细胞工程讲义

1、细胞工程讲义第一章 绪论细胞生物学研究细胞基本生命活动规律的科学，它在不同层次研究细胞结构与功能，细胞增殖、分化、衰老与凋亡，信号传递，真核细胞基因表达与调控，细胞起源与进化等为主要内容。细胞工程就是人们按照自己的愿望，通过各种物理和化学手段改造细胞的结构、调控细胞功能与生理活动过程，以期更好地创造特定功能或用途的细胞、组织器官、新物种或新产品来满足人们的需要。1.1 生物工程（生物技术）生物技术是以生物科学为基础，利用生物个体或生物器官、组织、细胞的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系（包括细胞系），以及与工程原理相结合进行产品加工生产的综合性技术体系 。 生物技术的内涵主要是：

2、 （1）运用现代生物学理论与科学技术改造细胞的遗传物质，培育出人们需要的生物新品种；（2）工业规模地利用现有生物体系，制备生物产品；（3）模拟生物体系，以生物化学工程代替化学工程，制备工业产品； （4）发展相应的科学理论与工程技术。 主要技术范畴包括 ：基因工程；细胞工程；酶工程；发酵工程 ；生化工程 现代生物技术特征：多学科性；商业性；规模化 1.2 细胞工程的概念及研究范畴 细胞工程（cell engineering）是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。广

3、义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术，狭义的细胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术。 动物细胞工程包括： 细胞培养技术（包括组织培养、器官培养）；细胞融合技术；胚胎工程技术 （核移植、胚胎分割等）；克隆技术（单细胞系克隆、器官克隆、个体克隆）。 植物细胞工程包括： 植物组织培养技术；器官培养技术；细胞培养技术；原生质体融合与培养技术；亚细胞水平的操作技术等。1.3细胞工程与其它相关学科的关系 1细胞工程学科的建立依赖于相关学科理论的发展2为生物学研究提供新的实验体系3细胞工程必须与其它生物技术相结合才能更好地发挥作用 1.4 植物细胞工程的发展 植物细胞工程是一门以植物组

4、织和细胞的离体操作为基础的实验性学科。 在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变， 从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个体，或获得有用物质的过程统称为植物细胞工程。 植物细胞工程是在植物组织培养的基础上发展起来的，因此，植物细胞工程亦是广义概念上的植物组织培养。 一探索阶段 在这一阶段中，细胞学说的产生和细胞全能性学说的提出为组织培养技术的产生奠定了理论基础。在这些理论的指导下所开展的有关试验，对组织培养技术的建立进行了有益的探索。Schleiden和Schwann分别于1838年和1839年提出“细胞学说”（cell theory）。Sch

5、wann在1839年更明确的指出：“如果具有与有机体内一样的条件时，每个细胞应该可以独立生活和发展”。德国著名植物学家G. Haberlandt在细胞学说的基础上于1902年提出“细胞全能性学说”。他认为，高等植物的组织、器官可以不断分割，直到单个细胞。如果每个细胞都有植物个体一样的性质和能力，那么，可以通过植物细胞培养使单个细胞发育成为一个新个体。 二培养技术建立阶段 作为一门技术，它必须具有一定的程序性。也就是说，它应该具有一定的技术模式。 在这一阶段，植物组织培养建立了两个与培养技术有关的重要模式，一是培养基模式，二是激素调控模式。 3 应用研究阶段 1. 组织培养领域的研究迅速在世界各

6、国的有关实验室广泛展开。2. 技术体系更加完善。这一阶段的技术体系包括：根据不同的培养目的外植体的取材和灭菌方法，不同外植体及其培养产物的培养程序，适合于不同植物种类和外植体类型的培养基等。3. 形成了较为完整的理论体系。在植物组织培养研究的基础上，植物细胞工程现已形成了以细胞全能性为基本理论基础，以细胞脱分化和再分化调控为中心的理论体系。4.研究目的性更加明确，并已广泛应用到生物科学研究的各个领域，以细胞工程为基础的新型生物技术产业正在兴起。 四植物细胞工程应用 育种上 ：将常规技术与植物组培技术相结合，可获得常规技术难以或无法获得的种质材料，缩短育种周期，提高育种效率。 快速获得特殊倍性材

7、料；克服远缘杂交不亲和；克服杂种胚早期夭折；导入外源基因；突变体筛选；种质资源保存；细胞培养生产有用次生产物；在细胞生物学和发育生物学研究中的应用；在植物遗传、生理生化以及植物病理等基础研究中的应用。1.5 动物物细胞工程的发展 一融合现象的发现 19世纪30年代，Muller, Schwann, Virchow等相继在肺结核、天花、水痘、麻疹等病理组织中观察到多核细胞现象，但当时并没有引起人们关注，认为这只是一种特殊现象。 1849年Lobing在骨髓中也发现了多核现象，1855年1858年，科学家们在肺组织和各种正常组织及发尖和坏死部位都发现了多核细胞。至此，自然界中广泛存在着多核细胞的事

8、实，才被生命科学工作者接受。1859年，A. Barli在研究黏虫生活史时发现，某些黏虫存在着由单个细胞核融合形成多核的原生质团的情况。据此，他认为多核细胞是由单个细胞彼此融合而形成的。 二. 动物组织细胞培养技术的建立 1907年，美国胚胎学家R. Harrison将蛙的胚神经管区的一片组织移植到蛙的淋巴液凝块中，这片组织在体外不但存活了若干星期，而且还从细胞中长出了轴突(神经纤维)细胞，解决了当时关于轴突起源的争论，并表明了利用体外存活的组织进行实验研究的可能性。他所采用的把培养物放在盖玻片上并置于凹玻片腔中培养的方法还一直沿用至今。 Carrel (1911)发现了鸡胚浸出液对于某些细胞

