研究生实验 细胞培养课件

1、组织培养和分子细胞学技术. 鄂征 主编.北京出版社, 1995年8月出版细胞培养 司徒镇强 主编. 世界图书出版公司, 1996年出版体外培养的原理和技术. 薛庆善 主编. 科学出版社, 2001年1月出版动物细胞培养基本技术指南(中译).章静波 等译. 科学出版社, 2004年10月出版.Human Cell Culture Protocols (2nd Ed). Joanna Picot. Humana Press, October 2004.Basic Cell Culture Protocols (3rd Ed). CD Helgason, CL Miller. Humana Pres

2、s, October 2004离心机橱柜实验台冰箱培养箱试剂柜实验仪器台超净工作台实验台实验台实验台实验台水池冰箱衣柜实验台显微镜递物窗缓冲间无菌操作室准备室1.细胞培养室设置下风口下风口上风口上风口无菌操作室超净工作台和CO2培养箱2.2.细胞培养的主要实验设备细胞培养的主要实验设备n超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 nCO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 n使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。保持培养箱内空气干净。定期消毒箱内蒸

3、馏水槽中预留灭菌蒸馏水，以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。解剖显微镜倒置显微镜2.2.细胞培养的主要实验设备细胞培养的主要实验设备血清（天然成分）：基础培养基（人工合成）：干粉培养基DMEM 、-MEM、RPMI1640水：高纯度的去离子水3.细胞培养的主要试剂（培养基）抗菌素：通常是青霉素和链霉素联合使用，使用浓度为100U/mln 血清质量好坏是实验成败的关键。n 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。n 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体病毒污染。n 血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟n 血清的消毒：过滤除菌n

4、血清的使用浓度为520消化液：常用0.25胰蛋白酶，使细胞脱离组织或容器壁， 用含血清培养液中止其活性4.细胞培养用器皿的清洗和消毒 一般玻璃器皿的清洗分为四个步骤：1、自来水浸泡2、洗涤剂刷洗(如有必要进行超声处理）3、泡酸（浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水）4、流水冲洗过夜，依次用蒸馏水、三蒸水漂洗，最后烘干备用 常用消毒方法：1、湿热灭菌法（高压蒸汽灭菌），15磅，1520min2、过滤除菌(如：血清的除菌） 细胞培养(cell culture)是指细胞的离体培养，是在无菌条件下，把动物或植物的细胞从机体中分离出来，置于培养皿中，并在一个合适的环境中，给以营养物质，使之继续生存和繁殖的方法。 原

5、代培养(primary culture)，或称为初代培养，就是从供体取下组织细胞后在体外进行的首次培养，中途不分割培养物。常用的原代培养方法有组织块培养法和消化培养法。 传代培养(secondly culture)，在原代培养物铺展为单细胞层后，将原代培养细胞分开接种到两个或多个新的培养瓶中继续培养增殖。v 贴附型 成纤维样细胞型 上皮样细胞型v 悬浮型培养人真皮成纤维细胞培养人口腔上皮细胞培养的骨髓瘤细胞v 细胞的贴壁生长v 接触抑制v 细胞的生长曲线细胞贴壁延展过程细胞贴壁延展过程( (模式图模式图) )细胞的接触抑制现象细胞的接触抑制现象正常培养细胞的生长曲线正常培养细胞的生长曲线退化死

6、亡平台期细胞数增大极限点，出现接触抑制细胞指数生长极限点指数生长期潜伏期细胞数量024487296120小时指数生长期是最佳实验期指数生长期是最佳实验期 ! ! 实验准备实验准备 取材、分离细胞取材、分离细胞 原代培养原代培养 维护培养维护培养着装着装操作者进入无菌室前先用肥皂洗净双手，操作者进入无菌室前先用肥皂洗净双手，然后用然后用1 1 新洁尔灭浸泡消毒新洁尔灭浸泡消毒5 5分钟分钟原代培养的一般流程原代培养的一般流程将小白鼠断颈处死，然后用将小白鼠断颈处死，然后用75%酒精或酒精或1 新洁尔灭浸泡消毒，迅速进入无菌室。新洁尔灭浸泡消毒，迅速进入无菌室。 用眼科剪和镊，将肾外膜剪破，并用眼

7、科剪和镊，将肾外膜剪破，并将其剥向肾门，去肾外膜及脂肪将其剥向肾门，去肾外膜及脂肪剪碎组织 实验准备实验准备 取材、分离细胞取材、分离细胞 原代培养原代培养 维护培养维护培养 实验准备实验准备 取材、分离细胞取材、分离细胞 原代培养原代培养 维护培养维护培养原代培养的一般流程组织块培养法原代培养方法消化法单细胞法半消化法原代培养流程图原代培养流程图：组织块法组织块法取材漂洗剪碎沉降洗涤加液涂布接种接种组织块接种组织块原代培养流程图原代培养流程图：组织块法组织块法n移入培养箱中（注移入培养箱中（注意贴有组织块的一意贴有组织块的一面朝上），面朝上），n静止静止2 23 3小时，然小时，然后将细胞培

