高效液相色谱技术在食品营养中应用

1、关于高效液相色谱技术在食品营养中的应用第一张，PPT共三十五页，创作于2022年6月 高效液相色谱技术是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱。又因分析速度快而称为高速液相色谱。高效液相色谱法定义：第二张，PPT共三十五页，创作于2022年6月 溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而

2、先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法 高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。 该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法 检等学科领域中重要的分离分析技术。原理及应用领域：第三张，PPT共三十五页，创作于2022年6月高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。 高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。

3、高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng,进样量在L数量级。 应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。 高效液相色谱法特点 “三高一广一快”分析速度快、载液流速快：较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在1530分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。 第四张，PPT共三十五页，创作于2022年6月高效液相色谱法主要类型： 液固吸附色谱1液液分配色谱2凝胶色谱4键合相色谱3第五张，PPT共三十五页，创作于2022年6月一. 液固吸附色谱 1.1分离原理 液固色谱是基于各组分吸附能力的差异进

4、行混合物分离的，其固定相是固体吸附剂。 1.2固定相吸附色谱固定相可以分为极性和非极性两大类。 1.3流动相 流动相要求： 选用的溶剂应当与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性 选用的溶剂应有高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱性能的改变。 选用的溶剂性能应与所使用的检测器相匹配，如果使用紫外吸收检测器，就不能选用在检测波长下有紫外吸收的溶剂；若使用示差折光检测器，就不能用梯度洗脱。目 录第六张，PPT共三十五页，创作于2022年6月市场价格：11000RMB/吨纯度99%以上，含氮量高达66%纯牛奶的蛋白质含量约为2.9%左右，而一般蛋白质含氮量16%。在检出三聚氰胺的产品中，石家庄

5、三鹿牌婴幼儿配方奶粉三聚氰胺含量很高，其中最高的达2563mg/kg，其他在0.09-619mg/kg之间。 第七张，PPT共三十五页，创作于2022年6月第八张，PPT共三十五页，创作于2022年6月二、保健食品中主要功效成分的检测方法及原理第九张，PPT共三十五页，创作于2022年6月第十张，PPT共三十五页，创作于2022年6月传统测蛋白质的方法凯氏定氮法是根据测定样品中的含氮量来计算其中的蛋白质的含量：含氮量6.256.25为蛋白质的含氮系数三聚氰胺事件发生的原因： (1)检测方法的局限性！ (2)利益的趋势！ (3)科学普及的不足性！第十一张，PPT共三十五页，创作于2022年6月H

6、PLC法检测功效成分的原理和方法第十二张，PPT共三十五页，创作于2022年6月高效液相色谱法的特点:热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高压高效高速高沸点第十三张，PPT共三十五页，创作于2022年6月流程及主要部件1.流程第十四张，PPT共三十五页，创作于2022年6月2.主要部件 主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性(1) 高压输液泵第十五张，PPT共三十五页，创作于2022年6月(2)梯度淋洗

7、装置外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。第十六张，PPT共三十五页，创作于2022年6月(3) 进样装置 流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：第十七张，PPT共三十五页，创作于2022年6月(4) 液相色谱检测器 a. 紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积 8L）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于

8、操作； 可用于梯度洗脱。第十八张，PPT共三十五页，创作于2022年6月b.光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。第十九张，PPT共三十五页，创作于2022年6月光电二极管阵列检测器第二十张，PPT共三十五页，创作于2022年6月c. 示差折光检测器 除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比 通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）； 灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱； 偏转式、反射式和干涉型三种；第二十一张，PPT共

9、三十五页，创作于2022年6月d. 荧光检测器 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应； 高灵敏度！高选择性！第二十二张，PPT共三十五页，创作于2022年6月 高效液相色谱法(HPLC)检测青蒿素含量一实验原理 HPLC原理：利用样品分子在固定相（填料柱）和流动相之间 相互作用力大小不同而实现分离。 高压可提高溶质组分移动速度。 按溶质组分与固定相之间的作用机理分类： 吸附分配作用：反相、正相和疏水性色谱； 电荷作用：不同类型的离子交换色谱； 空间排阻作用：凝胶过滤和凝胶渗透色谱； 生物特异性作用：亲和色谱。第二十三张，PPT共三十五页，创作于2

