生物统计与实验设计NNNSNP检测技术

1、SNP检测技术 内容简介1 SNP 概概 念念2 SNP 特特 点点3 SNP 检检 测测 技技 术术4 实实 验验等位基因和基因型等位基因和基因型 位于一对同源染色体的同一位置（基因型）上、位于一对同源染色体的同一位置（基因型）上、控制相对性状的两个不同形式的基因叫等位基因。控制相对性状的两个不同形式的基因叫等位基因。 一个基因由于突变（包括中性突变）可形成一个基因由于突变（包括中性突变）可形成2 2个个以上的等位基因，不同的等位基因可产生不同的遗传以上的等位基因，不同的等位基因可产生不同的遗传特征的变化，同时控制相对性状的显、隐性关系和遗特征的变化，同时控制相对性状的显、隐性关系和遗传效应

2、。如由突变形成的多种等位基因可产生多种异传效应。如由突变形成的多种等位基因可产生多种异常表型。常表型。 正常基因称为正常基因称为野生型基因野生型基因：具有野生型：具有野生型基因的细胞或个体称为基因的细胞或个体称为野生型野生型（wild type）。）。 基因突变（基因突变（gene mutation）：携带突变）：携带突变基因的各种类型的细胞或个体称为基因的各种类型的细胞或个体称为突变体或突突变体或突变型变型（mutant）。）。一、SNP 的概念 p单核苷酸多态性单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列

3、的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即SNP。一般而言，SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。p它包括单碱基的转换, 颠换、 插入及缺失等形式A/ GA/ G、A/ TA/ T、A/ CA/ C、C/ GC/ G、C/ T C/ T 和和G/ G/ T T转换的发生频率占多数二、SNP在基因组内的形式:p一是遍布于基因组的大量单碱基变异一是遍布于基因组的大量单碱基变异; ; p二是分布在基因编码区二是分布在基因编码区(coding region) , (coding region) , 称其称其为为cSNPcSNP

4、，属功能性突变。，属功能性突变。 SNPSNP在单个基因或整个基因组的分布是不均匀的：在单个基因或整个基因组的分布是不均匀的： （1 1）非转录序列非转录序列要多于要多于转录序列转录序列（2 2）在转录区）在转录区非同义突变非同义突变的频率的频率, , 比比其他方式突变其他方式突变的频率低得多。的频率低得多。 三、SNP 的特点 p在遗传学分析中在遗传学分析中, SNP , SNP 作为一类遗传标记得以广泛作为一类遗传标记得以广泛应用应用, , 主要源于这几个特点主要源于这几个特点: : （1 1）密度高密度高SNPSNP在人类基因组的平均密度估计在人类基因组的平均密度估计为为 11000 b

5、p , 11000 bp , 在整个基因组的分布达在整个基因组的分布达 3 310106 6个个, , 遗传距离为遗传距离为 2 23cM , 3cM , 密度比微卫星标记更高密度比微卫星标记更高, , 可以可以在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标记。记。（2 2）富有代表性富有代表性某些位于基因内部的某些位于基因内部的SNP SNP 有可有可能直接影响蛋白质结构或表达水平能直接影响蛋白质结构或表达水平, , 因此因此, , 它们可能它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素。代表疾病遗传机理中的某些作用因素。 （3 3）遗传稳定性遗传稳定性

6、与微卫星等重复序列多态性与微卫星等重复序列多态性标标记相比记相比, SNP , SNP 具有更高的遗传稳定性。具有更高的遗传稳定性。（4 4）易实现分析的自动化易实现分析的自动化SNPSNP标记在人群中标记在人群中只有两种等位型只有两种等位型(allele) (allele) 。这样在检测时只需一。这样在检测时只需一个个“ “ + - ”+ - ”或或“全全 无无”的方式，而无须象检测限的方式，而无须象检测限制性片段长度多态性，微卫星那样对片段的长度制性片段长度多态性，微卫星那样对片段的长度作出测量，这使得基于作出测量，这使得基于SNPSNP的检测分析方法易实现的检测分析方法易实现自动化。自动

7、化。四、多态性与突变的区别p1、多态性是一个群体概念，多态性指这个差异占群体的1%以上。否则就叫突变（小于1%）p2、SNP是多态性中的一种，只是进一步限定了差异只是单碱基。p3、SNP一般来说，是全部体细胞一样的基因型（除开嵌合体）。p4、突变一般不是一个个体全部细胞的变化。p5、如果突变发生在生殖细胞，则可以遗传，但是只要这个突变群没有达到总群体的1%，它就只是一个突变株/系。达到了1%就是多态性了。五、 SNPs经典检测方法p一大类是以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法,如: 1 . 限制性片段长度多态性法 PCR- RFLP ; 2 .单链构象多态性法 PCR- SSCP ; 3 .

