输日动物源性蜂产品残留限量及检测技术PPT69(3)

1、Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ输日动物源性（蜂产品）残留限量及检测技术输日动物源性（蜂产品）残留限量及检测技术报告人：沈崇钰报告人：沈崇钰2006年年4月月 北京北京Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ介绍内容介绍内容一、日本肯定列表与蜂产品出口一、日本肯定列表与蜂产品出口二、蜂产品中各类抗生素残

2、留检测二、蜂产品中各类抗生素残留检测Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ一、日本肯定列表与蜂产品出口一、日本肯定列表与蜂产品出口Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ 2003年5月，日本修订了食品卫生法 依据新修订的食品卫生法，2006年5月29日，实施食品中农业化学品（农兽药及饲料添加剂）残留限量“肯

3、定列表制度”Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ日本将要实施的日本将要实施的“肯定列表制度肯定列表制度”，对食品、农产品中所，对食品、农产品中所有农业化学品残留物都作了明确规定。其中有农业化学品残留物都作了明确规定。其中15种农药、兽种农药、兽药禁止使用；药禁止使用；797种农药、兽药及饲料添加剂设定了种农药、兽药及饲料添加剂设定了53862个限量标准（包括个限量标准（包括“现行标准现行标准”和和“暂定标准暂定标准”）；对没）；对没有设定限量标准的

4、，执行有设定限量标准的，执行“一律标准一律标准”，即含量不得超过，即含量不得超过0.01毫克毫克/公斤。只有公斤。只有65种天然和化学合成物质（主要是营种天然和化学合成物质（主要是营养剂）做为豁免物质不设限量。从养剂）做为豁免物质不设限量。从2006年年5月月29日起，只日起，只有符合有符合“肯定列表制度肯定列表制度”要求的食品、农产品才能进入日要求的食品、农产品才能进入日本市场。本市场。 Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ 日本厚生省网站上公布

5、了一批检测方法（176个）单品种检测方法166个多残留检测方法6个大多数为植物源性食品中农药残留检测方法涉及肯定列表中505种化学物质Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ 这176个检测方法中涉及蜂蜜检测的很少 方法陈旧，很多方法都是上世纪80年代的 且大多数不适用（都是单残留检测方法） 日本国内实验室也不使用这些方法 日本国内大多采用多残留检测技术Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnim

6、al Plant and Food Inspection Center, JSCIQ目前日本对蜂产品中残留分类目前日本对蜂产品中残留分类兽药类农药类添加剂类极少极少Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ目前日本对蜂产品中动物用药分类目前日本对蜂产品中动物用药分类兽药分类氯霉素类四环素类硝基呋喃类氨基糖苷类大环内酯类内酰胺类苯并咪唑类硝基咪唑类阿维菌素类大环内脂类同化激素类苯乙胺类Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Cen

7、ter, JSCIQ农药分类菊酯类有机氯类有机磷类其它杀鼠剂类Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ 出口日本蜂蜜现在要求检测的重要兽药项目（高风险项目）-（双氢）链霉素（氨基糖苷类）氯霉素硝基呋喃类喹诺酮类泰勒菌素、红霉素（大环内脂类）内酰胺类Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ二、蜂产品中各类抗生素残

8、留检测技术二、蜂产品中各类抗生素残留检测技术（高风险类药物）（高风险类药物）Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ 氯霉素（Chloramphenicol, 简称CAP）是一种十分有效的广谱抗生素，自从1950年来，广泛的应用于食用动物的疾病的预防和治疗。一、氯霉素检测一、氯霉素检测目前限量暂时定为目前限量暂时定为0.1ug/kgAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant an

9、d Food Inspection Center, JSCIQ至今为止，氯霉素残留仍然在蜂蜜和王浆产品中大量检出至今为止，氯霉素残留仍然在蜂蜜和王浆产品中大量检出Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnalyticalTechniqueAdvantageDisadvantageHPLCQuantitative methodologyLOD 1 5 g / kgLC-MS/MSQuantitative /confirmatoryAt 0.3 g/kg

10、Expensive / specialist equipmentELISACost-effective, high-throughput techniqueReproducibility of kits is often variableMicrobial InhibitionCost-effective, little specialist equipment LOD 50 500 g / kg!BiosensorQuantitative, sensitive 20 g/kgAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant

11、and Food Inspection Center, JSCIQ卡拉胶是从红藻的角叉菜属 (Chondrus)、麒麟菜属(Eucheuma)、杉藻属(Gigartina)及沙菜属(Hypnea)等品种海藻中提取的海藻多糖的统称。在食品工业中卡拉胶主要用作凝胶剂、稳定剂和持水剂广泛使用于鸡肉产品和冰淇淋食品中卡拉胶卡拉胶(Carrageenan) Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ050100150200250RawAlkaliWash 1Was