9、的生长具有很强的促进效应，还把无菌技术引到了组织培养技术中。作为他的技术标志是，他在不含抗菌素的培养条件下使鸡胚心脏细胞维持生存了34年，先后继代3400次，证明动物细胞有可能在体外无限地生长。1914年，Thomson创立了另一条完全不同的体外组织培养途径器官培养法，以后又被Strangeways和Fell所发展。1940年，Eadrle建立了可以无限传代的一个C3H小鼠的结缔组织细胞系L系。二是1951年，Gay建立了第一个人体细胞系人体宫颈癌Hela细胞系。三. 细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生 1958年, Okada发现紫外灭活的仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。由于仙台病毒

10、能稳定地诱发细胞融合而引起了许多科学家的兴趣。 60年代，Harris(1965)诱导不同的动物体细胞融合获得成功并能存活下来。Lifflefield(1964)根据亲本细胞的酶缺陷型，利用HAT选择性培养基能使亲本细胞死亡而只留下异型融合细胞，并能不断地增殖，从此形成了细胞融合到杂种细胞选择、培养的一整套技术。这一技术在此后广泛地应用于遗传学、病毒学、免疫学、细胞学等多种学科的研究工作中 1975年，免疫学家Kohler和Milstein利用仙台病毒诱导绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，选择到能分泌单一抗体的杂种细胞。该杂种细胞具有在小鼠体内和体外培养条件下大量繁殖的能力，并能

11、长期地分泌单克隆抗体，从而建立了小鼠淋巴细胞杂交瘤技术。这一技术的诞生把细胞融合技术从实验阶段推向了应用研究阶段，促进了动物细胞工程的蓬勃发展。 四. 动物克隆技术的建立 1891，Heape等人首次报道了家兔胚胎移植成功的结果，他们把安哥拉家兔胚胎移植给比利时兔，得到了4只安哥拉家兔。30年代以后，先后在羊、猪、牛等动物的胚胎移植上获得成功。经过几十年的不断完善和充实，已成为一项比较成熟的繁殖生物学技术。 首例克隆动物成功的报道1962年，英国学者Grudon把非洲爪蟾小肠上皮细胞的核注入同种或异种非洲爪蟾未受精卵(经紫外线照射杀死卵细胞核)中，约有1的重组卵发育成为成熟蛙。这一成功开创了由

12、体细胞培育动物个体的新型实验途径，其贡献在于：实验证明了完全分化的肠细胞仍然具有未分化细胞的全部遗传信息，并能在一定的条件下发育成动物个体，从而证明了动物细胞仍然具有全能性；初步建立了体细胞核移植的实验体系，证明在体细胞核转至胚胎发育方向的早期，卵细胞质对体细胞核的发育功能起着关键性的调节作用，其作用因子可能是细胞质中的mRNA与有关的蛋白质。 克隆羊的诞生1997年2月，英国科学家Wilmut等在世界权威杂志Nature上首例报道了世界第一只克隆羊的诞生。它的贡献在于：实验证明了哺乳动物高度分化的细胞同样含有全套遗传信息，亦能在一定条件下发育成动物个体，进一步证明了动物细胞的全能性。 多利诞

13、生的技术路线： 取6岁供体羊乳腺细胞 血清饥饿培养使细胞处于G0期；经GnRH处理取卵细胞 移去卵细胞的细胞核；将培养的乳腺细胞的核移植到去核的卵细胞中；重组细胞植入第一受体羊输卵管中培养至胚泡期(桑椹胚）；桑椹胚再移植入第二受体羊子宫内发育至分娩。1.6 细胞工程的主要研究内容 细胞工程涉及的领域相当广泛，根据研究对象不同，可以将细胞工程分为微生物细胞工程、植物细胞工程和动物细胞工程三大类。一、动植物细胞与组织培养动植物细胞与组织培养可分为三个层次上的培养：细胞培养、组织培养和器官培养。植物细胞的大规模培养要早于动物细胞。动物细胞培养技术可用于制取许多有应用价值的细胞产品，如多种单克隆抗体、

14、疫苗、生长因子等。二、细胞融合采用自然或人工的方法使两个或几个不同细胞(或原生质体)融合为个细胞。用于产生新的物种或品系(植物上用得多，动物上用得少)及产生单克隆抗体。细胞融合最大的贡献是在动植物、微生物新品种的培育力面。三、染色体工程染色体工程是按人们的需要来添加、削减或替换生物的染色体的一种技术。染色体工程技术最大的价值体现在新品种的培育，主要是单倍体与多倍体育种方面。四、胚胎工程这项技术主要是对哺乳动物的胚胎进行某种人为的工程技术操作，获得人们所需要的成体动物。胚胎工程采用的新技术包括胚胎分割技术、胚胎融合技术、卵核移植技术、体外受精技术、胚胎培养、胚胎移植以及性别鉴定技术、胚胎冷冻技术

15、等。五、细胞遗传工程主要包括克隆和转基因技术。前者主要是指无性繁殖。后者是指将外源基因整合到生物体内，得到稳定表达，并使该基因能稳定地遗传给后代的实验技术。1.7 细胞工程的重要应用优质植物快速培育与繁殖；动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种；利用动植物细胞培养生产活性产物、药品；新型功植物品种的培育；供医学器官修复或移植的组织工程；转基因动植物的生物反应器工程；珍稀动植物资源的保存与保护；在遗传学、发育学等领域的理论研究；在能源、环境保护等领域的应用第二章 细胞工程基础2.1 细胞生物学基础2.1.1 有丝分裂2.1.2 减数分裂减数分裂和染色体知识与植物育种染色体联会相关知识：染色体；同源染

