药物毒理学实验

1、药物毒理学实验药物毒理学实验指导老师：指导老师： 刘刘 娟娟 罗艺晨罗艺晨 毒性试验 给实验动物进行不同途径、不同期限的染毒、检测各种毒性终点的实验。其目的是确定无害作用水平、毒性类型、靶器官、剂量-反应关系，为安全性评价或危险性评价提供重要的资料。 评价一个药物的毒性试验方法：急性毒性试验、亚慢性毒性试验、慢性毒性试验、特殊毒性试验（遗传、生殖、致突变等）、其它毒性试验（刺激性、过敏性、溶血性等）等。 评价一个药物的毒性指标：安全剂量（safety dose）、最小中毒剂量（minimal toxic dose）、最大耐受剂量（MTD）、半数致死量（LD50）、治疗指数（TI=LD50/ED

2、50）、安全范围（MS=LD1/ED99或LD5/ED95） 急性毒性试验急性毒性试验 是指一次或24小时内多次染毒的试验，是毒性研究的第一步。要求采用啮齿类或非啮齿类两种动物。通常为小鼠或大鼠采用经口、吸入或经皮染毒途径。急性毒性试验主要测定半数致死量（浓度），观察急性中毒表现， 亚慢性毒性亚慢性毒性 是指实验动物连续多日接触较大剂量的外来化合物所出现的中毒效应。所谓较大剂量，是指小于急性LD50的剂量。“多日”的确切天数，至今尚无完全统一的认识。一般认为在环境毒理学与食品毒理学中所要求的连续接触为36个月，而在工业毒理学中认为13月即可。 慢性毒性试验慢性毒性试验 是确定外来化合物的毒性下

3、限，即长期接触该化合物可以引起机体危害的阈剂量和无作用剂量。一般认为环境毒理学与食品毒理学则要求实验动物染毒1年以上或2年，而工业毒理学慢性试验动物染毒6个月或更长时间。 特殊毒性试验特殊毒性试验 包括致畸、致癌、致突变作用以及生殖毒性试验。 （1）致突变实验包括微生物回复突变试验、哺乳动物培养细胞染色体畸变试验和整体试验（常选用微核试验）。 作用于生殖系统的药物， 需进行动物显性致死试验。 （2） 致癌实验： 短期致癌实验和长期致癌实验。 （3） 致畸胎试验：于孕鼠或孕兔胚胎的器官形成期给药，观察对子代的影响。 最大耐受剂量最大耐受剂量(MTD) 指在外来化合物急性毒性实验中,化学物质不引起

4、受试对象(实验动物)出现死亡的最高剂量,故可缩写为LD0。一般不用最大耐受剂量来比较两种外来化合物的毒性。 治疗指数治疗指数 为药物的安全性指标。通常将半数中毒量（TD50）/半数有效量（ED50)或半数致死量（LD50）/半数有效量（ED50）称为治疗指数。治疗指数大的药物相对治疗指数小的药物安全，但以治疗指数来评价药物的安全性，并不完全可靠。 安全范围安全范围 是指药物的最小有效量与最小中毒量之间的范围，它表示药物的安全性，一般安全范围越大，用药越安全。药理学用上95%有效剂量（ED95）到5%中毒剂量（LD5）的距离来表示。实验一实验一 急性毒性试验急性毒性试验 （一） 药物LD50的测

5、定一、实验目的一、实验目的（1 1）理念）理念是药三分毒是药三分毒; ;（2 2）了解一些常规药物毒理学的）了解一些常规药物毒理学的试验方法试验方法，及及评价指标评价指标; ;（3 3）掌握药物急性毒性试验的）掌握药物急性毒性试验的试验设计方试验设计方法法、LDLD5050的的测定测定及及计算计算方法。方法。二二. . 实验原理实验原理 选择健康的实验动物，根据体重按随机分组方法，选择健康的实验动物，根据体重按随机分组方法，根据根据LD50LD50计算的设计原则将动物分成数个染毒组。一计算的设计原则将动物分成数个染毒组。一次或次或24h24h后，观察动物所产生的警醒毒性反应及其严后，观察动物所

