离体鼠心低温器官保存液保存后超微结构

1、离体鼠心低温器官保存液保存后超微结构                      作者：刘凯，龙村，关彬，黑飞龙 【摘要】  目的评价阜外改良心肌保存液(fuwai modified solution, FWM），HTK液(histidine-tryptophan-ketoglurate solution)和UW液(university of wisconsin solution

2、)对离体鼠心的保存效果。方法20只雄性Wistar大鼠随机分为四组（Control组、FWM组、HTK组和UW组），每组5只。Control组切取鼠心后立即移至Langendorff装置灌注1h，其它三组分别用不同的保存液4下保存6 h，然后将离体鼠心移至Langendorff装置复灌1 h，测定复灌1h后的心肌含水量变化，并用透射电镜观察复灌1 h后心肌超微结构的改变。结果UW组心肌含水量高于Control、FWM和HTK组，而Control，FWM和HTK三组相比无显著统计学差异(P>0.05)。电镜结果显示，Control组和FWM组心肌超微结构基本正常，HTK组出现心肌超微结构改

3、变，而UW组心肌超微结构改变严重。结论FWM液的心肌保存效果优于HTK和UW液。 【关键词】  FWM液；HTK液；UW液；超微结构分析 Ultrastructural Analysis of Isolate Rat Hearts after Hypothermic Storage in Organ Preservation Solution Abstract: OBJECTIVE To compare the effects of Fuwai Modified Solution (FWM), Histidine-Tryptophan-Ketoglurate Solution (HT

4、K) and University of Wisconsin Solution (UW) for isolated rat heart preservation.METHODSMale Wistar rats (n=20) were randomly divided into 4 groups: FWM, HTK, UW and Control group. In the Control group, hearts were harvested and immediately mounted on a Langendorff apparatus and reperfused for 1 hou

5、r. In the other three groups, the hearts were excised and stored in corresponding preservation solution (4) for 6 hours, and then were  reperfused for 1 hour  on Langendorff apparatus. At the end of the reperfusion, the changes of myocardial water content and ultrastructure were determined

6、. RESULTSThe water content in  UW group was higher than Control, FWM and UW groups. No significant ultrastructural changes were found in Control and FWM groups. In contrast, myocardial structural alterations were found in HTK and UW groups. CONCLUSIONData collected from our experiment reveal th

7、at the effects of FWM solution for hypothermic preservation of isolated rat hearts are better than that of HTK and UW solutions. Key words：FWM solution; HTK solution; UW solution; Ultrastructural analysis 心脏移植是目前治疗终末期心脏病最为有效的手段。在心脏移植过程中，有效保存供体心脏对于患者术后心功能的恢复至关重要。HTK液和UW液是目前临床上最常用的两种心肌保存液，但二者心肌保存效果何者为

8、优，亦存在争议。Ku等人实验证实，HTK液心肌保存效果远优于UW液1，而Galinanes等则认为，UW液略优于HTK液2。 本实验通过观察离体鼠心用阜外改良心肌保存液(fuwai modified solution, FWM），HTK液(Histidine-Tryptophan-Ketoglurate Solution)和UW液(University of Wisconsin Solution)低温保存6 h后心肌超微结构的改变，对三种保存液的心肌保存效果进行评价，旨在进一步探讨心肌保存液保护作用机制，一方面为临床上心肌保存液的选择提供实验依据，另一方面为以后心肌保存液配方的改良奠定基础。

9、1材料与方法  1.1仪器与设备 多导生理记录仪（Macintosh，Quadra610,Australia），超级恒温器（WC/09-05，重庆实验设备厂），恒温循环器（HX-10555，北京四环科学仪器厂），改良Langendorff装置， Stockert 血泵（Gemany），混合气（O2：CO2=95%:5%，北京普莱克斯公司），自动双重纯水蒸馏器（SZ-93，上海亚荣生化仪器厂）。 1.2药品和溶液的配制HTK液（购自德国）和UW液（购自美国）用于使心脏停跳和保存心脏。组氨酸、组氨酸盐酸、色氨酸、-酮戊二酸和棉子糖（购自北京化学试剂公司，生化级）用于配制FWM液。三种保存