16、色体；染色单体；姊妹染色体；非姊妹染色体；染色体联会和交换染色体联会：偶线期又称为配对期(Pairing stage)。配对过程是专一性的，仅发生于同源染色体之间，非同源染色体之间不进行配对。配对以后，两条同源染色体紧密结合在一起所形成的复合结构，称为二价体(bivalent),有4条染色单体，因而又称为四分体(tetrad)。同源染色体配对的过程称为联会(synapsis)2.2 植物育种知识2.2.1 有性杂交培育新品种最传统的育种方法。自然界存在的一种特殊的细胞融合方式。生物基因通过花粉细胞在不同个体（品种）间进行传递。单基因性状和隐性性状比较容易转移和培育。实例：培育黄色番茄，选择好的

17、红色加工番茄品种，选择好的黄色鲜食番茄品种，人工受粉杂交，F1中间，F2分离群体选黄色单株，去雄操作，授粉，杂交后代F1，F2代以后选择目标性状2.2.2诱变育种人工诱发突变，即用辐射或化学诱变剂等手段改变遗传形状，诱导所新品种的产生。2.2.3多倍体育种采用多倍体诱导等染色体工程技术。利用多倍体的器官巨大性的特点。利用多倍体的抗逆性强的特点。利用奇数多倍体的不能繁殖后代的特点。最有代表性的品种是无籽西瓜。2.2.4转基因育种通过转基因技术转入外源基因在体内表达，制造新物种。最大特点是打破物种界限。对于无法通过性细胞传递的基因最为有效。目前限于单基因或少数基因。对于基因表达直接产物就是性状表现

18、的基因最为有效。第3章 植物组织培养与细胞培养 3.1植物细胞的细胞全能性学说植物的细胞具有发育为胚胎和植株的潜在能力。植物组织培养的大量实践证实了植物细胞全能性学说，但是也告诉我们，并不是植物体内的每一个细胞都具有全能性。只有那些胚性细胞或分化程度不高的细胞才可具备发育为胚胎或植抹的全能性。植物胚性细胞(embryogenic cells或embryonic cells)被子植物的合子是胚性细胞，植物的早期胚胎细胞也属于胚性细胞。植物的分生组织细胞也是一种胚性细胞或胚胎干细胞。有些植物的成熟器官和组织中也保留着一些胚性细胞。植物学家早就发现，在自然条件下，植物体内的许多细胞可以不断地产生不定

19、胚或芽，表明他们保留着胚性。在自然界表现出胚性的细胞可以分为三大类，即早期胚胎细胞、茎端分生细胞和成熟组织中遗留的胚性细胞。1.合子和早期胚胎细胞合子发育为胚胎，因此合子是真正意义上的胚性细胞。胚胎发育到一定阶段只有两端各有一团细胞保持着分生状态，后来发育成为茎端和根端分生组织。顶端分生组织来源于胚胎。2.茎端分生细胞植物的连续的器官分化是由顶端分生组织来完成的。顶端分生组织是植物胚胎胚芽和胚根顶端的分生细胞团，分别称之为茎端分生组织和根端分生组织。茎端分生组织包含全能性细胞，它们相当于动物的胚胎干细胞(embryonic stem cells)3.植物成熟物器官中遗留的胚性细胞在植物的组织和

20、器官中也保留少数未分化或分化程度不高的细胞，它们可以在自然条件下形成不定胚(adventitious embryo)或不定芽(adventitious bud)，进行无性繁殖。我们把这些能够产生不定胚或不定芽的体细胞定义为遗留的胚性细胞。愈伤组织是植物外植体组织增生的细胞形成的细胞团结构。其细胞结构、大小、形状、液泡化程度等、胞质含量、细胞壁透性等有很大差异。还没有形成组织上的结构，没有明显的器官分化。、脱分化与再分化在离体培养的条件下，一个分化的细胞转变为分生状态，形成胚性细胞团或愈伤组织的现象称作脱分化(dedifferentiation)。一个己分化细胞若要表现其全能性，形成完整植株，首

21、先要经历脱分化过程，然后冉经历再分化(redtfferentiation)过程。3.2植物组织培养的基本条件和操作实验室一、培养基制备实验室1洗涤间 根据工作量的大小决定培养间的大小，面积在40一60m3之间。在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽，用来清洗玻璃器皿。2培养基配制间 面积60平方米左右，中央实验台两端配制水槽，试验台中缝处安置长形药品架。3消毒间 在没有上述条件的地方，可将上述工作合并在一个房间内完成，但设备的安装和排列要合理，房间要宽敞、明亮、通风。二、无菌操作室无菌操作室又叫接种室，主要用于实验材料的接种操作。所以通常由里外两间组成。里间为接种间，接种间的面积按照工作量的大小来决

22、定。外间是缓冲问，用于准备工作，还有防止污染的作用。缓冲间的门应该与接种室的门隔开，两个门也不要同时开启，以保证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌。三、培养室培养室是培养试验材料的主要场所。一般需要两间培养室，一间为光照培养室，另一间是暗培养室，因为有些培养过程需要在暗中进行。为了控制培养室的温度和光照时间及其强度，培养室的房间不要窗户，若原来有窗户的房间应将窗户封闭。要有控制温度和通气的条件。培养室门外应有一预备间或走廊。4、 主要设备（一）培养基制备实验室1洗涤间洗瓶机。洗液缸。超声波清洗机。此外还应配置晾干玻璃器皿的器皿架、烘箱以及存放干净玻璃器皿的柜子等。需要配备一台电热烘箱，主要用于烘