6、产生的警醒毒性反应及其严重程度，中毒死亡的情况等，根据各组动物死亡数计重程度，中毒死亡的情况等，根据各组动物死亡数计算半数致死量（算半数致死量（LD50LD50）。据此分析受试动物毒性反应）。据此分析受试动物毒性反应与剂量的关系，并根据与剂量的关系，并根据LD50LD50值对药物进行值对药物进行毒性分级毒性分级。三三. .实验材料实验材料（1 1）器材）器材 1ml1ml注射器、电子天平、记号笔、镊子、剪刀等。注射器、电子天平、记号笔、镊子、剪刀等。（2 2）药品）药品 盐酸赛拉嗪注射液盐酸赛拉嗪注射液。（3 3）动物）动物 健康成年小白鼠若干只，体重健康成年小白鼠若干只，体重18-22g18

7、-22g。四四. .实验方法实验方法1. 预实验预实验各组剂量分别为各组剂量分别为Dmax、（、（ Dmax ）r、（、（ Dmax ）r2、(Dmax)r3.2.2.正式试验正式试验2.12.1试验步骤试验步骤随机分成随机分成5 5组组记录小鼠死亡记录小鼠死亡只数只数60min60min小白鼠禁小白鼠禁食食6-10h6-10h各组按试验设各组按试验设计方案给药计方案给药计算计算LDLD5050得出结论得出结论将小白鼠随机分成将小白鼠随机分成5 5组，每组，每 组组4 4只只( (随机单位随机单位组设计方法组设计方法) )。（1 1）小白鼠编号（从）小白鼠编号（从1-201-20号）用两种颜色

8、记号）用两种颜色记号笔进行标记：号笔进行标记：黑色代表个位（蓝色记号笔）；黑色代表个位（蓝色记号笔）；红色红色代表十位（代表十位（红色记号笔红色记号笔）。）。（2 2）小鼠称重并按体重大小依次排序。）小鼠称重并按体重大小依次排序。2.2 试验设计试验设计 组别组别小鼠编号小鼠编号1562112189121032013847191645131517142.3 给药方法：肌肉注射给药方法：肌肉注射组别组别注射浓度（注射浓度（mg/kg）注射量注射量110000.005mL/g体重体重2850372046605520表表1：给药方案：给药方案3.试验结果记录试验结果记录组别注射浓度（mg/kg）动物

9、数死亡数死亡率备注11000428504372044660455204表2：结果记录表4. 计算计算LD504.14.1计算方法：计算方法：目测机率单位法目测机率单位法、加权机率单加权机率单位法位法(Bliss(Bliss 法法) )、寇氏法寇氏法、序贯法序贯法。4.24.2 BlissBliss 法法是目前推荐使用的方法。此法对是目前推荐使用的方法。此法对剂量分组无严格要求，不需要剂量组有剂量分组无严格要求，不需要剂量组有0%0%和和100%100%死亡率，是死亡率，是目前公认最准确的测定方法目前公认最准确的测定方法。4.3 4.3 我国卫生部规定，我国卫生部规定，BlissBliss法法是

10、作为是作为新药新药LDLD5050测定评定测定评定必须采用的方法。必须采用的方法。计算方法计算方法1：加权机率单位法加权机率单位法(Bliss(Bliss 法法)-)-软件辅助计算软件辅助计算计算方法计算方法2： 2. 改良寇氏法公式改良寇氏法公式计算计算： LD50=log-1Xm-i(p-0.5)Xm：为最大剂量组剂量对数值；为最大剂量组剂量对数值；i：为相邻两组剂量比值的对数（相邻两组对数剂量的差值，为相邻两组剂量比值的对数（相邻两组对数剂量的差值，log2）；）；P：为各组动物死亡率（用小数表示，如果死亡率为为各组动物死亡率（用小数表示，如果死亡率为20%应写成应写成0.20）；）；p

11、：各组动物死亡率之总和各组动物死亡率之总和 。5. 评价指标评价指标急性毒性分级 小鼠一次经口LD50 大致相当于体重 70kg人的致死剂量极毒1 mg/kg 10000 mg/kg 1050克6. 注意事项注意事项6.1 6.1 正确捉拿小白鼠，正确捉拿小白鼠，防止咬伤防止咬伤；6.2 6.2 注意注意肌肉注射方法肌肉注射方法，给药剂量力求准确；，给药剂量力求准确；6.3 6.3 实时注意观察小鼠中毒症状及其发生时间、死亡实时注意观察小鼠中毒症状及其发生时间、死亡时间。时间。 7. 作业作业7.1 查阅文献，与国内外相关文献报道结果作比较。7.2 撰写试验报告（二）（二） 刺激性试验刺激性试