10、022年6月流动相 极性溶剂 酸性、低离子强度水溶液，加入一定比例的能与水互溶 的有机改性剂，如乙腈、甲醇、异丙醇等有机溶剂 ； 固定相 非极性填料 孔径30纳米以上的烷基键合硅胶填料： 短链烷基（如C4、C8和苯基）；长链烷基（如C18、C22） 烷基的链越长，固定相的疏水性越强，流动相中加入与水 互溶的有机溶剂 ，以提高洗脱速度。 反相高效液相色谱（RP-HPLC）机理： 利用溶质组分与固定相间疏水作用力不同而分离。第二十四张，PPT共三十五页，创作于2022年6月流动相 极性溶剂；固定相 非极性填料 青蒿素 碱性溶液 定量生成不饱和酮酸盐 酸化 稳定的化合物，在260nm处有吸收峰， 可

11、用高效液相色谱紫外法检测。第二十五张，PPT共三十五页，创作于2022年6月二. 操作方法溶液配制：10.2% NaOH溶液 500ml： 称取1.00g NaOH 去离子水 溶解 500ml； 20.08 mol/L醋酸溶液： 吸取冰醋酸2.30ml 去离子水 500ml 30.01mol/L Na2HPO4- NaH2PO4 pH7.0缓冲液（流动相）： 称取Na2HPO412H2O固体1.79g 蒸馏水 500ml 称取NaH2PO412H2O固体0.68g 蒸馏水 500ml 混合，调pH7.04. 1.00mg/ml 青蒿素标准液： 精确称取50.0mg青蒿素标准品 无水乙醇 50m

12、l（容量瓶）5. 样品液： 分别精确称取青蒿素粗品50、100、150mg于10ml具塞试管中 无水乙醇5ml 超声波振荡促溶 转移至10ml容量瓶中 无水乙醇 10ml第二十六张，PPT共三十五页，创作于2022年6月流动相处理:微滤器（膜孔0.22m） pH7.0磷酸缓冲液 超声波振荡器脱气15 min HPLC进样器第二十七张，PPT共三十五页，创作于2022年6月10ml具塞试管进样液制备： 样品液 (标准液)1.00ml 0.2% NaOH溶液4.00ml 45水浴 反应30min 冷水浴冷却至室温 0.08 mol/L 醋酸5.00ml 针头微滤器(0.2m)注射器吸进样液1ml第

13、二十八张，PPT共三十五页，创作于2022年6月恒流泵A恒流泵B紫外检测仪A液水相B液有机相LC-100 液相色谱仪 进样器色谱柱第二十九张，PPT共三十五页，创作于2022年6月液相色谱仪的启动顺序 ：打开排空阀，抽出流动相，排除空气打开高压泵和检测器的电源开关，检测器自动开始自检启动电脑；插入U盘，软件自动初始化；设置波长。 设置总流量、A和B两液的比例、泵压、启动泵。设置自动停止时间、各项屏显参数、文件名及保存路径。 先通入流动相冲洗管路系统，基线走直后，进样20l 第三十张，PPT共三十五页，创作于2022年6月HPLC的图形结果色谱图(Chromatogram) : 色谱柱流出物通过

14、检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为时间色谱峰时间(分)基线峰高峰宽响应值第三十一张，PPT共三十五页，创作于2022年6月液相色谱图名词术语(1)色谱图名词术语:色谱峰(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产生 的响应信号峰底(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距离切线峰宽(Peak Width):在峰两侧拐点处所作切线与 峰底相交两点之间的距离半峰宽(Peak Width at Half Height):通过峰高的 中点作平行于峰底的直线,其与峰两 侧相交两点之间的距离液相色谱图名词术语()第三十二张，PPT共三十五页，创作于2022年6月色谱图名词术语:峰面积(Peak Area): 峰与峰底之间的面积,又称响应值标准偏差()(Standard deviation): 0.607倍峰高对应峰宽的一半拖尾峰(Tailing Peak): 后沿较前沿平缓的不对称峰前伸峰(Leading Peak): 前沿较后沿平缓的不对称峰鬼峰(Ghost Peak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰液相色谱图名词术语()第三十三张，PPT共三十五页，创作于2022年6月高效液相色谱法作为一种十分有效的分析分离手段，已经越来