毕业论文-莱茵衣藻突变体对酸性环境的耐受性评价

本科生毕业论文（设计）中文题目莱茵衣藻突变体对酸性环境的耐受性评价英文题目EvaluationofToleranceofChlamydomonasreinhardtiiMutanttoAcidicEnvironment学生姓名班级821305学号学院植物科学学院专业生物技术（植物）指导教师职称讲师目录TOC\o"1-3"\h\u中文摘要 前言第一节莱茵衣藻1.1莱茵衣藻简介莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)是一种单细胞光合真核藻类，属于绿藻门团藻目衣藻科．它与酵母有许多共同之处，如生长速度快且周期短；既可在固体平板培养基上形成单克隆，也可进行液体培养;衣藻具有核染色体、叶绿体和线粒体等3套基因组，而且这3套基因组都能进行遗传转化[1]。作为单细胞真核绿藻，莱因衣藻具有生长周期短，生长迅速快，光合效率高等特点，莱茵衣藻目前被认为是具有广泛应用前景的转基因生物反应器，至今已有多种外源基因在莱茵衣藻细胞核和叶绿体中获得成功表达。然而，迄今为止，只有酵母(Saccharomycescerevisiae)线粒体遗传系统能够进行稳定的外源基因表达，在高等动物和植物线粒体遗传转化中，只有体外离体线粒体转化的报告。莱茵衣藻是唯一可以进行细胞线粒体遗传转化的光合生物[2]。ＲandolpH-Anderson等最早报道了莱茵衣藻线粒体遗传转化，他们用野生型莱茵衣藻和野生型史密斯衣藻的完整mtDNA，成功转化了呼吸缺陷型莱茵衣藻dum-1突变株，得到能够完全修复突变株呼吸缺陷的转基因藻[3~4]。1.2真核藻类与绿藻门简介真核藻类为一群没有根、茎、叶分化，能进行光合作用的低等自养真核植物，大约出现于15亿～14亿年前。形态包括单细胞、各式群体、丝状体、叶状体、管状体等。大小从几微米到几米（海带），甚至百米（巨藻）结构简单，无明显组织分化[5~6]。绿藻门约有8600种，为藻类最大一门[7]。藻体有单细胞、群体、丝状体、叶状体、管状多核体等各种类型。细胞壁由纤维素构成。细胞内各有一定形态的叶绿素，如杯状、环状、星状、网状等；叶绿体中含有和高等植物一样的叶绿素a、b、胡萝卜素和叶黄素，故植物呈绿色[8~9]。叶绿体中有一至多个蛋白核。贮藏的养料主要是淀粉，也有脂类。生殖方式多样，无性和有性生殖都很普遍，不少种类有世代交替现象。少数种类的营养体和多数种类的孢子或配子多具2条或4条顶生等长的鞭毛，少数1、8或多条，尾鞭型。分布很广，但大多产于淡水，少数分布于潮湿土表或海产。一般可分为2纲：绿藻纲ChloropHyceae和接合藻纲ConjugatopHyceae。常见如团藻属Volvox、衣藻属Chlamydomonas、水绵属Spirogyra、小球藻属Chlorella、实球藻属Pandorina等。[10~11]1.3与莱茵衣藻相关的研究1.3.1莱茵衣藻去除污水中氮磷的研究莱茵衣藻对氮磷的去除率在初始氮磷浓度分别低于55mg·L-1和7mg·L-1时接近100%,但初始氨氮浓度进一步升高至75mg·L-1以上时会导致氨氮去除率急剧下降至50%。当氮磷比为5:1和10:1时,衣藻在3d内完全吸收水体中的氨氮,而当氮磷比为25:1时则需要6d；3种氮磷比下衣藻基本上4d内能完全去除水体中的磷。2种光照条件下(L/D为24h:0h和12h:12h)衣藻对氮磷的去除率都能达到100%,但L/D为24h:0h时的去除速率更快.衣藻去除氮磷的最适pH范围为6～7。藻细胞固定化后对氨氮的去除能力显著提高,在初始氨氮浓度为75mg·L-1时去除率由游离细胞的50%提高到100%；对磷的去除率不变,但速率有所减慢。