8、变性梯度凝胶电泳 ( denaturing gradient gel eletrophoresis DGGE ); 4 .等位基因特异性 PCR ( allele specific PCR, ASPCR )等等另一类，基因芯片、二代测序技术（一）PCR-RFLP方法 原理：原理：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片断，如果存在SNP位点，酶切片断的长度和数量则会出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否SNP位点。 特点：特点：该技术应用的前提是SNP的位点必须含有该限制内切酶的识别位点，它是SNP筛查中最经典的方法之一.PCR-RFLP原理图（二）

9、单链构象多态性(SSCP) 原理：原理：单链DNA 在中性条件下会形成二级结构，不同的二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖于碱基的组成，单个碱基的改变也会影响其构象，最终会导致在凝胶上迁移速度的改变。 在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链 DNA 和RNA 分子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象，这样在凝胶上的迁移速率不同，出现不同的条带，检测SNP。特点：特点：由于该方法简单快速，因而被广泛运用于未知基因突变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突变类型和具体位置。（三）变性梯度凝胶电泳（DGGE）p原理：原理：是利用长度相同的双链 DNA片段解链温度不同的原理,通过梯度变性胶将

10、 DNA片段分开的电泳技术。 电泳开始时,DNA 在胶中的迁移速率仅与分子大小有关, 而一旦DNA 泳动到某一点时, 即到达该DNA 变性浓度位置时, 使得DNA 双链开始分开,从而大大降低了迁移速率。当迁移阻力与电场力平衡时, DNA 片段在凝胶中基本停止迁移。由于不同的DNA 片段的碱基组成有差异, 使得其变性条件产生差异, 从而在凝胶上形成不同的条带。（四）等位基因特异 PCR ( AS-PCR)原理：原理：根据 SNP位点设计特异引物,其中一条链(特异链)的3末端与 SNP位点的碱基互补(或相同) ,另一条链(普通链)按常规方法进行设计,因此,AS-PCR技术是一种基于SNP的PCR标

11、记。因为特异引物在一种基因型中有扩增产物,在另一种基因型中没有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增产物的有无,从而确定基因型的 SNP。PCR条件优化pTaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶：1-5U/100ul,浓度过高-非特异扩增，过低-产量不足。pdNTP:dNTP:20-200mol/L,四种浓度要相等，任何一种不等都会发生错配。pMg+浓度：0.5-2.5mmol/L,一般反应中，各种dNTP浓度为200mol/L时，Mg2+浓度为1.5-2.5mmol/L为宜，过高-非特异性，过低-酶活性降低。p引物浓度：0.1-0.5 mol/L,过高错配、特异扩增，二聚体p模版浓度、

12、质量100-200ng/100ulp偏向性扩增的解决偏向性扩增的解决 所谓偏向性扩增是因为SNP位点上会往往存在嘌吟和嘧啶的替换，在PCR过程中，聚合反应对嘧啶(C或T)比较敏感，使得嘌吟(A或T)的扩增非常少，而出现偏向性扩增，这在SNP位点附近嘌吟含量较高时特别明显。解决方案：（1）PCR扩增循环保持一个绝对低的水平；（2）在样本中加入 0.1N NaOH使DNA变性为单链，经中和后加入全基因组扩增试剂。（3）巢式PCR-RFLP”基因分型技术AAAAGAAAAGG GAAGATCCCAAAAGATCCCAATTTTCTTTTCC CTTCTAGGGTTTTCTAGGGTTAAAAGAAA

13、AGT TAAGATCCCAAAAGATCCCAATTTTCTTTTCA ATTCTAGGGTTTTCTAGGGTTpQIAGEN REPLI-g试剂盒PCR反应出现的问题与对策p1、假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。二是空气中的小片段核酸污染p解决方法：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样

14、枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。p2、出现非特异性扩增带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。 原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。p对策：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适