10、液具体成分见表1。Langendoff 灌流所用Krebs-Henseleit缓冲液（K-H液） 成分如下(mmol/L)： NaCl 118.0、KCl 4.7、KH2PO4 1.2、MgSO4 1.2、NaHCO3  25.0、CaCl2  1.25、Glucose 10.0、pH 7.4。表1心肌保存液成分比较（略）  1.3实验动物与分组 成年雄性Wistar大鼠 (体重350 g400 g) 20只，由阜外医院实验动物中心提供。根据保存液成分的不同，随机分为4组，每组5只。(1) Control组：离体心脏直接K-H液灌注1 h。(2) FWM 组：离体

11、心脏在FWM液中保存6 h后K-H液灌注1 h。 (3) HTK 组：离体心脏在HTK液中保存6 h后K-H液灌注1 h。(4) UW组：离体心脏在UW液中保存6 h后K-H液灌注1 h。 1.4离体鼠心灌流和低温保存大鼠称重后, 戊巴比妥钠（3035 mg/kg）腹腔注射，仰卧固定，经股静脉注入肝素300 IU/kg，迅速开胸，于主动脉和右锁骨下动脉交界处离断主动脉，Control组取出心脏后迅速转移并固定于Langendorff 灌流装置上，用改良K-H 液（预先用混合气饱和）经主动脉恒压(76 mmHg)灌注。整个灌注期间温度保持在37。肺动脉根部切开，使冠脉循环回流液充分引流。切开左心

12、耳，将连有压力传感器的球囊送入左心室，压力传感器与Powerlab生物信号采集处理系统连接。待离体鼠心收缩逐渐稳定后，往心室球囊内缓慢注入适量生理盐水，使左心室舒张末期压维持在10 mmHg。平衡灌注10 min 后开始测定心室血流动力学指标。FWM、HTK和UW组取出心脏后立即经主动脉根部分别灌注三种不同的4心肌保存液，恒压灌注时间控制在3 min以内，心脏表面同时降温，待心脏停跳后分别置于不同的心肌保存液中，在4条件下保存6 h后，心脏被重新置于Langendorff装置上复灌60 min，灌注条件同对照组一致。复灌开始后的前10 min 作为心脏复苏后的稳定期，10 min后开始测定血流

13、动力学指标。 1.5观察指标 1.5.1 心肌含水量灌注结束后取左心室前壁的一块心肌，用滤纸拭干，称取湿重后置于80烘箱中烘烤48 h，称心肌干重。心肌含水量(湿重干重) / 湿重× 100。 1.5.2心肌超微结构复灌1 h后，分别从Control组、FWM组、HTK组、UW组中各随机留取2例心肌，取左室壁心内膜下的一块组织，置入3戊二醛溶液中，制备电镜标本，观察各组心肌超微结构的改变。 1.6统计学处理数据以（±s）表示，并用SPSS 11.5 软件包处理。所有计量数据检验前均经方差齐性和正态分布检验。组间差异采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和SNK-q

14、 检验,P<0.05为有显著性差异。2结果 Control、FWM、HTK和UW四组大鼠平均体重分别为：（358.4±24.4）g，（381.4±14.4）g，（392.0±19.6）g和（391.4±25.7）g。组间比较统计学差异无显著性（P>0.05）。 2.1心肌含水量Control组、FWM组、HTK组和UW组心肌干湿比分别为：（82.91±1.03）%，（83.66±0.62）%，（83.47±0.99）%和（84.33±0.88）%，UW组的心肌含水量高于Control（P<0.01