12、验 1. 皮肤刺激实验皮肤刺激实验 2. 眼部刺激实验眼部刺激实验1.皮肤刺激性实验皮肤刺激性实验一一.实验目的实验目的 通过比较染毒动物与正常动物皮肤的变化，学通过比较染毒动物与正常动物皮肤的变化，学习评价外源性化学物急性皮肤刺激的习评价外源性化学物急性皮肤刺激的 基本方法。基本方法。二、实验原理二、实验原理 皮肤刺激试验是指皮肤接触药物是否产生可逆性炎性症状的试验，它又分急性皮肤刺激试验（一次皮肤涂抹实验）和多次皮肤刺激试验。 所有皮肤刺激试验方法都在Draixe, Waodard和Calvery(1944）所提方法的基础上发展起来的。目前多选用家兔和豚鼠，对于强刺激或无刺激作用的药物用家

13、兔检测效果好，但对作用缓和的刺激药物用豚鼠实验结果较准确。Criffth（1977）发现家兔通常比豚鼠和人更易敏感，用这两种动物评价人体反应更为合理。三、实验材料三、实验材料 1、动物：成年健康家兔。家兔休重2kg左右，与给受试物24小时将动物背部脊柱两侧毛脱掉，脱毛面积约为体表面积1（家兔每侧各约50cm2）。 2、受试物：膏剂、液体或粉末。粉末需用适宜赋形剂（如羊毛脂、凡士林等）混匀，本实验采用10%双氧水溶液。四、实验方法四、实验方法 1、实验操作：在家兔背部受试物区和对照区（脱毛后），一次将受试物1ml均匀涂布受试物区，将生理盐水涂布于空白对照区，再以医用纱布及胶布进行包扎固定，开始计

14、时。在给药后30分钟取下包扎，用温水洗净皮肤上的残留受试物，观察受试区皮肤的变化，有无红斑、水肿等现象。 如为多次给受试物实验则一般每日涂抹一次，连续一周，其余均与一次给受试物的方法和要求一致。 2、结果判断与评价 每只动物实验结果按表1进行刺激反应评分，计算出平均分值按表2进行刺激强度评价：红斑形成积分无红斑0勉强可见1明显红斑2中等-严重红斑3紫红色红斑并有焦痂形成4水肿形成无水肿0勉强可见1皮肤隆起轮廓清楚2水肿隆起约1mm3水肿隆起超过1mm，范围扩大4总分8表表1 皮肤刺激反应评分皮肤刺激反应评分表表2 皮肤刺激强度评价皮肤刺激强度评价刺激反应分值无刺激0-0.4轻度刺激0.5-2.

15、9中度刺激3-5.9强刺激6.0-8.02. 眼刺激试验眼刺激试验一一. .试验目的试验目的 1. 1.眼刺激试验目的；眼刺激试验目的； 2. 2.眼刺激试验方法；眼刺激试验方法； 3. 3.眼刺激试验结果的评价方法。眼刺激试验结果的评价方法。1.1.动物：家兔；动物：家兔；2.2.受试物：受试物：10%10%双氧水溶液双氧水溶液；3.3.剂量：滴入剂量：滴入1 1滴滴；4.4.方法：方法：滴入滴入一侧眼一侧眼结膜囊内结膜囊内，另一侧作为空白对照（滴入，另一侧作为空白对照（滴入等量生理盐水）。给药后使眼睛等量生理盐水）。给药后使眼睛被动闭合被动闭合1min1min。记录给药后。记录给药后5mi

16、n5min、10min10min、15min15min、20min20min时眼的局部反应情况（时眼的局部反应情况（1h1h、12h12h、24h24h、48h48h、72h72h）。）。二、实验材料二、实验材料眼睛部分结构：模式图眼睛部分结构：模式图眼刺激试验-角膜评分刺激反应强度评分无混浊 0极轻微弥漫性混浊，虹膜清晰可见 1轻度混浊（虹膜细微结构不清晰）2混浊（虹膜结构不清，瞳孔大小看不到）3极混浊（虹膜完全看不到）4眼刺激试验虹膜评分 刺激反应强度刺激反应强度 评分评分 正常正常 0皱褶明显加深，充血充血，肿胀肿胀，角膜周围轻度充血，瞳孔对光仍有反应瞳孔对光仍有反应 1出血出血，肉眼可