15、当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。p3、出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。p优点：这个方法是最便宜的， 不需要酶切， 一次PCR就可以得到GENOTYPING的信息。p缺点： PCR对于3端的特异性在不同退火温度时有出入， 所以退火温度的摸索很关键，否则假阳性扩增是很容易的。p另外， 内参照的设置

16、也很重要，这个东西还是很有意思的。 而且，所使用的引物位置无法人为调整，只能放在SNP的5段。p其基本原理是利用PCR引物的3端，对SNP位点附近的碱基进行人为改造，产生一个常规的限制性内切酶识别序列，如SNP rs1321425（rs1321425来自NCBI的refSNP数据库）的C/G，其任何一个碱基和上下游碱基无法形成一个可直接被限制性内切酶识别的序列，于是对SNP位点前的上游碱基进行改造，（五）巢式PCR-RFLP技术Nested PCR原理示意图原理示意图First PCRSecond PCRp通过对序列的分析和PCR效果的计算，将原本四个碱基AGAT改成CTGC，结合后一个碱基A

17、 以及SNP位点G，形成CTGCAG（PstI）酶切识别位点，经测序和序列对比，改造成功。又比如rs9309462和rs4646642，成功的将2 个碱基，3个碱基进行成功的改造。rs1321425TCACAAAAAATAAAAAATTTTAATTTTAAAGGAGATA C/G ACAAGAAATGAGCATGTGTGAAAGCAC TTCTGTAAACTACATGCACTAAT32（六）杂交+荧光共振分子信标（双分子间杂交） 蝎状探针（分子内杂交）1、分子信标（Molecular beacons）p分子信标是一种新型的发卡结构的寡核苷酸探针,是在样品PCR过程中因和样品DNA 杂交后而使自

18、身荧光构象改变从而实现对SNP的检测(原理见图1) 。分子信标由称为“茎”(stem)和“环”(loop) 的两部分构成,茎部分是由寡核苷酸探针两端互补的序列形成的,又可称之为手臂,环则是探针的中间部分,其序列和待扩增的目的片段互补并含有要检测的SNP 位点。在手臂的两个末端分别通过共价的方式结合上一个荧光分子和一个荧光猝灭基团,这样当分子信标游离在溶液时,它p以发卡结构存在,荧光分子与猝灭基团在空间距离上挨在一起,十分接近,荧光分子被猝灭,此时溶液无荧光信号。相反当分子信标和其完全互补的目的片段杂交时,其发卡结构被拉开而使荧光分子和荧光猝灭基团在空间上分开从而发射出荧光,其信号可提高900倍

19、。特异性很高,相差一个碱基的目的片段都能够区分,因此用于SNP位点的检测,同时我们可以对分子信标标记以不同的荧光信号,从而能够对多个样品的同时检测。由于分子信标是在样品PCR 过程中的退火时期和目的片段特异性杂交,释放荧光,某一循环或循环后的荧光量取决于那时形成的特异的PCR 产物,因此也用于PCR 产物产量的实时检测。 362、蝎状探针 （Scorpion primer） pScorpion primer 是由发卡结构(hairpin loop) 的探针部分，通过一段称为PCR stopper (or PCR blocker) 的寡核苷酸和PCR 引物的5端相连构成。p探针部分的结构和Mol

20、ecular beacons 类似,由互补序列构成的“茎”和包含SNP位点且和待检测目的片段。p而PCR stopper 的作用是在PCR 过程中阻止对探针部分的扩增,避免发卡状结构在无待检测片段时通过扩增被打开而产生错误的荧光信号。p在对样品进行检测时以Scorpion primer 作为PCR扩增的引物,当其以样品DNA作为模板延伸后,Scorpion primer 中的探针部分就可以和同一条DNA链上的互补部分杂交,而导致自身构象的改变释放出荧光信号互补的“环”构成,荧光分子和猝灭基团分结合在茎的末端,（七）SNPs高通量的检测方法 另一大类检测方法是近些年来发展起来的, 高通量、 自动

21、化程度较高的检测 SNPs的方法,较为常用的有: 1 . DNA测序法; 2 . DNA芯片检测; 3 . 飞行质谱仪 (MALDI- TOFMS )检测; 4 . 变性高效液相色谱 ( DH PLC )法等等1、DNA测序法p直接测序是最容易实施的SNP检测方法。原理原理: 通过对不同个体同一基因或基因片段进行测序和序列比较, 以确定所研究的碱基是否变异, 其检出率可达100%。 特点：特点：可以得到SNP 的类型及其准确位置等SNP分型所需要的重要参数。2、基因芯片技术( Genechips) 原理原理: :是将具有特定碱基序列的探针固定在特殊的载体上，待测基因经提取、荧光标记后，与固定好