[12]1.3.2莱茵衣藻在遗传转化方面的研究莱茵衣藻的遗传转化为获得大量突变体,并分离导致突变的基因以及研究其功能等提供了很有效的手段。电击转化法是莱茵衣藻遗传转化的有效方法之一。用BIO-RAD165-2110型电击仪对莱茵衣藻进行多次电击转化实验,结果显示,其最佳电压值为900V。用藻类生产药用蛋白是基因工程中的一个重要领域。[13]1.3.3莱茵衣藻鞭毛结构的研究使用带有巴龙霉素(Paromomycin)抗性的基因片段随机插入衣藻细胞基因组中,通过性状筛选和基因序列分析获得与CrPP2C(Chlamydomonasreinhardtiitype2CproteinpHospHatase)基因相关的鞭毛异常突变体,根据突变体基本生物学性状和生化分析对CrPP2C基因的功能进行分析。发现CrPP2C基因的破坏导致鞭毛过渡区结构缺失,影响鞭毛组装过程,不组装鞭毛或组装短鞭毛。[14]第二节水体酸化对藻类生长的影响目前，随着工业等CO2气体排放量的提高，水体酸化已成为当今世界广为关注的环境问题之一，除无机酸外，有机酸也是引起环境酸化的重要原因，其中乙酸是有机酸的主要成分，广泛存在于自然界中，其含量可高达毫摩尔水平，对藻类植物的生长具有巨大的潜在威胁。[15]第一章莱茵衣藻酸化突变体库的建立第一节相关材料1.1实验材料藻株：莱茵衣藻野生型21gr细胞株系（由清华大学生命科学学院潘俊敏教授惠赠）。1.2相关试剂CTAB、RNA降解酶（RNaseA）、氯化钠等、电泳相关试剂、实验室常用抗生素如：头孢霉素（Cefotaxime）、链霉素（Streptomycin）、氨苄青霉素（Ampicillin）、四环素（Tetracycline）、氯霉素（ChlorampHenicol）、利福平（Rifampicin）等（罗氏公司）；Marker（DL2000，1kb）等分子克隆试剂均购自生工大连公司。相应载体：pSI103质粒，含有巴龙霉素抗性，可以由KpnⅠ线性化。1.3实验仪器：移液器（Finnpipette），超净工作台 （AIRTHEC）,离心机(Thermo)，PCR扩增仪（BIOER），电泳仪（君意），pH计（仪电科学仪器）,水平电泳槽 (君意),分光光度计,海尔冰箱,相机(Canon),微波炉(格兰仕),旋涡混合器(北京鼎国),生物安全柜(AIRTECH)，-80℃低温冰箱（SANYO），恒温水浴锅（浙江宁波江南仪器厂），电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器），恒温振荡培养箱（CRYSTAL），凝胶成像仪（君意），光照培养箱（浙江宁波赛福仪器厂），压力蒸汽灭菌锅（LDZX-75KBS）,分析电子天平(EEA),往复式脱色摇床(TS.B-108),磁力加热搅拌器(江南仪器厂)。第二节实验方法2.1基因组DNA提取先将培养了7天左右，生长到对数后期的莱茵衣藻藻液在4℃下放置一天，再提取莱茵衣藻的总DNA。2.1.1莱茵衣藻DNA基因组的小量提取（CTAB法）（1）将于-4℃中放置的莱茵衣藻藻液收集在1.5ml的离心管中，然后进行离心，转速为13300rpm，离心8-10min，弃上清，得到莱茵衣藻的藻材料，可重复上述步骤以提高浓度。（2）向莱茵衣藻的藻材料中加入800μl提取缓冲液CTAB（提前65℃中预热），并加入12μl的β-巯基乙醇，用枪头吸打混匀之后转移至1.5ml离心管中，并在65℃的水浴锅中加热45min-60min，加热期间每隔8-10min轻轻摇晃离心管一次。（3）将在65℃水浴锅中的莱茵衣藻藻液取出后，吸取大约700μl的藻液于新的离心管中，然后再加入700μl的氯仿/异戊醇(体积比为24:1)的抽提液，然后将其混匀，上下颠倒20-30次，然后将其离心，设置转速为13300rpm，离心8-10min。