17、见坏死坏死，对光无反应对光无反应（或出现其中一种反应） 2眼刺激试验结膜评分. 充血（指睑结膜、球结膜部位）充血（指睑结膜、球结膜部位） 评分评分 血管正常血管正常 血管充血呈血管充血呈鲜红色鲜红色 血管充血呈血管充血呈深红色深红色，血管不易分辨，血管不易分辨 弥漫性充血呈弥漫性充血呈紫红色紫红色 . 水肿水肿 无水肿无水肿 轻微水肿轻微水肿（包括瞬膜）（包括瞬膜） 明显水肿，伴有明显水肿，伴有部分眼睑外翻部分眼睑外翻 水肿至水肿至眼睑近半闭合眼睑近半闭合 水肿至水肿至眼睑超半闭合眼睑超半闭合 . 分泌物分泌物 无分泌物无分泌物 少量分泌物少量分泌物 分泌物使分泌物使眼睑和睫毛潮湿眼睑和睫毛潮

18、湿或粘着或粘着 分泌物使整个分泌物使整个眼区潮湿眼区潮湿或粘着或粘着 分值计算方法分值计算方法角膜评分：分值虹膜评分：分值结膜评分：（）分值总分：项评分之和。分值范围（分） 眼刺激性评价标准 刺激程度刺激程度 积积 分分无刺激性无刺激性 5 5轻度刺激性轻度刺激性 轻度刺至中度刺激性 中度刺激性中度刺激性 中度至重度度刺激性 重度刺激性重度刺激性 作业作业撰写试验报告。实验二实验二 特殊毒性试验特殊毒性试验 特殊毒性包括致畸、致癌、致突变作用和生殖毒性。 药物对遗传物质的损伤,被称为“药物的遗传毒性”。若药物影响生殖细胞使形成的配子(精子和卵)的遗传物质发生突变,可能致使发育期间的胎儿发生先天

19、性畸形。突变如发生在体细胞,在个体中可导致肿瘤的形成。药物的致癌性,致畸性,致突变性都是属于药物特殊毒性的研究范围。三者之间关系交错癌变与突变,致癌物与致突变物有着密切的关系。1.1.小鼠骨髓微核试验小鼠骨髓微核试验2.2.药物免疫毒性试验（药物免疫毒性试验（环磷酰胺环磷酰胺对小鼠免疫器官重对小鼠免疫器官重量的影响）量的影响）1. 1. 小鼠骨髓微核试验小鼠骨髓微核试验学习小鼠骨髓微核试验原理及目的学习小鼠骨髓微核试验原理及目的 掌握微核试验的制片方法掌握微核试验的制片方法 掌握微核的观察计数掌握微核的观察计数 掌握微核试验的结果分析评价掌握微核试验的结果分析评价4 41 12 23 3一一.

20、 试验目的试验目的 微核试验（MNT）是检测染色体或有丝分裂期损伤的一种遗传毒性试验方法。无着丝粒的染色体片段或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期仍留在子细胞的胞质内成为微核。 最常用的是啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核试验。以受试物处理啮齿类动物，然后处死，取骨髓，制片、固定、染色，于显微镜下计数PCE中的微核。如果与对照组比较，处理组PCE微核率有统计学意义的增加，并有剂量-反应关系，则可认为该受试物是哺乳动物体细胞的致突变物。二二.实验原理实验原理微微 核（核（micronucleus, 简称MCN） 微核微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时

21、，仍然留在细胞质中的留在细胞质中的染色染色单体单体或或染色体染色体的无着丝粒的无着丝粒片断或环片断或环。最后单独形成一个或几个规则的次核次核，存在于细胞质中，由于比比核小得多故称核小得多故称微核微核。 微核的产生与微核的产生与染色体损伤染色体损伤有关。有关。 也叫卫星核卫星核,是真核类生物细胞中的一种异常结构,是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。微核试验微核试验(Micronucleus test，MNT) 通过试验通过试验观察受试动物是否产生微核的试验。从而判断受试动物是否发生突变突变（测试干扰有丝分裂干扰有丝分裂的物质）。 微核微核可出现在多种细胞中多种细胞中，但在有核细胞 中较难与正

22、常核的分支相区别，由于红细胞在成熟前最后一次分离后数小红细胞在成熟前最后一次分离后数小时可将主核排出，而仍保留微核于时可将主核排出，而仍保留微核于嗜多染红细胞（嗜多染红细胞（PCEPCE）中中，而且在骨髓中骨髓中微核形成达到高峰。因此，通常计数骨髓中骨髓中PCEPCE细胞中的微核数细胞中的微核数作为判断指标判断指标。 PCE（polychromatic erythrocyte）指嗜多染红细胞， NCE（normochromatic erythrocyte）指正染红细胞， RBC（red blood cell）指红细胞，包括PCE和NCE。 PCENCE为评价细胞毒性的指标，代表未成熟红细胞与成