8、养瓶轻后将细胞培养瓶轻轻翻转，继续静止轻翻转，继续静止培养。培养。原代培养流程图原代培养流程图：消化法消化法取材漂洗剪碎酶解(单细胞)离心洗涤加液计数接种原代培养流程图原代培养流程图：半消化法半消化法取材漂洗剪碎酶解(部分酶解)沉降洗涤加液接种（一）获取小鼠胚胎（一）获取小鼠胚胎1.将8周龄的昆白鼠和12周龄的昆白按1:1比例合笼。次日晨10:00前观察鼠阴道口，有乳白色或蛋黄色胶冻状物（阴道栓）即定为怀孕0.5天；2.断颈处死孕13.5天的母鼠，置于蜡盘上。75酒精消毒后，用普通剪刀和镊子剪开下腹皮肤，并用两把弯头止血钳夹住切口处的皮肤向头尾两侧牵拉即剥皮。用眼科弯镊和眼科弯剪打开腹腔，暴露

9、出子宫。用眼科弯镊夹住一侧子宫，分离子宫系膜，眼科弯剪剪断子宫角和子宫颈，将整个子宫分离下来（注意勿使子宫滑落到腹腔外，避免污染）。将子宫置于无菌滤纸上去除血迹。3.在超净台内将子宫移入预先盛有PBS的平皿中，洗涤数次。将子宫移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科弯剪沿子宫系膜打开子宫，取出带有胎膜的胎鼠，并用两把眼科镊子剔除胎膜，取出胎鼠（一般有12只）。将胎鼠移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科剪和眼科镊去除胎鼠的头、四肢和内脏，得鼠胚躯干。将鼠胚躯干移至另一盛有PBS的平皿中，用PBS洗涤两次至无肉眼可见的血色。（二）分散细胞（二）分散细胞1.将干净的鼠胚躯干移至干净的培养皿内（一般6个鼠胚躯

10、干装1皿，视大小而定），用眼科直剪充分剪碎，剪成约1mm3以下的碎块。2.用1ml的移液器每皿加入3ml的PBS，混匀，静置30sec，用移液器吸去上清液；向装有鼠胚碎块的培养皿内加入1ml0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA混合消化液，用1ml移液器轻轻吹吸30秒，可见组织块变得较为粘稠，缓慢摇动培养皿2-5min后利用倒置显微镜观察组织块变透明，并有单细胞脱离时即可进行组织块半消化的原代培养；3.留小部分鼠胚碎块于培养皿中用于组织块半消化原代培养，其余移至一尖底离心管中，置37水浴摇动消化15-20min，用于细胞计数及细胞冻存实验；4.培养皿中立即加入1ml含50%新生牛血清的PBS，吹

11、打混匀，以终止酶的作用；离心管消化结束后，静置5min，用移液器小心将上清液转移到另一离心管中，并加入1ml含50%新生牛血清的PBS中，吹打混匀，以终止酶的作用， 1000rpm离心5min，弃上清，沉淀即为分散的鼠胚成纤维细胞（三）接种培养（三）接种培养用移液器吸去培养皿中的多余液体加入适量含20%新生牛血清的DMEM培养液，将组织块转移至新的培养皿（瓶）中，并均匀分布在培养皿（瓶）的底部，做好标记（日期、名称、编号），放入37，5CO2，100相对湿度的培养箱中培养。细胞沉淀用适量含20%新生牛血清的DMEM培养液重新悬浮；利用血球计数板计数，调节细胞密度为105个/ml，计算细胞的存活

12、率（具体实验步骤见“细胞计数与活力检测”部分）；剩余细胞悬液用于细胞冻存实验（具体见“细胞的冷冻保存”部分）3. 第2-3天可以观察，组织块半消化原代培养可见组织碎块附着于培养瓶（皿）底部，周围细胞呈放射状生长，此时可见有多种细胞类型，有的是呈梭形的成纤维细胞，有的是呈圆形的上皮细胞。流程图流程图处死孕鼠，取出鼠胚去除鼠胚的头、四肢及内脏，PBS清洗剪碎鼠胚躯干，PBS清洗加入适量胰酶消化5min取少量组织于EP管中继续消化20min，获取单细胞剩余组织加入含血清的1640培养液终止消化倒置显微镜下观察将半消化的组织块接种至新的培养皿或瓶，并加入新鲜的1640培养液用移液枪反复吹打消化液，形成

13、单细胞悬液，吸取少量悬液进行细胞计数小鼠胚胎成纤维细胞原代培养v 将原代培养物分割后重新接种到两个或多个培养瓶内进行培养，这一操作称为传代培养,传代比例为1:3 至1:6，依细胞种类而异.v 细胞传代培养的意义v 传代时机的把握v 传代培养的代数限制；少数细胞可出现永生化每一代培养细胞的生长过程分期每一代培养细胞的生长过程分期退化死亡平台期细胞数增大极限点，出现接触抑制细胞指数生长极限点（MI、细胞群体倍增时间）指数生长期潜伏期细胞数量024487296120小时吸去旧液加入消化液解离细胞约2min在倒置显微镜下观察，细胞呈圆粒状细胞的传代培养细胞的传代培养：贴附型贴附型PBS洗 涤12次吹打悬浮细胞调整细胞密度 分装接种，置于CO2培养箱中继续培养在培养瓶中加入适量含血清培养液培养细胞的观察细胞的传代培养细胞的传代培养：贴附型贴附型培养细胞的观察培养液颜色、是否清亮培养液颜色、是否清亮培养细胞的状态培养细胞的状态细胞的传代培养细胞的传代培养：贴附型贴附型吸去旧液加入消化液解离细胞约5min在倒置显微镜下观察，细胞呈圆粒状PBS洗 涤12次吹打悬浮细胞调整细胞密度 分装接种，置于CO2培养箱中继续培养在培养瓶中加入适量含血清培养液培养细胞的观察胰酶消化数分钟胰酶