（4）缓慢地吸取上清液550μl，将其小心地转移到新的1.5ml离心管中，并在37℃水浴锅中保温30min。（5）将水浴的EP管取出后，再加入550μl的氯仿/异戊醇抽提液，混合均匀，然后将离心管置于离心机进行离心，设置转速为13300rpm，离心8-10分钟。（6）缓慢地吸取上清液，再次将其小心的转移至新的1.5ml离心管中，加入480μl的异丙醇，室温放置10min，目的是为了让DNA充分沉淀，然后将离心管置于离心机，设置转速为13300rpm，离心8-10min。（7）弃掉上清液，加入2倍体积事先已经预冷的无水乙醇，轻轻地缓慢地上下摇动1.5ml离心管，达到洗涤莱茵衣藻DNA沉淀的目的，放置5分钟后，然后将离心管置于离心机，设置转速为13300rpm，离心8-10min。（8）弃掉上清液，加入1ml的事先预冷70%的乙醇溶液，然后将离心管置于离心机，设置转速为13300rpm，离心4-5min。（9）弃掉上清液，12500rpm，空甩1min，然后用移液器小心吸取出残余的液体，放于超净工作台里风干。（10）加入30μl含有RNase的ddH2O，溶解得到的DNA沉淀，置于-20℃保存。实验前准备：（1）恒温水浴锅事先加热至65℃；（2）无水乙醇和70%乙醇应该提前放在-20℃冰箱预冷；（3）配制含RNA酶的ddH2O（5μlRNA酶与995μl的ddH2O混匀）。2.1.2CTAB提取缓冲液的配制1、1MTris-HCl配制方法（500ml的配制量）1）用天平称取60.55gTris置于500ml烧杯中。2）往三角瓶中加入一部分去离子水（大约400ml），用磁力搅拌器充分溶解。3）加入适量的浓盐酸调节所需要的pH值。pH值浓盐酸（ml）7.4357.6308.0214）将溶液用ddH2O定容到500ml。5）121℃灭菌20min后，放置于室温保存。2、5MNaCl的配制方法（500ml的配制量）1）用天平称取146.1g的氯化钠放置于500ml的烧杯中，加入一部分的ddH2O（大约400ml）后用磁力搅拌器充分溶解。2）再次添加ddH2O将溶液定容到500ml后，适量分装在小瓶中。3）121℃灭菌20min后，4℃保存。3、0.5MEDTA的配制方法（500ml的配制量）1）称取93.05g的Na2EDTA·2H2O，放置于500ml烧杯中。2）加入大约400mL的ddH2O，用磁力搅拌器充分溶解。3）使用NaOH调节pH值到8.0（大约20gNaOH）（注意：pH值得到8.0的时候EDTA才能够完全溶解）4）加入达到H2O将溶液定容至500ml。5）适量分装，进行灭菌处理。6放置于室温中保存。二、CTAB缓冲液的配制方法CTAB缓冲液500mL终浓度Tris-HCl（1mol/LpH8.0）100mmol/L50mlNaCl（5mol/L)140ml1.4mol/LEDTA（0.5mol/LpH8.0）20ml20mmol/LCTAB10g2%(w/v)添加ddH2O将溶液定容到500ml，使用磁力搅拌器混合均匀，充分溶解。高温高压灭菌后，室温保存。2.1.3莱茵衣藻DNA的检测琼脂糖凝胶电泳1）用1×TAE溶液配制的1%的琼脂糖凝胶缓冲液30ml。2）在微波炉中加热至所有微粒融化（加热时从微波炉中拿出来摇晃观察）。3）倒入凝胶板中凝固。4)加入1μl提取的DNA，事先加入5μl的LoadingBuffer。5）使用DL2000、1kb的Marker作为对照。6）在120V的条件下跑20min。7）在EB染料中泡20min。8）在凝胶成像系统中观察并记录。