关节软骨急性损伤后软骨细胞凋亡的实验研究

1、枢纽软骨急性损伤后软骨细胞凋亡的实行研究宋长志，杨淮海，董启榕【摘要】目的探究枢纽软骨急性损伤后软骨细胞的凋亡特点。要领使用钻头钻孔造成兔膝枢纽软骨损伤，使用脱氧核糖核苷酸末了转酶介导的生物素脱氧尿嘧啶苷酸缺口末了标识表记标帜法、透射电镜、流式细胞仪等要领对受损软骨举行检测。效果损伤后软骨细胞出现坏死和凋亡，损伤后第4天软骨细胞凋亡率最大，凋亡细胞全层漫衍，重要漫衍在浅表层和中心层。结论枢纽软骨损伤后软骨细胞产生凋亡，4d达岑岭，以后渐渐淘汰。提示枢纽软骨急性损伤后，早期按捺软骨细胞的凋亡对防治骨枢纽炎大概有非常积极的意义。【关键词】软骨；急性损伤；凋亡ExperientalStudynhnd

2、ryteApptsisFllingAutestehndralInjuryKeyrds：artilage；autelnjury；apptsis细胞凋亡又称步伐性细胞殒命(prgraedelldeath，PD)，特点是胞体缩孝DNA片断、出现凋亡小体以及炎症反响。细胞凋亡产生在对机器和热损伤、毒素、细胞因子、病毒和细菌等因素的应答中1。Ki等2的研究表白，软骨细胞的凋亡大概会导致创伤后骨枢纽炎的产生。软骨损伤后的病理改变及其引起创伤性枢纽炎产生的机制还不明晰，本实行通过对兔膝枢纽急性损伤模子的不雅察，探究软骨急性损伤后细胞殒命的方法以及与骨枢纽炎产生之间的干系。1质料与要领1.1动物模子的制作选用

3、新西兰明白兔，重2.53.0kg。2戊巴比妥钠静脉麻醉，双侧膝枢纽局部剪毛。参照sturs等3先容的要领，用2.0直径的钻头钻孔造模。兔取仰卧位，四肢结实，膝枢纽屈曲。通例碘伏消毒，髌韧带内侧暗语，过屈膝枢纽表现股骨表里髁承重面，用直径2.0的钻头在股骨表里髁承重面钻孔，钻透全部软骨直至软骨下骨，深度23，造成膝枢纽软骨机器性损伤。钻孔后，冲洗枢纽腔后逐层缝合，清醒后分笼豢养，自由运动。1.2动物分组选用新西兰明白兔28只，体重2.53.0kg。随机选择一侧膝枢纽造模，对侧作为比较。选择术后第0、2、4、7、10、14天和4周为不雅察时间点，并据此随机分为7组，即0d(4只)、2d(4只)、4

4、d(4只)、7d(4只)、10d(4只)、14d(4只)、4周(4只)。别的再取新西兰明白兔20只，16只双侧膝枢纽钻孔造模致软骨损伤，作为损伤组，4只作为正常组(兔膝枢纽软骨细胞自己数量较少，一个损伤部位分散的细胞数不克不及满意流式细胞仪检测的要求。因此实行中双侧同样尺度造模，将每只兔两侧股骨表里髁受损区分散的软骨细胞合在一起举行流式细胞计数检测)，用于流式细胞仪检测。1.3标本的接纳1.4透射电镜不雅察软骨细胞超微布局变革1.5流式细胞仪检测软骨细胞凋亡率将分散的软骨细胞PBS洗涤、过滤、计数成大于1106/L细胞悬液，参加PI染液，避光作用20in，上机检测。FAsalibur流式细胞仪

5、(美国BETNDIKINSN)，ellquest猎取软件网罗数据，dFit2.0DNA拟合软件举行细胞周期阐发，得出效果。1.6TUNEL检测软骨细胞凋亡率1.7统计学阐发计量资料用s表现，实行组与比较组的比力接纳两样本均数差异的t查验。2效果2.1透射电镜不雅察正常的枢纽软骨细胞为圆形或椭圆形，位于软骨陷窝内，细胞外貌有突起和皱褶，细胞膜下及胞质中有较多无界膜的空泡，核呈偏爱位，核膜显着(见图1)。凋亡的软骨细胞突起消散，细胞从四周的基质中退缩，细胞核染色质浓缩、核膜消散，内质网扩张，线粒体形态无改变(见图2)。2.2流式细胞仪计数检测正常兔枢纽软骨和造模后各时间点受损区枢纽软骨经型胶原酶消