23、烤急需迅速干燥的工具或玻璃器皿，温度带控制。2培养基配制间配备的主要仪器设备有冰箱、天平、pH计(酸度测定仪）等。电冰箱以体188-220升为宜。3消毒间实验台；电热炉；灭菌锅(消毒锅)；排风；灭火设备（二）无菌操作室超净工作台/接种箱；紫外灯、酒精灯；小型离心机主要用于分离和收集液体培养中的细胞、单花粉及原生质体等，也可用来筛选处于不同发育阶段的胚状体。一些常用的解剖和接种工具（三）培养室设备控温仪；去湿机；培养架；培养箱；摇床、转床；灯光控制设备；加温设备和空调（四）显微镜观察设备实体显微镜/解剖镜；透射显微镜；倒置显微镜；血球计数板；显微照相设备植物组织培养的基本操作1、 玻璃器皿的清洗

24、（带有石蜡或凡士林要特殊处理擦拭加热热水煮刷洗烘干）二、培养基的配制1.培养基母液的配制大量元素母液10倍浓度；易发生沉淀的分为A液、B液配制后分装；微量元素母液1000倍浓度配制；铁盐母液的配制 EDTA+FeSO4；维生素母液的配制，一般为1mg/ml浓度；固定培养基可以混合配制有机营养母液；植物激素母液的配制，每种激素单独称量。溶解方法一定要注意：生长素类用碱溶液先溶解（NaOH或KOH）后稀释；细胞分裂素类先用盐酸（HCl）溶解后稀释；赤霉素要用酒精溶解后稀；ABA先用少量丙酮溶解后用水稀释2.培养基制作按计划配制量计算出需要母液的量；吸取各无机母液；加入琼脂；加热溶解；加入维生素和有

25、机母液；加入糖；调节PH；分装灭菌培养基的组成无机营养大量元素：N、P、K、S、Ca、Mg微量元素：Fe、Mn、Cu等有机营养碳源：蔗糖、葡萄糖、果糖氮源：氨基酸类、酰胺类活性物质：烟酸、肌醇、生物素等植物激素生长素类：IAA、NAA、IBA等细胞分裂素类：激动素、玉米素等其它类：赤霉素、脱落酸、乙烯 附加物类琼脂、椰乳、水解蛋白等 3.器械消毒高压灭菌：器械，器皿；酒精消毒：台面，工具；火焰灭菌：金属器械；干热灭菌：不能使用高压灭菌器械，器皿（160-180度三小时）；紫外线消毒：房间和超净工作台4.外植体消毒酒精；漂白粉；次氯酸钠；过氧化氢；氯化汞(升汞)；高锰酸钾；表面活性剂/抽气泵3.

26、3 植物组织培养的主要内容植物胚培养；植物子房和合子培养；花粉培养和单倍体育种；原生质体培养；细胞融合和体细胞杂交；体细胞发生和人工种子；植物快速繁殖的途径与技术； 植物组织培养是指在无菌条件下，将离体的植物器官(如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等)、组织(如花药组织、胚乳、皮层等)、细胞(体细胞、生殖细胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生质体等培养在人工配制的培养基上、给与适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽、或者长成新的完整植株的一种实验技术。3.3.1 植物胚培养3.3.1.1胚胎培养一、 双受精(double fertilization)即进入胚囊的花粉管中的两个精子，

27、一个与卵细胞结合形成合子，另一个与中央细胞的两个极核结合形成初生胚乳核。合子进一步发育形成胚胎，而初生胚乳核发育为胚乳组织，为胚胎提供营养，并在种子成熟过程中或种子萌发过程中逐渐解体和消亡。2. 胚胎培养的意义1. 拯救杂种胚获得稀有杂种在种间杂交和属间杂交时，杂种的合子和胚乳核均包含两个遗传结构不同的基因组。在形成胚和胚乳的过程中，两个基因组的表达不协调，导致杂种胚乳和胚发育不正常，不能形成有萌发能力的种子。在多数情况下是杂种胚乳最先败育，而胚仍然是健康的，此时进行离体胚培养，可以将杂种幼胚培养成植株，称为胚胎拯救(embryo rescue)。无融合生殖是无性胚或无性种子的生殖，是不经过雌

28、、雄性细胞融合直接由营养体细胞或未进行减数分裂的大孢子母细胞发育成的无性胚或无性种子，这种无性胚或无性种子具有保持杂合性的特点，因而能够固定其杂种遗传优势。用无融合生殖的方法固定农作物品种间、亚种间、种间杂种优势的育种方法，是育种的一个新途径。用无融合生殖方法固定水稻杂种优势，选育不要年年制种又可多代利用的杂交水稻品种，对解决人口增长与粮食生产之间的矛盾有重要意义。 2单倍体的产生在栽培大麦×球茎大麦和小麦×玉米的杂交中，受精作用不难完成，但在胚胎发生的最初几次分裂期间，父本的染色体被排除，结果形成了单倍体的大麦或小麦胚、但是受精后2-5d胚乳逐渐解体，单倍体胚生长相当缓慢