2.2质粒酶切及沉淀回收2.2.1质粒的酶切酶切体系配制：组分少量酶切（10μl）大量酶切（50μl）10xBuffer1μl5μl内切酶KpnI0.3μl1μl质粒1μl5μlddH2O7.4μl39μl将配制好的酶切体系，放置在37℃中酶切，如果只是进行质粒酶切检测30min即可进行检测，如果下一步需要进行片段回收则最好酶切4h以上，达到彻底酶切。2.2.2乙醇沉淀法片段回收1) 反应结束后，取3μl样品跑电泳，检测酶切效果；若酶切效果好，将酶切完成的体系置于65℃水浴15min，使体系中限制酶失活。2) 在酶切体系中加入100μl（或大于100μL）ddH2O，将体系补至200μl；3) 加1/10体积（20μl）的NaAc（3M，pH5.2）；4) 在其中加入2.5倍体积（500μL）的无水乙醇，进行颠倒混匀20-30次；5) 冰浴15min，然后在离心机中以12500rpm的转速离心8-10min，弃上清液；6) 加入500μl70%乙醇，在离心机中以12500rpm的转速离心4-5min，弃上清液；7) 空甩（当离心机转速达到了4000rpm即可停止），吸出或吹干残余液体；8) 加入适量的ddH2O（一般10μl左右）溶解酶切线性片段即可，于-20℃保存。2.3衣藻电击转化1. 衣藻细胞预处理：将摇培好待转化衣藻细胞加入1/2000(v/v)的10%吐温Tween-20，并放置在冰上冷却，促使衣藻细胞粒化，均匀悬浮。将细胞培养物收集到离心瓶中以800g离心力，4℃离心5min，弃上清。2. 电转液细胞悬浮：加入适量的含有40mM蔗糖的TAP(TrisacetatepHospHate)液体培养基重悬，并确保细胞浓度在1-4养基重8每毫升。3. 加入外源转化载体：正常情况下，加入10ug/ml的pSI103(通过KpnI线性化载体)和200μg/ml的鲑鱼精DNA，与衣藻细胞混匀。4. 淀粉溶液预处理：称取适量的玉米淀粉cornstarch：用蒸馏水和酒精冲洗，将淀粉储藏在75%的酒精中，防治细菌污染。实验前，用TAP-蔗糖溶液（电转缓冲液）润洗，除去酒精。最终在TAP-sucrose培养基溶解，并调至其浓度为20%(w/v)。并加入终浓度为0.4%(w/v)的PEG-8000（polyethyleneglycol8000），这能促进体系的润滑和淀粉的分散。5. 电击转化：首先调试电击仪（SHIMADZU,Kyoto,Japan)参数：设置电容为10μF（无分流电阻），电压以1900-2400V/cm；吸取250μL待转化的细胞悬浮液，加入到提前预冷的一次性的4-mm的电击杯(Bio-RadLabs.,Hercules,CA)中，擦除外部水滴，放入电击槽中以进行电击。注意：从菌体收集到电转操作时间不能超过一小时。电击后，将电转混合物放置在25摄氏度水浴中孵育，至少5min（不能超过60min）。6. 淀粉镶嵌：加入预先处理的淀粉溶液，终浓度为0.2%，颠倒混匀，吸取混合物，轻轻涂布于含有巴龙霉素的TAP的0.5%琼脂的固体培养基上，最好不要用涂布器来回涂布，避免细胞损伤！将平板放置在常温光照条件下培养。2.4衣藻酸敏感筛选1）将通过电击转化的莱茵衣藻转化子放在96孔的细胞培养板上进行培养。2）每个转化子都要在不同的pH（6.0-7.0）下进行培养，便于筛选。（保证除了pH值不同，其余所有的培养条件都相同）3）培养3-5天后，观察藻液的颜色变化。4）筛选出在pH6.0生长很弱而在pH7.0生长正常的转化子进行保存。第二章莱茵衣藻对酸的耐受性评价第一节相关材料1.1实验药品及实验材料NH4Cl、MgSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、K2HPO4、KH2PO4、Tris、冰醋酸、琼脂、ddH2O。