脂肪酶酶活测定方法(共3页)

1、精选优质文档-倾情为你奉上脂肪酶是一种特殊的水解酶，广泛地存在于动物组织、植物种子和微生物体中，是能水解甘油三酯或脂肪酸酯产生单或双甘油酯和游离脂肪酸，将天然油脂水解为脂肪酸及甘油，同时也能催化酯合成和酯交换的酶。其在轻工、化工、医药、食品等行业有广泛的用途。近年来，随着非水酶学和界面酶学的不断深入，脂肪酶应用也不断地扩展，被广泛应用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性基团保护、高聚物的合成、肽合成等方面，应用前景广阔。脂肪酶在微生物中有广泛的分布。脂肪酶催化的反应是:甘油三酸酯+水甘油二酸酯+游离脂肪酸甘油酸酯+游离脂肪酸甘油+游离脂肪酸。脂肪酶只能在异相系统，即在油-水界面上

2、作用，对水溶性底物无作用，这一点在有机合成中合成手性中间体方面具有很多的优越性。1 滴定法（参照国家标准，适用于脂肪酶制剂）1.1 脂肪酶活力定义为1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度的pH条件下，1min水解底物产生1mol的可滴定的脂肪酸，即为一个酶活力单位，以u/g（u/mL）表示。1.2 测定原理脂肪酶在一定条件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油，所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定，用pH计或酚酞指示反应终点，根据消耗的减量，计算其酶活力。反应式为：RCOOH+NaOHRCOONa+H2O。1.3 仪器设备 恒温水浴箱，移液枪，高速匀浆机，pH计，电磁搅

3、拌器1.4 试剂溶液95酒精4%聚乙烯醇（PVA，聚合度175050）：称取4g PVA，加蒸馏水80mL，沸水中加热，并不断搅拌，使其完全溶解，慢速搅拌，以免产生过多气泡，冷却后定容至100mL，用双层纱布过滤后备用。橄榄油(分析纯)底物溶液：按4%聚乙烯醇：橄榄油=3:1比例混合，用高速匀浆机处理6min（分两次处理，间隔5min，每次处理3min）。pH7.5磷酸缓冲液：称取十二水磷酸氢二钠39.62g，磷酸二氢钾1.96g，用水溶解并定容至500mL，调节溶液的pH到7.50.05。0.05mol/L氢氧化钠按GB/T601配制与标定。使用时稀释10倍。10g/L酚酞指示液：GB/T6

4、03配制。1.5 待测酶液的制备称取酶样品1g2g，精确至0.0002g，用磷酸缓冲液溶解并稀释。如果是粉末，可加少量缓冲液研磨再稀释。测定时控制酶液浓度，样品与对照消耗碱量之差控制在1mL2mL范围内。1.6 测定1.6.1 电位滴定法按pH计使用说明书进行仪器校正；取两个100mL烧杯，分别作为空白A和样品B，分别加入底物溶液4mL和缓冲液5mL，再于A中加入95酒精15.00mL，于400.2水浴中预热5min，然后各加1mL酶液，立即混匀计时，准确反应15min后，于B中立即补加15.00mL 95酒精终止反应，取出。在烧杯中加入一转子，置于电磁搅拌器上，边搅拌，边用氢氧化钠标准溶液滴

5、定，至pH10.3，为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。1.6.2 指示剂滴定法取两个100mL三角瓶，分别作为空白A和样品B，分别加入底物溶液4mL和缓冲液5mL，再于A中加入95酒精15.00mL，于400.2水浴中预热5min，然后各加1mL酶液，立即混匀计时，准确反应15min后，于B中立即补加15.00mL 95酒精终止反应，取出。于A、B瓶中各酚酞两滴，用氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保持30s不退色为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。1.6.3 计算 脂肪酶制剂的酶活力按以下公式计算：式中：X1样品的酶活力，u/g；V1滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单

6、位为毫升（mL）；V2滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升（mL）；c氢氧化钠标准溶液，单位为摩尔每升（mol/L）500.05mol/L氢氧化钠溶液1.00mL相当于脂肪酸50mol；n1样品的稀释倍数；0.05氢氧化钠标准溶液浓度换算系数；15反应时间15min，以1min计算。4 讨论影响脂肪酶测定结果有很多因素，其中底物、反应温度和pH因素影响最大。在滴定法中，以前国外有报导测定脂肪酶酶活时，不将底物制成乳化液，直接在搅拌状态下对油脂进行酶解反应，然后用碱滴定生成的脂肪酸。不乳化测得的结果平行性较差，这可能是反应过程中的随机误差引起的。因为不乳化时，反应体系是酶的水溶液加入底物橄榄油中，水与油是互不相溶的，必然造成体系的不均匀，酶不能与底物充分接触，反应不完全，因此测定的平行性较差，可比性也差。酶都有其最适的反应温度，