12、h 2Wash 3 + BleachWash 3 - BleachSEM in carageenan: processingAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ总结总结1、在一些特定的条件下，硝基呋喃类药物和其代谢物具有非指纹性，、在一些特定的条件下，硝基呋喃类药物和其代谢物具有非指纹性， 存在非人为污染的可能性存在非人为污染的可能性 2、测定硝基呋喃类代谢物的方法，液质联用是唯一的选择、测定硝基呋喃类代谢物的方法，液质联用是唯一的选择3、内标法是

13、准确定量的必要条件、内标法是准确定量的必要条件4、已有蜂蜜中硝基呋喃类代谢物检测国标方法，王浆中该类药物残留、已有蜂蜜中硝基呋喃类代谢物检测国标方法，王浆中该类药物残留检测方法已经申报，验证阶段检测方法已经申报，验证阶段Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ三、链霉素检测技术三、链霉素检测技术无限量规定，暂时定为无限量规定，暂时定为10ug/kgAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal

14、Plant and Food Inspection Center, JSCIQ放射免疫分析法（CHARM II）酶联免疫吸附分析法（ELISA）高效液相色谱法（HPLC）液相色谱质谱联用分析法(LC-MS/MS)Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ可以初筛，确认方法，柱后衍生荧光测定方法和气质联用方法可以初筛，确认方法，柱后衍生荧光测定方法和气质联用方法目前有液质方法，但必须使用挥发性含氟酸（三氟乙酸和七氟目前有液质方法，但必须使用挥发性含氟酸（三

15、氟乙酸和七氟正丁酸）做为流动相使用，保持峰形。正丁酸）做为流动相使用，保持峰形。严重影响负离子测定（例如氯霉素），对正离子测定无影响。严重影响负离子测定（例如氯霉素），对正离子测定无影响。目前已有蜂蜜中链霉素检测国标方法，王浆中链霉素检测方法目前已有蜂蜜中链霉素检测国标方法，王浆中链霉素检测方法国标已申报，验证阶段国标已申报，验证阶段Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQSuitable for use as screening assaysMS-M

16、SLC/GC-MSHPLC-FHPLC-UVELISAMicrobiologicalDiscrimination depends on method usedAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQMS-MSLC/GC-MSHPLC-FHPLC-UVELISAMicrobiologicalSuitable for use as confirmatory assays for MRL compoundsDiscrimination depends on

17、method usedAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ四、蜂产品中氟喹诺酮类药物测定四、蜂产品中氟喹诺酮类药物测定 喹诺酮类（quinolones，QNs）药物是近二十年来迅速发展起来的一类十分重要的光谱抗生素，是继磺胺类药物之后人类在合成抗生素方面最重要的突破 XNOOOHR2FR1Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Ce

18、nter, JSCIQ 由于由于QNs属于高极性、高熔点物质，因此无法用气相色谱（属于高极性、高熔点物质，因此无法用气相色谱（GC）方方法进行测定。而液相色谱配合不同检测器是目前测定法进行测定。而液相色谱配合不同检测器是目前测定QNs类物质的主要类物质的主要方法。根据方法。根据QNs具有强紫外吸收合荧光性质，因此，紫外检测器合荧光具有强紫外吸收合荧光性质，因此，紫外检测器合荧光检测器是使用最为广泛的检测器。荧光检测方法检测限一般在检测器是使用最为广泛的检测器。荧光检测方法检测限一般在10g/kg，能满足多数测定需求，灵敏度比紫外检测方法高能满足多数测定需求，灵敏度比紫外检测方法高1020倍。紫

19、外方法倍。紫外方法用于制剂、饲料中用于制剂、饲料中QNs检测，检测波长检测，检测波长254280nm。随着质谱检测器的随着质谱检测器的普及和应用，高效液相色谱串联质谱方法已经成为所有检测方法中的普及和应用，高效液相色谱串联质谱方法已经成为所有检测方法中的首选。首选。Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ分析分析QNs中需要注意问题中需要注意问题1、通过调节适合的pH（4-6），酸碱 LLE是提取QNs的基本方法，可以满足一般分析要求近些年来，固相萃取

20、，尤其是SCX（阳离子交换柱）或者SAX（阴离子交换柱）广泛使用，利用pH调节QNs的电荷状况，可以有效去处某些基质干扰。Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ2、仪器分析容易产生残留记忆效应、仪器分析容易产生残留记忆效应选择合适的溶剂选择合适的溶剂Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ已经申请蜂蜜和王浆中