15、）、FWM（P<0.05）和UW（P<0.05）组，而Control、FWM和HTK三组相比无统计学差异（P>0.05），见图1。 2.2心肌超微结构改变Control组：心肌结构清楚，心肌纤维排列整齐，肌节清，线粒体嵴排列整齐。FWM组：心肌结构清楚，肌纤维排列整齐，肌节清。线粒体无明显水肿，嵴排列整齐，结构与Control组无明显差别。HTK组：局灶性肌溶解，肌纤维疏松，线粒体轻度水肿，嵴排列尚整齐。UW组：心肌细胞内外水肿，出现心肌收缩带，毛细血管周围及心肌细胞膜下胞浆稀疏，心肌细胞间水肿，间质增宽，线粒体水肿，较多空泡变性，嵴排列紊乱。见图2，图3 。 3讨论 目前，

16、低温、冷保存液灌注是保存供体心脏最常用的方法。低温对心肌的保护作用机制已基本明确，心肌温度每降低10心肌酶活性大约下降50，因此低温可诱导心脏机械停博和减少能量消耗。但是，低温抑制Na+-K+-ATP酶的活性，细胞内外离子顺离子浓度梯度被动转运。在低温保存期间，心肌进行无氧代谢，产生乳酸等酸性代谢产物，一旦超过细胞本身的缓冲能力，则H+在细胞内积聚，细胞内H+通过Na+-H+转运机制与细胞外Na+进行交换。由于Na+-K+-ATP酶的活性受到抑制，导致细胞内Na+浓度升高，一部分Na+通过Na+-Ca2+交换体移出细胞，从而又导致缺血期间细胞内钙超载，心肌细胞挛缩，能量过度消耗。因此，如何防止

17、低温的副作用对于供体心脏的保存至关重要。 在心脏移植的相关研究中，尽管许多学者在心肌保存液中加入各种药物，如1,6-二磷酸果糖（Fructos-1,6-diphosphate）、糖原（Glycogen）、硝酸甘油（Nitroglycerine）、卡托普利（Cariporide）等，以期提高心肌保存效果，但术后发生可逆性心脏收缩功能低下或心肌顿抑的比例仍然很高3。到目前为止，供体心脏的有效保存时间仍限于4 6 h4。 目前有报道认为供体心脏低温保存8 h以上已经不再是心脏移植的禁忌症5，但临床统计证实，随保存时间的延长，移植后病死率仍有上升的趋势从低温保存2 h的9.8上升到4 h的17.66。

18、而本实验结果显示，离体鼠心在低温保存6 h后，FWM组心肌超微结构改变轻微，与Control组相比无明显的差别，而HTK和UW组心肌损伤程度较FWM组重。 UW液是一种高钾型器官保存液，但其心脏保存效果争议很大。研究表明，内皮细胞的完整性对于移植后心功能的恢复起关键作用7，而高钾可损伤冠状动脉内皮细胞，使毛细血管通透性增高、器官水肿、血管痉挛、微血管低灌注，最终导致移植后心功能低下和早期功能衰竭8。UW液中含羟乙基淀粉，理论上胶体可防止细胞间隙水肿，但本研究结果证实，离体鼠心用UW液低温保存6 h后，心肌含水量增加，出现心肌细胞内外水肿，心肌收缩带，毛细血管周围及心肌细胞膜下胞浆稀疏，心肌细胞

19、间水肿，间质增宽，线粒体水肿，嵴排列紊乱。这可能是由于UW液中高钾损伤了冠状血管内皮细胞，羟乙基淀粉渗入心肌组织间隙，最终导致心肌细胞水肿及超微结构改变。 FWM液和HTK液的心肌保存效果优于UW液，其可能的机制是：含Na+：15 mmol/L，K+：10 mmol/L，Na+浓度与细胞内液相似，可减少缺血期间钠离子的内流，使动作电位不能产生，从而在较低钾浓度的情况下使心肌在舒张期停跳，即保存了能量又可防止低温保存期间钠离子内流导致的细胞水肿；含组氨酸缓冲系统，其缓冲作用强大，可防止低温保存期间细胞内H+堆积，解除对糖酵解的抑制，从而保证了ATP的生成率。Pedro J等9实验证明含组氨酸缓冲