29、，因此为了得到单倍体植株，必须把胚剥离出来进行培养。未受精的卵细胞培养也是获得单倍体的途径之一。3缩短育种周期许多植物的种子具有体眠或后熟的特性，从母体脱落后不能立即萌发。观赏植物鸢尾的种子播种在土壤中需要休眠一年多的时间，如进行胚胎培养，就可打破休眠使胚胎立即萌发。垂枝山查子(苹果属)的种子种在土中需要9个月才能萌发，而离体胚培养48hr开始萌发，4周之内就能形成适于移栽的幼苗，5个月之后幼苗长1米。4稀有植物的繁殖Musa balbisiana是香蕉的近缘野生种，其种子在自然条件下不能萌发，然而通过离体胚的培养很容易产生幼苗。有些椰子果实发育异常，不能形成液体胚乳，但是产生一种柔软肥厚的组

30、织。这种果实叫做 “Makapuno”，椰子的种子在自然界不能萌发，使用离体胚培养产生幼苗。三. 胚胎培养的方法根据取时间将胚胎培养分为成熟胚培养与幼胚培养。成熟胚培养是指已经基本完成发育的胚胎为材料进行培养。幼胚培养是指将还未成熟的幼小胚胎作为材料进行培养。1. 成熟胚培养成熟胚已经储备了能够满足自身萌发和生长的养料，因此在简单的培养基上就可以培养。近年来成熟胚培养常采用Nitsch(1951年)和MS(1962年)培养基。含有机成分，更容易成功。将成熟的种子用70%酒精进行表面消毒几秒到几十秒钟(取决于种子的成熟度与种皮的厚薄)，再故到漂白粉饱和水溶液或0.1的氯化汞水溶液中，消毒515m

31、in，然后用无菌水冲洗3次。在超净工作台小解剖镜下解剖种子，取出胚种植在培养基上，在常规条件下培养即可。2. 幼胚培养幼胚在胚珠中需要从母体和胚乳中吸收各类营养物质与生物活性物质，因此，进行幼胚培养时，必须通过培养基向它提供足够的营养物，并提供适宜的培养条件。影响幼胚培养的因素很多，主要有：胚胎发育的时期、培养基、培养条件、胚乳看护、防止幼胚提前萌发等。（1） 影响幼胚培养的因素胚胎发育的时期：一般说来，胚胎的年龄越小越难培养。因此，在进行胚胎培养时一定要选择适当发育时期的胚胎进行培养，才能取得成功。被子植物中双子叶植物和单子叶植物的胚胎在形态和发育的进程不同。适合培养的取材时期也有一定差异。

32、培养基现代常用的基本培养基，如Nitsch(195l年)、MS和大量元素减半的MS培养基被用于各类植物的幼胚培养，而禾谷类的幼胚培养有时也采用N6和B5培养基。培养基中的蔗糖具有提供碳源和调节渗透压的双重作用。一些植物的实验证明，幼胚培养的蔗糖浓度要高于成熟胚培养。培养基的有机附加物，维生素Bl和生物素对胚胎培养有重要作用。添加氨基酸对不同植物和不同时期的幼胚效果不同。幼胚培养一般不需要在培养基中添加外源激素，但是有研究表明低浓度的生长素赤霉素或激动素对某些植物的幼胚生长是有好处的。一些天然提取物也被用于胚胎培养。培养条件胚胎培养一般在26左右的培养室或培养箱中进行，也可在20-30的普通室温

33、下进行。接种后的幼胚一般在弱光或黑暗条件下培养，待幼苗形成后将试管转入较强的光照条件下培养。胚乳看护培养尽管人工培养基已经有了不少改进，但培养极早期的胚仍有很大困难。胚乳看护培养在一定程度上有助于早期胚胎的成活与发育。在进行大麦未成熟胚(300一1100 um长)离体培养的时候，如果在其周围培养基上存在着来自同一物种另一种子的离体胚乳，对胚的生长会有明显的促进作用。防止幼胚提前萌发未成熟胚在培养基上往往不能发育为成熟胚，而是提前生长为瘦弱和畸形的幼苗，他把这种现象称为胚的“提前萌发” （Precocious germination）。这是幼胚培养中至今仍未完全解决的问题。抑制幼胚提前萌发的因素

34、有：提高培养基中蔗糖的浓度(高于10%)，加入ABA,酪蛋白水解物，高温，强光条件下培养等。3.3.1.2胚乳培养和三倍体的产生在许多植物上已经通过胚乳培养获得再生植株，有些获得了移栽成活的三倍体植株。在大多数情况下首先需要诱导胚乳细胞增生愈伤组织，然后再诱导愈伤组织分化器官或胚状体。只有个别报道由培养的胚乳直接产生胚。一、胚乳的发育时期许多双子叶植物成熟胚乳可以进行培养。实验证明胚胎或种子的存在对培养有促进作用。禾谷类成熟的胚乳都不适于培养，只有较幼嫩的胚乳才能增殖愈伤组织，各种植物最适合进行培养的胚乳的发育阶段略有不同：黑麦草9-10d，玉米8-11d，小麦和大麦8d，水稻4-7d。黄瓜也

35、表现类似的行为，只有在授粉后7-10d别离下来的胚到才能增殖愈伤组织。二、培养基和培养条件植物激素、有机添加物、植物提取也等对培养胚乳有促进作用。主要有IAA，GA，2、4-D，激动素和酵母提取物。一些天然的植物提取液对培养胚乳有促进作用，如番茄汁、葡萄汁、青玉米汁、酵母提取物或牛奶等。pH因物种不同而异。报道最多数是在25左右。不同植物光照要求不同。三、胚乳愈伤组织和再生植株的染色体数目在植物体内胚乳细胞常常出现高度的多倍化和各种不规则的有丝分裂现象，如染色体桥和落后染色体等，在培养的胚乳细胞中自然也存在上述异常现象。但在某些植物胚乳培养中发现，染色体可以长期保持3n而不发生变化。如桑寄生科