藻株：莱茵衣藻野生型21gr细胞株系（由清华大学生命科学学院潘俊敏教授惠赠）。1.2实验仪器超净工作台、摇床、高压蒸汽灭菌锅、pH计、酒精灯、冰箱等第二节实验方法2.1TAP培养基的配制先配制以下三种母液，包括：TAPsalts、pHospHatesolution、Hutner’straceelements。1、TAPsalts组分用量（g）NH4Cl15.0MgSO4·7H2O4.0MgSO4·7H2O2.0加蒸馏水至1L。2、pHospHatesolution组分用量（g）K2HPO428.8KH2PO414.4加蒸馏水至100ml。Hutner’straceelements组分用量（g）EDTA，disodiumsalt50.0H3BO311.4ZnSO4·H2O22.0MnCl2.4H2O5.06CoCl2.6H2O1.61CuSO4.6H2O1.57(NH4)6Mo7O2.4H2O1.10FeSO4.7H2O4.99再将下面的溶液混合，配制成TAP培养基：2.42gTris25mlsolution#1(salts)0.375mlsolution#2(pHospHate)1.0mlsolution#3(traceelements)1.0mlglacialaceticacid用冰醋酸调节培养基的pH值，在固体培养基中每升需加入15gAgar，用高压灭菌锅121℃灭菌20min。液体培养基采用抽滤灭菌的方式进行灭菌。2.2莱茵衣藻酸敏感突变体的活化将配制好的50mlTAP固体培养基分装在1.5ml的EP管内，将贮存在4度冰箱内的莱茵衣藻酸敏感突变体取出，选取优秀突变体菌株及野生型21gr接种在1.5mlEP管中，并将活化后的突变体及野生型菌株置于光照条件下生长数日。2.3莱茵衣藻酸敏感性筛选2.3.1衣藻培养用冰醋酸将TAP液体培养基的pH值调到6.0和7.0，将衣藻突变体菌株接种到96孔板内，并且提供一定的光照强度，在室温条件下进行培养。2.3.2衣藻的运动情况观察在超净工作台内，将血球计数板用酒精冲洗干净，再用擦镜纸擦拭，放在超净台内吹干后，将盖玻片盖在血球计数板上，之后再用移液器吸取少量藻液，在盖玻片的一侧沿着边缘缓慢加入到血球计数板内，最后利用显微镜对该水封片进行观察，记录并且对比酸性和正常pH条件下衣藻的运动情况。2.4观察不同pH条件下，莱茵衣藻的生长情况配制pH梯度为6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0的TAP固体培养基，利用2.2中活化后的菌株，在超净台内，将其转接到pH6.0~7.0的固体培养基内，用封口膜封好后，置于一定的光照条件下，室温内培养。实验结果与分析第一节衣藻酸敏感突变体库的建立电击转化时用KpnⅠ对pSI103进行线性化，其中加入浓度为108/ml左右的莱茵衣藻藻液和10mg/L的巴龙霉素，以不加巴龙霉素作为正对照，以不加外源DNA为负对照，培养7天后发现,第一种培养皿上长出了许多的转化子，没加巴龙霉素的平板上长出了许多衣藻，使平板整体呈绿色，没加外源DNA的平板什么都没有长出来，呈白色。（图1）21gr+pSI10321gr(-CK)TAP培养基，10ug/ml巴龙霉素图1.莱茵衣藻的电击转化第二节衣藻运动情况观察结果通过观察对比在pH6.0和pH7.0两个条件下衣藻的生长情况，可知在pH6.0的液体培养基中，肉眼可见生长出来的衣藻较pH7.0条件下明显减少；在显微镜下观察发现同一种莱茵衣藻突变体在pH6.0条件下培养后，与在pH7.0培养基中的相比，运动变得缓慢，而在同一个培养条件下的衣藻其野生型运动都要快于突变体。