6、化后，制成细胞悬液(细胞密度1106/L)，流式细胞仪检测效果(s)。效果表现，枢纽软骨损伤后软骨细胞凋亡率增高，第4天凋亡率最高，以后呈落落趋势(见表1)。表1用流式细胞仪检测枢纽软骨细胞凋亡率略2.3TUNEL效果枢纽软骨急性损伤后立即在紧靠钻孔区四周的软骨浅表层内出现很少数量的软骨细胞凋亡；伤后2d凋亡的软骨细胞延伸到中心层，但重要范围在创伤孔四周1的软骨地区内；伤后4d凋亡率最高，凋亡的软骨细胞漫衍越发普及，呈全层漫衍，距创伤孔延伸的更远；伤后14d软骨细胞凋亡显着淘汰，仍重要漫衍在表浅层和移行层，深层较少；伤后4周在浅表层仍见到少量的软骨细胞凋亡(见图37，表2)。表2TUNEL检测

7、枢纽软骨细胞凋亡率(略)3讨论现道，软骨细胞凋亡(即步伐性细胞殒命)，与软骨图3正常的兔枢纽软骨细胞原位(TUNEL，100)损伤干系严密，而且大概与终极的创伤后骨枢纽炎的产生严密相干。Hnknen4不雅察到胫骨平台骨折患者于骨折后均匀7.6年有44的患者产生骨枢纽炎。essner报道5，使用枢纽镜不雅察单纯膝枢纽软骨损伤患者，14年后有47的患者产生骨枢纽炎。研究表白，在正常的胖大软骨细胞层中约有510的散在的凋亡软骨细胞存在6。我们在本实行中不雅察到：正常的兔软骨细胞的凋亡率，流式细胞仪检测效果为(3.881.49)，TUNEL检测效果为(4.780.45)；钻孔造模后软骨细胞凋亡在第4天

8、达最岑岭，流式细胞仪检测有(60.694.78)的软骨细胞产生凋亡，TUNEL检测有(68.215.72)的软骨细胞产生凋亡，以后渐渐淘汰。这个效果和其他研究者的效果根本同等。Te6研究创造，岂论是发育成熟的照旧未成熟的枢纽软骨，在遭受环锯损伤1周后与正常组比力，凋亡的软骨细胞数量增多。sturs等3也在急性枢纽内软骨损伤后活体内和体外造就的软骨细胞的凋亡比力研究中创造，岂论是在活体内照旧在体外造就的受损软骨，在损伤后的第4天凋亡的软骨细胞数最多。DLia7也报道，在人的枢纽软骨遭受打击负荷损伤后的第4天，分散软骨块的软骨细胞凋亡率为32；在兔的膝枢纽活体打击负荷损伤模子中，第4天测得的软骨细

9、胞凋亡率为34。hen等8在其犬的肱骨头打击负荷损伤实行中，连续打击负荷损伤2h后，损伤区软骨块体外造就48h，TUNEL法测得的软骨细胞凋亡率高达74。别的，我们在实行中还不雅察到：凋亡的软骨细胞绝大部门范围在枢纽软骨的表浅层和中心层，深层较少。Luhinetti9在他的实行中，使软骨重复负荷后检测软骨细胞的保存本领，也创造凋亡的软骨细胞重要位于表浅层和中心层，深层较少见。这种征象大概是由于枢纽软骨各层的软骨细胞存在着形态和表型的差异，导致各层的软骨细胞对机器损伤的敏感程度也不同等。这些特点大概庇护了深层的软骨细胞在枢纽软骨受到损伤后免于凋亡。自凋亡细胞研究以来，检测要领较多，但各有优缺点。

10、早期有研究者用扫描电镜，厥后被特异性较强的透射电镜所交换，因其可寻到凋亡小体，但透射电镜却无法做到定量检测。而流式细胞仪室虽可以定量，却不克不及反响凋亡细胞的漫衍特点。由于凋亡细胞内形成大量含有3羟基末了的DNA双联片断，因此借助于末了转移酶或DNA多聚酶，可对这些断段举行特异性的标识表记标帜(TUNEL法或TdT法)。这是一种检测凋亡细胞的特异性本领，可以使凋亡细胞在原位被特异性地标识表记标帜和表现出来，既能举行定量检测，又能反响凋亡细胞在空间上的漫衍特点。其缺点是不典范凋亡或稠浊有大量坏死细胞时，大概给标识表记标帜带来必然的滋扰，乃至出现假阳性，因此需结合其他一样平常形态学检测要领加以断定。本实行结合几种要领从差异角度证明了创伤后凋亡的存在，反响了创伤后软骨细胞凋亡的时间和空间特点。创伤后软骨细胞产生凋亡简直切机制尚不明晰，创伤后会导致软骨细胞密度低落、软骨基质落解、枢纽内力学情况改变、部门细胞因子的高表达，这些因素大概会引发Fas和N两种途径配合作用诱导软骨细胞凋亡。Ltz等在A患者和A实行动物模子中不雅察到软骨细胞出现大量凋亡，在枢纽软骨外貌的细胞表达Fas抗原。同时在含有凋亡细胞的枢纽软骨地区糖卵白淘汰，凋亡