36、的印度五蕊寄生、怒江钝果寄生和楔叶钝果寄生，檀香、柚和苹果等。四、三倍体植物在经济上的价值由于三倍体植株的种子在早期就发生败育，可以利用三倍体植株来生产无子果实，例如无籽的西瓜、香蕉、葡萄。三倍体比二倍体植物高大，生长速度快，生物量高，这在以营养体作为产品的植物上具有重要价值。例如甜菜、桑树和茶的优良品种常常是三倍体。三倍体植物的品质有时优于二倍体。3.3.2 植物子房和合子培养传粉后子房的培养的目的在于研究果实发育的营养需求和激素调控。未传粉子房培养的目的之一是诱导卵细胞或其他的胚囊分子产生单倍体植株。将胚珠从子房中剥离出来进行培养，然后将花粉授在胚珠的珠孔端，也可以实现双受精，获得健康的种

37、子。这种方法在远缘杂交上经常使用，可以避免花粉和柱头之间的不亲和性。自然受精形成的合子的分离和培养成株是由Ho1m等(1994年)首先实现的。离体受精与合子培养的成功是近年来实验胚胎学和细胞生物学的重要进展，它不仅为研究受精作用和胚胎发生的分子机理提供了新的实验系统，而且也为基因工程提供了一种新的受体系统。有可能摆脱其他组织培养再生系统受基因型限制的缺陷。避免外源质粒中所含有可能对人类或生态系统有危害的选择基因和报告基因。 3.3.3 植物花药和花粉培养3.3.3.1 基础知识什么是花药？雄蕊花丝顶端膨大呈囊状的部分。由2个或4个花粉囊（小孢子囊）组成，分为二半，中间以药隔相连。花粉囊中产生花

38、粉，花粉粒成熟后，花粉囊自行裂开，花粉粒由裂口处散出。花药在花丝上着生的方式有几种类型。有的花药的基底着生于花丝顶端，叫底着花药；有的花药以背面中部着生于花丝的顶端，叫丁字型花药。 3.3.3.2 基本概念花药培养其外植体是植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的范畴。花粉培养的精确定义是：将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来，再加以离体培养。有时花粉培养也称为小孢子培养(microspore culture)。从培养方法和技术方面来讲，它属于细胞培养的范畴。3.3.3.3 花药和花粉培养的意义迅速获得纯合型材料，缩短育种年限；与诱变育种相结合可以提高诱变频率；作为遗

39、传工程受体更为有效；获得育种中间材料；与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义；用作基础遗传研究的各个领域3.3.3.4花药培养的成果与基本程序一、花药培养的发展首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是印度学者Guha和Maheshwari (1964, 1966)。目前已有250多种植物花药培养成功。目前，花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育种中广泛应用。我国学者首先获得成功培养的植物二、花药培养的基本程序（1）外植体选择；（2）外植体(花蕾)预处理；（3）外植体消毒；（4）剥取花药；（5）接种；（6）诱导培养；（7）分化培养；（8）染色体鉴定三

40、、花药培养的基本方法和影响因素1外植体的选择：供试材料的遗传背景；供试材料的生理状态；花粉的发育时期（四分体 小孢子 单核花粉 双核花粉）；最适期选择；2、花药预处理大量试验结果表明，花药培养前给予一定的低温处理是十分必要的。烟草、茄子 35 72小时；水稻 10 1014天；柑橘 3 510天；马铃薯 4 48小时。低温处理的作用：可以激发花粉母细胞产生两个相等核，而不是一个营养核一个生殖核；保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞组织的衰老；激发花粉产生原胚；促使细胞同步分裂。其他预处理方法：离心预处理；高温预处理；乙烯利预处理；甘露醇预处理。3培养基（1）培养基花药培养常用的基本培养基：

41、MS（Murashigc & Skoog，1962）； Nitsch(Nitsch，1969)；N6(朱至清，1974)；B5(Gamborg et al.，1976)。* C17培养基(王培等，1986年)和w14培养基（2）附加成分：蔗糖；激素。不同蔗糖浓度的诱导频率番茄花药培养对蔗糖浓度的诱导反应蔗糖浓度 2 3 4 6 10 13 17诱导频率 5 10 12 18 25 45 8花药培养常用的激素有：细胞分裂素类：BA 6-benzyladenine ；KT kinetin ；Zeatin 。生长素类：NAA naphthalene acetic acid；I A A ind

42、ole-3-acetic acid；2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid。4.培养条件温度和光照温度：不同植物对温度的要求不同。如：橘在20以下，完全不能形成胚状体，且愈伤组织形成亦很少，当将温度提高到2125时便会有胚状体形成，而当温度提高到26以上时又完全不能形成胚状体。油菜若将接种后的花药在30条件下培养23天，可显著提高花粉胚的形成率，小麦在33条件下培养35天，可提高成愈率和绿苗率。光照：先弱后强。 5花药培养中单倍体形成的途径根据Sunderland,、Wicks和Norreel的研究，可以把早期的花粉发育分为三类：(1)单核正常分裂成一个生殖核

