一般平均相对分子质量大且相对分子质量分布范围窄的多聚体具有更广泛的工业应用前景，并且提取也较方便，的多聚体具有更广泛的工业应用前景，并且提取也较方便，而对于某些特殊用途，相对分子质量不宜超过而对于某些特殊用途，相对分子质量不宜超过1 110105 5。 多聚体的平均相对分子质量大小受流加培养条件的影多聚体的平均相对分子质量大小受流加培养条件的影响。响。当培养条件恒定时，其平均相对分子质量也可以保持当培养条件恒定

57、时，其平均相对分子质量也可以保持恒定，恒定，因而只要控制适宜的流加培养条件，就可将其相对因而只要控制适宜的流加培养条件，就可将其相对分子质量控制在所需的范围之内。分子质量控制在所需的范围之内。 苏祖凯等人对假单胞菌属的微生物以甲醇为基质合苏祖凯等人对假单胞菌属的微生物以甲醇为基质合成成PHBPHB时的培养条件（如温度、时的培养条件（如温度、pHpH、甲醇浓度等）进行甲醇浓度等）进行了研究。了研究。 发现温度会影响发现温度会影响PHBPHB的形成速率和含量，但对其聚的形成速率和含量，但对其聚合度没有影响；合度没有影响； pHpH值对聚合物平均相对分子质量的影响很小；值对聚合物平均相对分子质量的影

58、响很小； 在流加培养过程中，甲醇浓度对多聚体平均相对分在流加培养过程中，甲醇浓度对多聚体平均相对分子质量的大小有显著影响。子质量的大小有显著影响。 当甲醇浓度很低（如当甲醇浓度很低（如0.50.5g/Lg/L）时，其平均相对分子时，其平均相对分子质量可达质量可达8 810105 5，当甲醇浓度很高（如，当甲醇浓度很高（如3232g/Lg/L）时，其时，其平均相对分子质量小于平均相对分子质量小于0.5 0.5 10105 5 。 除采用改变流加培养中基质浓度的方法来改变聚合除采用改变流加培养中基质浓度的方法来改变聚合物的相对分子质量大小外，另一个方法是利用细胞内物的相对分子质量大小外，另一个方法

59、是利用细胞内PHBPHB 的不平衡降解来改变其相对分子质量分布。的不平衡降解来改变其相对分子质量分布。 细胞积累多聚体是为其在恶劣环境下生存所用，因而，细胞积累多聚体是为其在恶劣环境下生存所用，因而，如果在培养过程中的某一阶段仅添加氮源而不加碳源，如果在培养过程中的某一阶段仅添加氮源而不加碳源，PHBPHB就会被细胞降解，作为能源加以利用，就会被细胞降解，作为能源加以利用，而且，低分子而且，低分子量聚合物的降解速率大于高分子量聚合物的降解速率。量聚合物的降解速率大于高分子量聚合物的降解速率。 这可使这可使PHBPHB的平均相对分子质量转换至较高的值。的平均相对分子质量转换至较高的值。 为了获得

60、更均质的共聚体，在共聚物为了获得更均质的共聚体，在共聚物P P（HB-co-HVHB-co-HV）的积累阶段开始时，应先使培养物处于碳源饥饿状态，的积累阶段开始时，应先使培养物处于碳源饥饿状态，这这样可使细胞内源样可使细胞内源PHBPHB的量大大降低，得到的共聚物的量大大降低，得到的共聚物P P（HB-HB-co-HVco-HV）就较为均一就较为均一。二、二、 PHBPHB发酵过程中理论产率的计算发酵过程中理论产率的计算 PHBPHB是仅有是仅有C C、H H和和O O元素组成的多聚物，在合成元素组成的多聚物，在合成PHBPHB所需的基质中，碳源的消耗量最大，所占发酵原料成本所需的基质中，碳源