21、喹诺酮检测国家标准已经申请蜂蜜和王浆中喹诺酮检测国家标准 Test amount1234567Enrofloxacin10101014.3101010Ciprofloxacin10101016.41014.110Norfloxacin13.3120.41086.316.413.871.8Ofloxacin10101010101010市场上某些品牌蜂蜜中喹诺酮类残留情况市场上某些品牌蜂蜜中喹诺酮类残留情况（ugkg）Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCI

22、Q五、硝基咪唑类残留检测技术五、硝基咪唑类残留检测技术硝基咪唑类（nitroimidazoles）药物是近些年来迅速发展起来的一类十分重要的抗生素，其具有抗厌氧菌感染作用，用来治疗各种动物的球虫病。 Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ目前国内外测定硝基咪唑类的仪器方法有极谱法、气相色谱法、气质联用方法、酶联免疫吸附法和高效液相色谱配合紫外检测器和质谱检测器方法。气相方法需要进行衍生化，过程较为繁琐，酶联免疫吸附方法不适合基质复杂样品，同样液相色谱

23、配合紫外检测器尽管灵敏度可以勉强达到欧盟要求，但是对前处理净化要求严格。而液相色谱配合质谱检测器是目前国外首选方法，抗干扰能力强，定性定量准确，完全可以满足目前国内外要求。 目前已经申请蜂蜜和王浆中该类药物残留的国家标准Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ分析硝基咪唑类药物残留需要注意问题分析硝基咪唑类药物残留需要注意问题在动物组织中分析目标化合物会不一致在动物组织中分析目标化合物会不一致NNCH2OHN+O-OCH3二甲硝二甲硝NNN+O-OCH

24、3CH3代谢物代谢物目标化合物目标化合物NNN+O-OCH3CH3OHC H3异丙硝唑异丙硝唑目标化合物目标化合物代谢物代谢物NNO2NCH3CH3CH3然而，甲硝唑和洛硝哒唑其在动物体内目标化合物仍然是母体然而，甲硝唑和洛硝哒唑其在动物体内目标化合物仍然是母体Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ在动物组织中存在不均匀性，蜂产品中是否需要测定代在动物组织中存在不均匀性，蜂产品中是否需要测定代谢物，没有定论谢物，没有定论分析硝基咪唑类药物残留需要注意

25、问题分析硝基咪唑类药物残留需要注意问题在室温下保存迅速分解，甚至在在室温下保存迅速分解，甚至在4（冷藏）（冷藏） 状态下保存状态下保存在冷冻保存状态下稳定在冷冻保存状态下稳定可以选择动物血浆作为测定目标组织可以选择动物血浆作为测定目标组织Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQNRHSOONRH六、磺胺类残留检测技术六、磺胺类残留检测技术取代基取代基已有蜂蜜中已有蜂蜜中10种和种和16种磺胺类液相、液质国家标准种磺胺类液相、液质国家标准Animal P

26、lant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ目前，磺胺类药物残留的检测方法主要有 免疫法 微生物法 理化分析法气相色谱（GC）分光光度法高效液相色谱（HPLC）联用技术（GC/MS、LC/MS）薄层分析法（TLC）ELISAELISACHARM IICHARM IIAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ磺胺种类多，性质差异大，大

27、部分磺胺药物的磺胺种类多，性质差异大，大部分磺胺药物的pKa在在5-8之间，之间，提取方法各式各样提取方法各式各样A、单一溶剂提取单一溶剂提取B、混合溶剂提取混合溶剂提取C、酸碱缓冲溶液提取酸碱缓冲溶液提取D、酸碱缓冲溶液酸碱缓冲溶液+溶剂提取溶剂提取对于蜂蜜样品，可以通过缓冲溶液固相萃取方式得到比较好的结果对于蜂蜜样品，可以通过缓冲溶液固相萃取方式得到比较好的结果目前，本实验室可以同时测定蜂蜜中目前，本实验室可以同时测定蜂蜜中17种磺胺类药物残留种磺胺类药物残留Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Foo

28、d Inspection Center, JSCIQ六、蜂蜜中多抗生素残留检测技术六、蜂蜜中多抗生素残留检测技术 兽药种类多，单独检测时间长，成本高，目前蜂蜜已经有多农兽药种类多，单独检测时间长，成本高，目前蜂蜜已经有多农药残留检测技术。需要开发蜂蜜中多兽药残留技术，满足目前出药残留检测技术。需要开发蜂蜜中多兽药残留技术，满足目前出口日本、欧盟等国家要求。口日本、欧盟等国家要求。目前可以测定蜂蜜中共目前可以测定蜂蜜中共9大类，大类，48种兽药残留同时检测种兽药残留同时检测Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and