43、、一个营养核。以后或一个生殖核发育，或一个营养核发育，或二者均等发育。(2)单核均等分裂为两个子细胞，以后不断发育。(3)异常多核花粉粒发育 Nitsch(1970)在南洋金花中观察到4核花粉发育成胚状体；Nemec在风信子中发现，有些小孢子核连续分裂3次，形成类似8核胚囊的现象，称为花粉胚囊。单倍体植株形成途径：通过胚状体形成单倍体植株； 通过愈伤组织形成植株；四、花粉及小孢子培养1取材时期的确定* 四分体单核早期单核晚期双核早期双核晚期三核期2花粉或小孢子的分离挤压法；散落法；器械法3培养方法花药看护培养；花粉悬浮培养；双层培养3.4 植物原生质培养原生质体培养的概况 一、原生质体的概念在

44、植物细胞中，除细胞壁以外的成分，或是说一个被质膜所包围的裸露细胞,称为原生质体。亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体(miniprotoplast)。 胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。二、原生质体研究进展 据统计，目前已有49个科，146个属的320多种植物经原生质体培养得到了再生植株（1993）。其趋势仍以农作物和经济作物为主，

45、但从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。 三、原生质体研究的意义 提供相关生理生化研究(如细胞壁的生物合成、质膜的结构与功能、物质运输、能量转换、信息传递、细胞识别、细胞间相互关系与激素作用等)的材料。利用原生质体可以摄取诸如病毒、细菌、细胞器、蛋白质、核酸等外源物质的特点而被用作研究基因调控和表达、遗传工程研究的材料。进行原生质体融合，改变遗传物质，建立杂交品种；同时还可以用于研究染色体行为、基因定位等。用于细胞器的分离，或进行有关细胞器的遗传实验。3.4.2原生质体的制备 1.用于分离原生质体的材料准备无菌试管苗叶片；豌豆黑暗中至少放30h，从叶片获得的原生质体更有活力；将

46、叶片置于日光或灯光下28h使叶片萎蔫有利于撕除下表皮和原生质体的分离；叶片预培养；去掉下表皮在诱导愈伤组织的培养基上预培养7d，然后用酶液脱壁，原生质体的分裂频率比未处理的高得多；上胚轴和子叶；适于某些双子叶植物的原生质体培养；培养细胞；单子叶和大多数双子叶植物由胚性悬浮细胞系或胚性愈伤组织游离的原生质体更易获得持续的细胞分裂和植株再生2.酶处理（1）酶溶液的配制：通常加入葡萄糖、甘露醇或山梨醇等渗透压调节剂来调节酶液的渗透压；一般为0.35-0.8mol/L，随植物材料的不同而异；KH2PO4(0.75mmol/L)和葡聚糖硫酸钾(0.2%-0.5%)，它们可以提高原生质体膜的稳定性；少量A

47、gNO3减少酶解时产生的乙烯；MES(吗琳乙基磺酸)作为pH缓冲调节剂对于保持酶解物的酸碱环境起缓冲作用；pH值最适范围为5.45.8；（2）保温酶解处理将经过或不经过须处理的材料放入装有酶液的培养皿中，材料和酶液的体积比大约为1：10。酶解所需时间：子叶、幼叶和下胚轴等一般需要几小时，愈伤组织十几小时。酶解温度控制在2530。应当放在黑暗或弱光条件下静置条件下隔段时间用手轻轻摇动，50 rmin的摇床上轻轻振荡来游离原生质体3.原生质体的收集和纯化 过滤离心法：用40-100nm的网筛过滤细胞液，低速离心使原生质体下沉飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll 沉淀法：常用甘露

48、醇作为渗透压调节剂，先将酶液洗出干净，再用Percoll飘浮一次沉降法和漂浮法结合4.原生质体活力检测（1）原生质体鉴定：低渗爆破法荧光染色法（2）原生质体活力测定：目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。 FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。 伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏使，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。 5.影响原生质体活力的因素（1）分离材料的生理状态（2

49、）酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压（3）分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间（4）环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响 原生质体的制备的一般程序3.4.3原生质体培养 3.4.3.1培养基 （1） 渗透压：常用的渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗 。（2） 无机盐：大量元素浓度；NO3和NH4+的比例；Ca2+浓度（3） 有机成分：维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白（4） 激素：常用的激素：NAA、IAA、BA与2,4-D（5） pH值 3.4.3.2原生质体培养方法 一

50、、液体培养液体培养又可以分为液体浅层培养和液体悬滴培养两种前者类似于单细胞的液体培养，后者是在培养皿的盖子下制成原生质体小滴，在皿底内加少量培养液保持湿度，然后将皿盖盖上皿底后，用胶布密封放进一大的培养皿内培养二、固体培养三、液体固体双层培养四、琼脂糖珠培养五、看护培养（滋养培养） 3.4.3.3愈伤组织形成和植株再生1、 过程细胞分裂与细胞壁再生；愈伤组织形成 ；愈伤组织分化；植株再生 二、影响原生质体培养的主要因素 1.基因型较早的试验曾证明矮牵牛叶肉原生质体的不同生长发育时期是受不同基因所控制的。通过番茄与秘鲁番茄有性杂交后对性状分离的遗传分析，证明其愈伤组织的再生能力是2个显性基因所决

51、定的(Koornneef M et al.,1987)。ChengVeilleux(1991)对芙薯(S. Phureja)原生质体的培养能力也做过遗传分析，并证明从原生质体培养到形成愈伤组织是受2个独立位点的显性基因所控制(Cheng et al., 1991)。 Dudits等（1991）用苜宿(Medicago sativa)不同基因型做了较深入的研究，认为有某个基因型在离体培养时难以形成细胞胚。但是，如果将对激素调节有作用的发根农杆菌的rolB和rolC基因引入并表达，就可能促使其体细胞胚形成。 2.原生质体的来源 供体材料体类型；供体细胞的分化程度；供体细胞的生长同步性 3.起始培养