第三节不同pH条件下衣藻生长情况的观察结果通过对莱茵衣藻的表型观察记录，做出统计表（表1），对实验结果分析发现，不同的突变体在不同pH条件下其生长情况不同，即对酸的耐受性是不同的。这些突变体中大多数都是在pH6.0时表现出明显敏感，与同样环境中野生型相比差别很大；在pH6.2~7.0这个梯度内，突变体菌株的长势逐渐递增，不如pH6.0时敏感，与同样条件下的野生型生长状况相比，相差不大。而野生型衣藻在pH6.0~7.0之间均表现出正常生长，无明显差别。表1莱茵衣藻突变体及野生型在不同pH条件下生长情况统计pH6.0pH6.2pH6.4pH6.6pH6.8pH7.021gr++++++++++++++++++284+++++++++++++++7++++++++++++++++88--+++++++++++++++3-41++++++++++++++++12-44+++++++++++++++++78--+++++++++++++++181--+++++++++++++++5--++++++++++++++90新+++++++++++++++135--+++++++++++++++注：以野生型21gr的生长情况为标准记为+++，长势与野生型相似记为+++，与野生型相比相差不多记为++，有明显差别但仍然生长记为+，不生长记为--。第四章实验结论与讨论通过本实验研究，电击转化获得了5000个转化子，再筛选出部分优秀的莱茵衣藻酸敏感菌株，进行实验。通过对比莱茵衣藻菌株在酸性和中性培养条件下的生长情况得到的结论是，在酸性培养基中莱茵衣藻突变体生长缓慢，甚至出现不生长的状况，而衣藻的野生型菌株在相同条件下生长及运动均正常。在设置培养基的pH梯度后，我们发现在pH6.0时，大多数的突变体菌株表现出明显的敏感性，与同样环境中野生型的生长情况相比差别很大；在pH6.2~7.0区间内，衣藻突变体菌株生长速率高于其在pH6.0时的生长速率，与相同pH值下的野生型菌株的生长速率相差不多。因此我们通过此次实验获得了一些对酸敏感的莱茵衣藻突变体菌株，为进一步研究水体酸化对水生植物生长影响方面提供了很大帮助。致谢随着毕业论文的完成，转眼间四年紧张而又充实的大学生生活即将画上句号。在这四年的学习期间，我得到了很多老师和同学的关怀和帮助。在学位论文即将完成之际，我要向所有期间给予我支持、帮助和鼓励的人表示我最诚挚的谢意。

首先，我要感谢我的指导老师李桂华老师对我的指导。从论文的选题、构思、撰写到最终的定稿，李老师都给了我悉心的指导和热情的帮助，使我的毕业论文能够顺利的完成。李老师对工作的认真负责、对学术的钻研精神和严谨的学风，都是值得我终生学习的。

其次，我要感谢植物科学学院610实验室的师兄师姐和同学们，和他们一起度过的几个月的实验室时光很有意义，在这里他们让我学到了许多实验室的知识，掌握了扎实的专业技能。

最后，感谢所有陪我一路走来的同学和朋友，有了他们的支持和陪伴，我才能在这里安心学习，顺利完成学业。

毕业在即，在今后的工作和生活中，我会铭记师长们的教诲，继续不懈努力和追求，来报答所有支持和帮助过我的人!参考文献[1]胡章立；李建成；程雪薇；莱茵衣藻线粒体遗传系统及其外源基因表达.深圳大学学报(理工版),2013年06期.[2]周峰；刘训财；厉以强；季荣；李梅；生态与农村环境学报,2013年01期.[3]李兴涵；莱茵衣藻油脂代谢调控相关基因的功能研究.中国优秀硕士学位论文全文数据库,2014年.[4]杨大伟；范晓蕾；KindTobias；FiehnOliver；郭荣波；基于芯片的直接进样质谱法和气相色谱-质谱测定莱茵衣藻中的极性脂类.化学学报,2013年04期.[5]赵小红；Na2S处理提高莱茵衣藻光合产氢的研究.中国优秀硕士学位论文全文数据库,2014年.[6]左照江;乙酸及和胁迫对莱茵衣藻的