23、熟红细胞的比值。微核试验中计算PCENCE比值时，每只动物应至少计数200个红细胞（即：PCE+NCE200个）。微核试验中未成熟红细胞占总红细胞的比值不应少于对照组的20。三三. 实验器材及试剂实验器材及试剂器材器材 手术刀、手术剪、干净纱布、玻璃染色缸、1ml注射器、6号针头、载玻片、带油镜头显微镜。试剂试剂小牛血清、Giemsa应用液、 二甲苯。实验动物：实验动物：昆明小白鼠四四.试验动物处理试验动物处理1 试验分组试验分组 模型组：用1%1%环磷酰胺环磷酰胺按按0.1ml/10g(100mg/kg)0.1ml/10g(100mg/kg)剂量进行经口染毒两次，间隔24h； 空白对照组：

24、灌服等量生理盐水生理盐水；2、采样制片、采样制片（1 1）骨髓液的制备和涂片）骨髓液的制备和涂片 试验动物用颈椎脱臼颈椎脱臼的方法将其处死处死，剖开后肢取下股骨股骨，擦净血污，剔去肌肉，剪去两端骨骺。用1ml注射器接6号针头吸取约0.05ml小牛血清，冲洗骨髓腔冲洗骨髓腔1-2次，冲洗物用洁净载玻片接着，混合均匀混合均匀后推片，晾干晾干（可用酒精灯短时烘烤加快晾干速度）。 涂片 滴加一滴于载玻片上，再取一张载玻片30匀速滑动（2）固定与染色）固定与染色1 1）. . 固定：固定：将推好晾干的骨髓片用甲醇固定甲醇固定5-5-10min10min取出晾干。2 2）. . 染色：染色：将固定晾干后的

25、涂片、用新鲜配制的GiemsaGiemsa应用液应用液(Giemsa储备液1份加pH6.4的磷酸盐缓冲液9份)染色染色10-15min10-15min，然后冲洗冲洗掉玻片上的染色液，晾干。 3、观察、观察 先在低倍镜下观察，选择分布及染色较好的区域，再在油镜下观察计数。1.嗜多染红细胞(PCEPCE)呈灰蓝色灰蓝色(未成熟红细胞)；2.正染红细胞(NCENCE)呈粉红色粉红色(成熟红细胞)；3.观察PCE细胞中的微核(MNMN)(微核多数呈圆形圆形，边缘光滑光滑整齐整齐，呈紫红色或蓝紫色紫红色或蓝紫色)4、计数、计数1）.计数200200个个RBCRBC(PCE+NCE)得出PCE与NCE的比

26、值 PCE/NCEPCE/NCE比值比值= PCE= PCE个数个数/NCE/NCE个数个数2）.计数10001000个个PCEPCE细胞得出含有微核的PCE细胞个数。 微核率微核率= =（含微核（含微核PCEPCE个数个数/ /计数计数PCEPCE总数）总数）10001000 结果以千分率表示。结果以千分率表示。实验记录实验记录计算各组微核细胞率计算各组微核细胞率结果分析与评价结果分析与评价PCE/NCEPCE/NCE比值：比值：正常的正常的PCE/NCEPCE/NCE比值约为比值约为1 1( (正常范围为正常范围为0.6-0.6-1.21.2) )试验组：如比值试验组：如比值 0.10.1

27、X X0.60.6, ,表示受到表示受到PCEPCE形成受到形成受到不同程度抑制不同程度抑制; ;如比值如比值0.050.05X X0.10.1，则表示，则表示PCEPCE形成形成受到受到严重抑制严重抑制；比值；比值0.050.05，表示受试化学毒物的，表示受试化学毒物的剂量过大剂量过大，试验结果不可靠试验结果不可靠。注意事项注意事项1.做好推片推片和控制好染色时间染色时间是试验成败的关键。2.显微镜在油镜油镜下观察，使用完后需用擦镜纸沾取少量二甲苯进行擦洗二甲苯进行擦洗。2. 免疫毒性试验免疫毒性试验一、实验目的一、实验目的 通过比较染毒动物与正常对照动物胸腺和脾脏的大通过比较染毒动物与正常对照动物胸腺和脾脏的大小和重量差异，学习评价小和重量差异，学习评价 药物对动物免疫器官毒性的药物对动物免疫器官毒性的基本方法。基本方法。 二、基本原理二