52、密度与培养基 基本起始密度；培养基激素水平；密度与培养基营养成分完全性 4.原生质体培养中的一些生理问题 （1）逆境反应细胞壁降解酶是一种逆境诱导剂，因此可以产生活化氧引起脂类过氧化，减少细胞流度同时伴随着细胞膜的渗漏(Ishii H.,1988)。 细胞的逆境反应一般是快速地产生涉及诱发不同代谢途径（例如苯基丙烷途径 phenyl-propanoid route）的酶系统，结果形成了植物抗毒素(phyto-alexins)和如木质素一类的结构多聚物。有些逆境反应对原生质体制备和培养是不利的，例如在甜菜原生质体制备时由于某些酶的活性增强使得形成类脂过氧化物(lipid peroxides)，结

53、果引起原生质膜的氧化损伤。而对马铃薯原生质体活力的损伤乃是由于乙烯产生所致(Perl Aet al.,1991)。 （2）修复机理原生质体分离时会丢失一些不同的细胞结构。使原生质体中细胞骨架的组分、结构、方向发生变化，最常见的是引起细胞极性的改变(Simmond D H., 1991)，同时也会干扰质膜的蛋白质系统。 原生质体修复其质膜及其中的蛋白质组分的能力，细胞壁再生的能力及细胞骨架的修复修复和调整能力都对它们能否进一步发育有很大影响。 （3）细胞脱分化与细胞分裂 分离的原生质体原来的细胞状态常常会影响脱分化的进行。细胞在培养初期的一些变化，如液泡消失、细胞体积增加、细胞质变浓，核蛋白体增

54、加等，与此同时DNA开始复制，随后染色质变浓，原生质体脱分化成为类似分生组织状态的细胞。 原生质体培养初期的细胞分裂至少涉及到以下多个因子：细胞壁的再生、细胞骨架的修复与调整、原生质体分离时细胞所处的周期（G2期细胞具有较高的分裂频率）。另外，细胞壁的再生与DNA的合成协调与否也会影响细胞分裂。 3.4.3.4 原生质体研究的趋势 低密度和单个原生质体培养；原生质体衍生系统如微小原生质体、胞质体、核质体的利用；单倍配子体如花粉原生质体培养；计算机控制系统、流式细胞光度计等技术的应用。 3.5 植物组织培养在种苗快繁上的应用植物一般通过有性繁殖或无性繁殖来繁衍后代。有性繁殖是指植物通过开花、传粉

55、、受精和产生种子的繁殖过程。无性繁殖也可以称为营养繁殖，在自然条件下植物借助于根蘖、根茎、鳞茎、块茎或珠芽等方式进行营养繁殖。人工的营养繁殖方式有扦插、嫁接、埋条和压条等。人工营养繁殖的繁殖系数较低繁殖速度较侵，常常不能满足农业和园艺快速发展的需要。植物快速繁殖的应用1.经济植物的“品种”的大量繁殖。杂合植物材料、有性繁殖后代分离、性状均一的商品苗。2.脱病毒种苗生产。长时期营养繁殖的农作物和果树，例如马铃薯、甘薯、草莓、葡萄、苹果3.加速繁殖数量有限的特殊种质材料。培育的新品种、珍稀濒危植物、自然繁殖能力低的植物4.单独繁殖雄株或雌株。快繁的速度：植物组培快速繁殖的效率是相当惊人的植物快速繁

56、殖的途径与方法技术利用芽和茎尖培养进行快速繁殖是植物快速繁殖最常用的一种方法，以植物的芽或茎尖作为外植体，通过诱导芽的连续增殖来扩大芽的数目，然后诱导芽生根形成试管苗主要技术流程为：（1）取材茎尖外植体的大小取决于实验的目的。为了得到脱病毒植株，必须选取只带12个叶原基的生长点。如果原植物不带病毒或只是为了增殖幼苗而不考虑病毒的问题，可以采用带有幼叶的茎尖进行培养。甚至可以采用带茎段的幼芽进行培养。（2）取材与消毒从植株的主茎或侧枝上切取长约1cm的顶芽。对于块根或块茎类植物，可以先将它们种植在温室中使其萌发，然后切取萌发的芽。为了避免过多的土壤杂菌的污染，还可以先用漂白粉的饱和溶液或用其他杀

57、菌剂消毒块茎或块根，然后萌发取芽。（3）茎尖的分离与接种在实体显微镜下精细地进行生长点分离。左手握住插有灭菌芽的解剖针。用专门的小刀，一枚一枚的除去幼叶和叶原基，即可看到半球形的生长点和其下部的叶原基。取带有12个叶原基的生长点(通常1.1-0.2mm长)，接种到琼脂培养基上。(4)选好培养基常用的基本培养基为MS和B5培养基，前者用于双子叶，后者用于单子叶。专门为木本植物茎尖培养设计的WPM培养基(wood Plant Medium)。Anderson培养基也是一种适合于木本植物的培养基。茎尖培养多数采用固体培养基，通常是用0.8%琼脂固化培养基。茎尖外植体容易发生褐变的情况下可以考虑采用液体培养基，以便减少培养物周围酚类化合物的浓度和及时地将培养物从褐化的培养基中转移到新鲜的培养基中去。培养基的激素：在具体培养一种植物的茎尖时，还需要在基本培养基的基础上添加激素。