22、的探针进行杂交，最后根据荧光的强度和种类测出待测序列的碱基类别。 特点：特点：基因芯片具有信息量大和自动化程度高的突出优点。但它也存在若干问题: 芯片造价高昂, 所需设备贵重, 不利于普及应用。3、飞行质谱仪 MALDI-TOF 原理：原理：是将变性的单链PCR产物通过与硅芯片上的化合物共价结合后, 在硅芯片上进行引物的退火, 延伸反应, 突变部位配对的碱基与正常配对的碱基不相同。根据引物在延伸反应中所结合的不同碱基的不同质量在质谱仪上显示不同峰而检测SNP。4、变性高效液相色谱( DHPLC)原理：原理：目标核酸片段PCR扩增，部分加热变性后，含有突变碱基的DNA序列由于错配碱基与正常碱基不

23、能配对而形成异源双链。因包含错配碱基的杂合异源双链区比完全配对的同源配对区和固定相的亲和力弱，更易被从分离柱上洗脱下来, 从而达到分离的目的。SNPs的有无最终表现为色谱峰的峰形或数目差异,依据此现象可很容易从色谱图中判断出突变的碱基。特点：特点：使用高效液相色谱检测SNPs具有检测效率高，便于自动化的优点，对未知SNPs的准确率可达95%以上。但DHPLC检测对所用试剂和环境要求较高,容易产生误差, 不能检测出纯合突变。5、MassARRAYpSNP分型的方法多种多样，MassARRAY分子量阵列技术是Sequenom公司推出的世界上领先的基因分析工具，通过引物延伸或切割反应引物延伸或切割反

24、应与灵敏、可靠的MALDITOF质谱质谱技术相结合，实现基因分型检测。p基于MassARRAY 分子量阵列平台的iPLEX GOLD技术可以设计最高多达40重PCR反应和基因型检测，实验设计非常灵活，分型结果准确性高。特别适合于对全基因组研究发现的结果进行验证，或者是有限数量的研究位点已经确定的情况。MassARRAY技术原理技术原理:p先通过PCR扩增目标序列，然后加入SNP序列特异延伸引物，在 SNP 位点上，延伸 1个碱基。p将制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的真空管经强激光激发，核酸分子解吸附为单电荷离子，电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真空管中的飞行时

25、间而获得样品分析物的精确分子量，从而检测出SNP位点信息。MassARRAY技术原理技术原理:pMassEXTEND：单碱基延伸反应，紧挨SNP位点设计一段探针，在反应体系中以ddNTP替代dNTP，使探针仅在SNP位点处延伸一个碱基即终止。根据SNP位点的不同，探针将结合不同的ddNTP，从而具有不同的分子量，质谱仪即可检测出这种分子量差异，从而实现SNP分型的目的。MassARRAY技术流程：技术流程： 当前SNP功能研究主要有以下几方面：p1)报告基因转染技术：这一技术主要用于研究启动子SNP对于mRNA转录效率，是通过观察转录结局来判断SNP是否具有功能。p2)EMSA技术：通过在体外

26、合成含SNP位点的寡核苷酸与转录因子特异性结合，观察结合的强度和效率,但是该技术由于只人工合成较短长度的寡核苷酸，没有考虑SNP周围遗传背景环境的影响,因此在重复性和说服力上不强。p3)ChiP技术：该技术通过超声将染色体碎片化,再将碎片化的核酸与转录因子的结合，最后通过PCR技术观察判断结合的效率和强度，该技术克服了EMSA的一些缺点,当前做的文献较多。 SNP产生功能的机制研究的建议p1.对大多数SNP而言，都由于位于一些非编码区域而不产生明显的功能性影响，此时做SNP功能意义不大。p2.启动子SNP研究是做的人最多的，相关实验技术都比较成熟，其产生功能的机制主要是影响TF与启动子的的结合能力，从而调控基因的转录。p3.编码区SNP有同义和非同义2种，非同义突变由于会导致氨基酸的变化，从而影响蛋白质的功能，特别是发生在结构功能区域的SN