29、 Food Inspection Center, JSCIQ多残留分类多残留分类一、四环素类一、四环素类(tetracyclines)1、四环素(tetracycline) 2、土霉素(oxytetracycline) 3、金霉素(chlortetracycline).二、硝基咪唑类二、硝基咪唑类(nitroimidazoles)1、二甲硝咪唑(dimetridazole) 2、甲硝哒唑(metronidazole) 3、洛硝哒唑(ronidazole)三、二氨基嘧啶类三、二氨基嘧啶类(diaminopyrimidines)1、三甲氧苄氨嘧啶(trimethoxypyrimidine) 四、大

30、环内酯类四、大环内酯类(macrolides)1、竹桃霉素(oleandomycin) 2、泰乐菌素(tylosin) 3、红霉素(erythromycin)5、罗红霉素(roxithromycin), 6、交沙霉素(josamycin) 7、替米卡星(timicosin) 8、北里霉素(kitasamycin), 9、螺旋霉素III(spiramycin III) 10、螺旋霉素II(spiramycin II),11、螺旋霉素I(spiramycin I) Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food

31、 Inspection Center, JSCIQ五、林可胺类五、林可胺类(lincosamides)1、林可霉素(lincomycin) 2、氯林可霉素(clindamycin) 六、六、-内酰胺类内酰胺类(-lactam antibiotics)1、青霉素G(benzyl penicillin) 2、青霉素V(penicillin V) 3、乙氧萘青霉素(nafcillin), 4、苯唑青霉素(oxacillin) 5、邻氯青霉素(cloxacillin) 6、双氯青霉素(dicloxacillin) 七、磺胺类七、磺胺类(sulfonamides)1、磺胺嘧啶(sulfadiazine)

32、 2、磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine) 3、磺胺喹噁啉(sulfaquinoxaline) 4、磺胺-6-甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine) 5、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine), 6、磺胺间二甲氧嘧啶(sulfadimethoxine) 7、磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole) 8、磺胺噻唑(sulfathiazole), 9、磺胺吡啶(sulfapyridine) 10、磺胺脒(sulfaguanidine)11、磺胺醋酰(sulfacetamide) 12、磺胺氯哒嗪(sulfachloropyridazine) 13、磺胺甲氧哒嗪(sul

33、famethoxypyridazine) 14、磺胺二甲异噁唑(sulfisoxazole)15、磺胺甲噻二唑(sulfamethizole) 16、磺胺对甲氧嘧啶(sulfameter), 17、磺胺邻二甲氧嘧啶(sulfamethoxine) Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ八、氯霉素类八、氯霉素类(chloramphenicols)1、氯霉素(chloramphenicol)九、喹诺酮类九、喹诺酮类(quinolones)1、氧氟沙星(o

34、floxacin) 2、环丙沙星(ciprofloxacin) 3、诺氟沙星(norfloxacin)4、恩诺沙星(enrofloxacin) Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ母离子和碎片离子信息母离子和碎片离子信息Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ母离子和碎片离子信息母离子和碎片离子信息Anim

35、al Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ Internal Standard13C6-Sulfamethazine285.2162(20)D5-Chloramphenicol326157(19)D5-Norfloxacin325.1281(18)D3-Dimetridazole14599(16)使用内标使用内标内标并不做定量使用内标并不做定量使用Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant

36、 and Food Inspection Center, JSCIQ内标作用内标作用1、多残留分析需要进行分时间段进行分析，容易出现保留时间漂移，、多残留分析需要进行分时间段进行分析，容易出现保留时间漂移，需要利用内标进行定位需要利用内标进行定位2、利用内标来判断每次分析是否在正常变化范围以内、利用内标来判断每次分析是否在正常变化范围以内Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQSulfaguanidineLincomycinRonidazoleOflo

37、xacinNorfloxacinSulfadiazineMetronidazoleD3-dimetridazole02468101214161820Time (min)050100050100050100050100050100Relative Abundance0501000501000501002.605.056.125.986.086.596.396.44色谱图色谱图Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ024681012141618Time

38、(min)050100050100050100050100050100Relative Abundance0501000501000501006.476.476.516.446.556.656.757.37CiprofloxacinD3- dimetridazoleEnrofloxacinDimetridazoleSulfathiazoleTetracyclineSulfapyridineSulfamerazine色谱图色谱图Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center

39、, JSCIQ024681012141618Time (min)050100050100050100050100050100Relative Abundance0501000501000501007.448.068.378.698.709.309.109.10Spiramycin IIITimicosinSulfamonomethoxine13C6-SulfamethazineSulfamethazineSpiramycin IISpiramycin IOxytetracyclineSulfameter色谱图色谱图Animal Plant and Food Inspection Center, JSCIQAnimal Plant and Food Inspection Center, JSCIQ024681012141618Time (min)050100050100050100050100050100Relative Abundance0501000501000501009.009.429.839.9210.0410.0210.1111.538.7013C6-SulfamethazineChlortetracyclineClinda