20、对的心脏停搏液有效地保存了心肌的ATP的水平，促进了再灌注后心肌收缩功能的恢复，减少了再灌注导致的心肌坏死。我们实验也得出了类似的结果；含-酮戊二酸及色氨酸。Hacida M10认为于酮戊二酸及色氨酸能促进心肌在缺血/再灌注期间ATP的产生，保护心肌细胞的完整性，减轻细胞水肿，提高了心肌的顺应性及收缩功能。本实验结果显示，UW组心肌细胞受损程度比FWM和HTK组严重，提示上述成分可能具有心肌保护作用。 FWM液中添加了棉子糖和还原型谷胱甘肽作为其非渗透性因素和自由基清除剂，而HTK液中的非渗透性因素和自由基清除剂是甘露醇11。Fischer 12认为，棉子糖具有细胞保护作用，可有效防止细胞水肿

21、，但其具体机制尚不清楚。而甘露醇可进入细胞，导致心肌细胞水肿13。本实验结果显示，FWM组心肌超微结构基本正常，支持Fische S这一观点。谷胱甘肽是一种自由基清除剂，它可有效清除缺血缺氧期间产生的细胞毒性因子，包括：过氧化氢，过氧化脂，二硫化物，抗坏血酸及自由基（包括羟基-一种在缺血再灌注期间形成的最具损伤力的自由基）。而在低温保存期间，心肌内还原性谷胱甘肽减少，保存液添加还原型股胱甘肽，可补充其损耗，提高心肌保存效果。Menache P 14分别用含有谷胱甘肽和不含有谷胱甘肽的心肌保护液灌停并保存鼠心6 h，复灌1 h后，鼠心在经含有谷胱甘肽的心肌保护液保存后，左室的收缩性及顺应性均有较

22、好的恢复。 总之，本实验结果显示，FWM液的心肌保存效果优于HTK液和UW液，心肌超微结构改变轻微，与Control组无明显差别。因此我们认为，通过保存液配方成分的改良，可以延长供体心脏的有效保存时间。 【参考文献】  1Ku K, Oku H,Alam Ms,et al. Prolonged hypothermic cardiac storage with histidine-tryptophan-ketoglutarate solution comparison with glucose-insulin-potassium and University of Wisconsin

23、solutionsJ. Transplantation,1997,64:971-975.2Galinanes M, Murashita T,Hearse DJ. Long-term hypothermic storage of the mammalian heart for transplantation: a comparison of three cardioplegic solutionJ. J Heart Lung Transplant,1992, 11:624-635.3Long C, Guan YL. Advance in hyperpolarized cardioplegiaJ.

24、 J Cardiovas Pulmon Dis,2002, 21(3):189-190.4Rajesh KG, Sasaguri S,Tian ZZ, et al. Potential role of mitochondrial permeability transition pore following long-time hypothermic heart preservationJ. Transplant Proc,2002, 34: 2645-2646.5Wei J,Chang CY ,Chuang YC ，et al. Successful heart transplantation

25、 after 13 hours of donor heart ischemia with the use of HTK solution:a case report J. Transplantation Proceedings,2005, 37:2253-2254.6Wheeldon D. Thoracic organ preservationJ. Perfusion,1991,6(3): 191-202.7Mankad PS, Amrani M, Rothery S, et al. Relative susceptibility of endothelium and myocardial cells to ischemia-reperfusion injuryJ. Acta Physiol Scand,1997, 161: 103-112.8Robson SC, Candinas D, Hancock W, et al. Role of endothelial cells in transplantationJ. Int Arch Allergy Immunol,1995, 106:305-322.9Pedro J, Del Nido,Wilson J, et al. The role of cardioplegic solution buffering in